臨床検体からのがん関連物質の自動分離・回収

要約

本稿では、全血から無細胞DNAや循環腫瘍細胞などの物質を簡便かつ効率的に分離・回収するための自動化装置の適用について述べる。

要約

最近、リキッドバイオプシーは癌を含む様々な疾患の診断に使用されている。体液には、正常組織に由来する細胞、タンパク質、核酸など、多くの物質が含まれていますが、これらの物質の中には患部に由来するものもあります。体液中のこれらの物質の調査と分析は、さまざまな病気の診断において極めて重要な役割を果たします。したがって、必要な物質を正確に分離することが重要であり、この目的に使用するためにいくつかの技術が開発されています。

私たちは、CD-PRIMEという名前のディスク上のラボタイプのデバイスとプラットフォームを開発しました。この装置は自動化されており、サンプルの汚染とサンプルの安定性に良好な結果が得られます。また、取得収率が良く、操作時間が短く、再現性が高いという利点があります。さらに、装着する椎間板の種類に応じて、無細胞DNAを含む血漿、循環腫瘍細胞、末梢血単核球、またはバフィーコートを分離することができます。したがって、体液中に存在する様々な材料の取得は、オミクスの研究を含む様々な下流用途のために行うことができる。

概要

がんを含む様々な疾患を早期かつ正確に発見することは、治療戦略を確立する上で最も重要な要素^です1,2,3,4。特に、癌の早期発見は、患者の生存率の増加と密接に関連している⁵、^6、7、8。近年、がんの早期発見のためにリキッドバイオプシーが脚光を浴びています。固形腫瘍は血管新生を受け、さまざまな物質を血中に放出します。特に、循環DNA(ctDNA)、循環RNA(ctRNA)、タンパク質、エクソソームなどの小胞、および循環腫瘍細胞(CTC)が癌患者の血液中に見出されている^2,9。これらの物質の量には違いがありますが、初期段階だけでなく後期段階でも一貫して観察されます^6,10。ただし、これらの個人差は非常に高いです。例えば、ctDNAを含む無細胞DNA(cfDNA)の量は1,000ng未満であり、CTCの数は^癌患者11,12,13の全血10mLで¹⁰⁰未満である。多くの研究は、より少ない量で存在するこれらの物質(すなわち、cfDNA、ctDNA、およびCTC)を使用して癌を特徴付けています。正確な結果を得るためには、少量の物質を高純度で正確に分離することが重要です^13,14。従来の遠心分離法が一般的であるが、取り扱いが難しく、ユーザーの熟練度によっては純度が低い。CTCの発見以来、遠心分離や密度グレード分離、イムノビーズ、マイクロ流体法など、いくつかの分離技術が開発されてきました。CTCの発見以来、いくつかの封じ込め技術が開発されてきました。しかしながら、これらの技術は、それらを単離するために使用される様々なチップおよび膜から細胞を単離する必要がある場合にしばしば制限される¹⁵。また、タグ付け方法はFACSなどの設備を必要とし、タグ付け汚染による下流工程に限界があります。

近年、リキッドバイオプシーの利用が増加しており、がんの早期発見に向けて様々な研究が行われています。この方法は単純ですが、ダウンストリーム分析にはまだ困難があり、さまざまな研究がこれらの困難を克服しようとしています^16,17。さらに、病院を含む多くの施設では、使いやすく、自動化された再現性のある高純度の方法が必要です。ここでは、リキッドバイオプシー後の血液サンプルからの物質の自動分離のためのラボオンディスクを開発しました。これらのデバイスは、遠心分離、マイクロフルイディクス、およびポアサイズの細胞捕捉の原理に基づいています。ディスクには3つのタイプがあります:LBx-1は血漿とバフィーコートを獲得でき、LBx-2は10mL未満の容量の全血から血漿とPBMCを取得できます。FAST-autoは、ディスクから取り外し可能なメンブレンを使用してCTCを取得することもできます。1回の実行で最大4枚のディスクを使用できます。とりわけ、この装置及び方法の利点は、少量の血液を用いて、同一の試料から様々な癌由来物質を得ることができることである。これは、患者の血液を一度だけ採取する必要があることを意味します。また、採血期間の違いによる誤差を排除できるという利点もある。このプラットフォームは使いやすく、リキッドバイオプシーやダウンストリームアプリケーションに正確な結果を提供します。このプロトコルでは、デバイスとカートリッジの使用法が導入されています。

プロトコル

すべての全血サンプルは肺がん患者から得られた。クライノミクスでの研究・解析はがんゲノミクス研究所が行い、政府によるIRB研究承認は峨山医療センター治験審査委員会(IRB NO. 2021-0802)が主導し、IRB番号がクライノミクスで研究登録されています。

1. サンプル調製

1. 9 mLの全血をEDTAまたはcfDNAで安定した採血管に採取します。
2. チューブを約10回上下にひっくり返してよく混ぜます。
3. サンプルは室温(RT、短期保存の場合)または4°C(長期保存の場合)で保存してください。凍結解凍しないでください。

2.デバイスの準備

1. 電源スイッチを押して機器の電源を入れます。
   注意: タッチパッドにロード画面が表示され、機器が初期化されます。初期化中は、機器から手を離してください。機器の初期化が完了すると、カートリッジ選択画面が表示されます。
2. 使用するサンプルモードを選択します。矢印を押してサンプル数を変更します。

3.デバイスの操作とサンプル収集

1. LBx-1カートリッジの装填
   1. 機器のタッチスクリーンパネルでカートリッジタイプを選択します。矢印ボタンを押してサンプル数を変更します。
   2. 機器のドアを開き、使用するすべてのカートリッジをカートリッジホルダーの番号順に挿入します。カートリッジとカートリッジホルダーを正しく挿入してください。カートリッジが正しく挿入されていないと、機器にかなりの損傷を与える可能性があります。
   3. 合計 4 つのカートリッジの場合は、カートリッジホルダーの空きスペースにダミーカートリッジを置きます。
   4. サポートホイールを使用してカートリッジを取り付け、ロックナットを締めて固定します。
   5. ドアを閉め、タッチパッド画面の RUN ボタンを押します。機器はカートリッジのバルブを閉じますが、これには約30秒かかります。
   6. メッセージに従ってドアを開き、サポートホイールを取り外し、バルブクローズカートリッジをカートリッジホルダーから取り外します。
   7. カートリッジをテーブルに置き、全血サンプルを注入する準備をします。血清学的ピペットを使用して、最大10 mLの全血サンプルをピペットでピペットします。
      注意: 血液を取り扱う危険性があります。血液サンプルと試薬を取り扱う手順全体を通して、白衣と実験用手袋を着用することが重要です。提供されたMSDSは、実験室の労働者によって徹底的に研究されるべきです。
   8. ピペットチップをカートリッジのサンプル入口の奥深くに挿入し、全血サンプルをゆっくりと注入します。
      注 9 mL以上の全血サンプルを使用する場合、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)の添加は必要ありません。9 mL未満の全血サンプルを使用する場合は、PBSを追加して総容量を9 mLにします。例えば、7.2mLの全血を使用する場合は、サンプル注入口に1.8mLのPBSを追加してください。血清学的ピペットまたはピペットチップは、全血およびPBSの注射に使用することができる。8mL未満の全血サンプルを使用する場合、1mLのPBSを添加してもバフィーコートが回復しない場合があります。gDNA調製には、このステップの前に分離した200 μLの全血を使用します。
   9. 使用するカートリッジをカートリッジホルダーの番号順に挿入します。サポートホイールを使用してカートリッジを取り付け、ロックナットを締めて固定します。ドアを閉め、 OK ボタンを押します。
      注:血漿とバフィーコートは全血から自動的に分離され、約30分かかります。
      注意 操作中の危険。高速回転操作中にドアを開けたり、機器に触れたりすると、重傷を負う可能性があります。ローターの非対称荷重による怪我のリスクもあります。アシストセルエンリッチメントまたはエキスパートモードで機器を起動したときに異常な振動やノイズが発生した場合、カートリッジの配置が非対称である可能性があります。すぐに電源キーを押して停止し、カートリッジを正しく取り付けます。
   10. プラズマとバフィーコートの分離が完了すると表示されるアラーム音を伴う画面上のメッセージを探します。
   11. ドアを開けるか、 STOP ボタンを押してアラームを停止します。ドアを開け、カートリッジを取り出し、テーブルに置きます。
   12. 1 mL ピペットチップを使用して、血漿出口から 3 mL の血漿を回収します。1 mL ピペットチップを使用して、バフィーコート出口から 3 mL のバフィーコートを回収します。
2. LBx-2カートリッジのロード
   1. 機器のタッチスクリーンパネルでカートリッジ名を選択します。矢印ボタンを押してサンプル数を変更します。
   2. ドアを開けて、使用するカートリッジをカートリッジホルダーの番号順に挿入します。
   3. 合計 4 つのカートリッジの場合は、カートリッジホルダーの空きスペースにダミーカートリッジを置きます。
   4. サポートホイールを使用してカートリッジを取り付け、ロックナットを締めて固定します。カートリッジをカートリッジホルダーに正しく挿入してください。カートリッジが正しく挿入されていないと、機器にかなりの損傷を与える可能性があります。
   5. ドアを閉め、タッチパッド画面の RUN ボタンを押します。機器はカートリッジのバルブを閉じますが、これには約30秒かかります。
   6. メッセージに従ってドアを開き、サポートホイールを取り外し、バルブクローズカートリッジをカートリッジホルダーから取り外してテーブルに置きます。
   7. カートリッジをテーブルに置き、密度勾配溶液と全血サンプルを注入する準備をします。全血試料の量に応じて注入する密度勾配溶液とPBSの容量を確認する(補足表1)。
   8. 密度勾配溶液を血清学的ピペットを用いてピペットする。ピペットチップをカートリッジの入口の奥深くに挿入し、密度勾配溶液をゆっくりと注入します。
   9. 密度勾配溶液を注入した後、血清学的ピペットを用いて全血試料をピペットする。ピペットチップをカートリッジのサンプル入口の奥深くに挿入し、全血サンプルをゆっくりと注入します。
      注:全血サンプルを9mL未満使用する場合は、この表を参照してPBSを追加してください(補足表1)。
   10. 使用するカートリッジをカートリッジホルダーの番号に従って順番に挿入します。サポートホイールを使用してカートリッジを取り付け、ロックナットを締めて固定します。ドアを閉め、 OK ボタンを押します。
   11. 血漿とPBMCは全血から自動的に分離され、約30分かかります。プラズマとPBMCの分離が完了すると、アラーム音とともに表示されるメッセージを探します。
   12. ドアを開けるか、 STOP ボタンを押してアラームを停止します。ドアを開け、カートリッジを取り出し、テーブルに置きます。
   13. 1 mL ピペットチップを使用して、血漿出口から 3 mL の血漿を回収します。1 mL ピペットチップを使用して、PBMC 出口から 3 mL の PBMC を回収します。
3. FAST-AUTO カートリッジのロード
   1. 機器のタッチスクリーンパネルでカートリッジを選択します。矢印ボタンを押してサンプル数を変更します。
   2. ドアを開けて、使用するカートリッジをカートリッジホルダーの番号順に挿入します。合計 4 つのカートリッジの場合は、カートリッジホルダーの空きスペースにダミーカートリッジを置きます。
   3. サポートホイールを使用してカートリッジを取り付け、ロックナットを締めて固定します。
   4. ドアを閉め、タッチパッド画面の RUN ボタンを押します。機器はカートリッジのバルブを閉じますが、これには約30秒かかります。
   5. メッセージに従ってドアを開き、サポートホイールを取り外し、バルブクローズカートリッジをカートリッジホルダーから取り外します。
   6. カートリッジをテーブルに置き、PBS溶液と全血サンプルを注入する準備をします。6mLのPBS溶液を血清学的ピペットを用いてピペットする。ピペットチップをカートリッジのPBSインレットの奥深くに挿入し、6 mLのPBS溶液をゆっくりと注入します。
   7. PBS溶液を注入した後、LBx−2から得られた全血またはPBMCサンプル3mLを血清学的ピペットを用いてピペットし、これを予め1%BSAですすいで残渣の付着を防止した。ピペットチップをカートリッジのサンプル入口の奥深くに挿入し、全血サンプルをゆっくりと注入します。
   8. 使用するカートリッジをカートリッジホルダーの番号順に挿入します。サポートホイールを使用してカートリッジを取り付け、ロックナットを締めて固定します。ドアを閉め、 OK ボタンを押します。
   9. CTCは全血から自動的に濃縮され、約15分かかります。CTC のエンリッチメントが完了したときにアラーム音とともに表示されるメッセージを探します。ドアを開けるか、 STOP ボタンを押してアラームを停止します。
   10. ドアを開け、カートリッジを取り出し、テーブルに置きます。バックプレートリムーバー(BPR)をカートリッジ前面の4つの穴に挿入します。両手の親指で紺色の翼を押し、カチッと音がするまで水色の体を押します。
   11. カートリッジ本体を持ち上げて慎重に取り外します。ピンセットを使用して、フィルター膜の端を非常に静かに持ち上げます。必ずフィルターメンブレンの外縁(幅1mmのエッジ部分)を使用して、フィルターメンブレンをつまんで保持してください。
   12. フィルターメンブレン(濃縮CTCが存在する)を核酸調製用の1.5 mLチューブに慎重に入れます。必要に応じて、1 mLピペットチップを使用してろ過した血液を血液出口に回収します。

4. システムのメンテナンス

1. 機器の洗浄と消毒の準備
   1. エタノールと乾燥ティッシュを使用して、機器とアクセサリのすべてのアクセス可能な表面を週に一度清掃し、汚染された場合はすぐに清掃します。
   2. アルコール(エタノールとイソプロパノール)またはアルコールベースの消毒剤を使用して、ボウルとローターシャフトを定期的に清掃してください。
2. 機器の洗浄と消毒
   メモ: マシンの一般的なトラブルシューティングおよびその他の注意事項については、 補足表 2 を参照してください。
   1. 主電源スイッチを使用して機器の電源を切ります。電源プラグを電源装置から外します。
   2. ドアを開け、広告を使用して、電源ケーブルを含む機器のアクセス可能なすべての表面を清掃および消毒しますamp 布と推奨される洗浄剤。
   3. ローターシャフトに損傷がないか確認してください。機器に腐食や損傷がないか調べます。
   4. 機器は、内側と外側が完全に乾いている場合にのみ、電源に接続してください。
3. 主電源プラグを外し、ヒューズホルダーを取り外します。ヒューズホルダーは電源ソケットの上にあります。使用済みのヒューズをコンテナの予備のヒューズと交換します。

結果

この技術の目標は、全血から癌関連物質を簡単かつ自動的に分離することです。特に、誰でもこの手法をすべての適切な研究および分析分野で使用できます。単一の血液サンプル中の複数の物質の同時かつ再現性のある分離は、リキッドバイオプシーにおいて重要です。LBx-1およびLBx-2ディスクは、全血から血漿およびバフィーコートまたはPBMCを分離するために使用されます。

ディスカッション

cfDNAとCTCの量と濃度は、がんの個人、病期、および種類によって異なります。また、患者²、⁴、^5、10、20の状態にも依存します。特にがんの早期・前がん期では、がん関連物質の濃度が非常に低いため、検出できない可能性が高いです。それにもかかわらず、早期発見は?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% BSA (Bovine Serum Albumin)	Sigma-Aldrich	A3059
1.5 mL Microcentrifuge Tube	Axygen	MCT-150-C-S
15 mL Conical Tube	SPL	50015
4150 TapeStation System	Agilent	G2992AA	Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633)
Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit	Apostle	A17622-250	5 mL X 50 preps version
BD Vacutainer blood collection tubes	BD	367525	EDTA Blood Collection Tube (10 mL)
BioViewCCBS	Clinomics		BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment
CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610	Invitrogen	MHCD4522
FAST Auto cartridge	Clinomics	CLX-M3001
LBx-1 cartridge	Clinomics	CLX-M4101
LBx-2 cartridge	Clinomics	CLX-M4201
OPR-2000 instrument	Clinomics	CLX-I2001
Cover Glass	Marienfeld Superior	HSU-0101040
DynaMag 2 Magnet Stand	Thermo Fisher Scientific	12321D
Ficoll Paque Solution	GE healthcare	17-1440-03	density gradient solution
Filter Tip, 10 µL	Axygen	AX-TF-10	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
Filter Tip, 200 µL	Axygen	AX-TF-200	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
Filter Tip, 100 µL	Axygen	AX-TF-100	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
Filter Tip, 1000 µL	Axygen	AX-TF-1000	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody	BioLegend	324204
FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin	BD Biosciences	347653
Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O)	Sigma Aldrich	433284
Kimtech Science Wipers	Yuhan-Kimberly	41117
Latex glove	Microflex	63-754
Magnetic Bead Separation Rack	V&P Scientific	VP 772F2M-2
Manual Pipetting  (0.5-10 µL)	Eppendorf	3120000020
Manual Pipetting  (2-20 µL)	Eppendorf	3120000038
Manual Pipetting  (10-100 µL)	Eppendorf	3120000046
Manual Pipetting  (20-200 µL)	Eppendorf	3120000054
Manual Pipetting  (100-1000 µL)	Eppendorf	3120000062
Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield	abcam	ab104139
Normal Human IgG Control	R&D Systems	1-001-A
OLYMPUS BX-UCB	Olympus	9217316
Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488	Invitrogen	53-9003-82
PBS (Phosphate Buffered Saline Solution)	Corning	21-040CVC
Portable Pipet Aid	Drummond	4-000-201
Slide Glass	Marienfeld Superior	HSU-1000612
StainTray Staining box	Simport	M920
Sterile Serological Pipette (10 mL)	SPL	91010
Triton X-100 solution	Sigma Aldrich	93443
TWEEN 20	Sigma Aldrich	P7949
Whole Blood			Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary.
X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator)	Excelitas	010-00157