Automatische Trennung und Sammlung von krebsrelevanten Substanzen aus klinischen Proben

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt die Anwendung automatisierter Geräte zur einfachen und effizienten Trennung und Sammlung von Substanzen, wie z. B. zellfreier DNA und zirkulierenden Tumorzellen, aus Vollblut.

Zusammenfassung

In jüngster Zeit wurden Flüssigbiopsien verwendet, um verschiedene Krankheiten, einschließlich Krebs, zu diagnostizieren. Körperflüssigkeiten enthalten viele Substanzen, einschließlich Zellen, Proteine und Nukleinsäuren, die aus normalem Gewebe stammen, aber einige dieser Substanzen stammen auch aus dem erkrankten Bereich. Die Untersuchung und Analyse dieser Substanzen in den Körperflüssigkeiten spielt eine zentrale Rolle bei der Diagnose verschiedener Erkrankungen. Daher ist es wichtig, die erforderlichen Substanzen genau zu trennen, und es werden mehrere Techniken entwickelt, die zu diesem Zweck verwendet werden können.

Wir haben ein Lab-on-a-Disc-Gerät und eine Plattform namens CD-PRIME entwickelt. Dieses Gerät ist automatisiert und hat gute Ergebnisse für die Probenkontamination und Probenstabilität. Darüber hinaus hat es die Vorteile einer guten Erfassungsausbeute, einer kurzen Betriebszeit und einer hohen Reproduzierbarkeit. Darüber hinaus können je nach Art der zu montierenden Scheibe Plasma mit zellfreier DNA, zirkulierenden Tumorzellen, peripheren mononukleären Blutzellen oder Buffy-Coats getrennt werden. So kann die Erfassung einer Vielzahl von Materialien, die in den Körperflüssigkeiten vorhanden sind, für eine Vielzahl von nachgelagerten Anwendungen, einschließlich der Untersuchung von Omics, erfolgen.

Einleitung

Die frühzeitige und genaue Erkennung verschiedener Krankheiten, einschließlich Krebs, ist der wichtigste Faktor bei der Festlegung einer Behandlungsstrategie 1,2,3,4. Insbesondere die Früherkennung von Krebs steht in engem Zusammenhang mit erhöhten Überlebenschancen für den Patienten 5,6,7,8. In jüngster Zeit stehen Flüssigbiopsien für die Früherkennung von Krebs im Rampenlicht. Solide Tumoren durchlaufen eine Angi....

Protokoll

Alle Vollblutproben wurden von Lungenkrebspatienten gewonnen. Die Forschung und Analyse bei Clinomics wird vom Cancer Genomics Research Institute durchgeführt, und die IRB-Forschungsgenehmigung durch die Regierung wird vom Asan Medical Center Institutional Review Committee (IRB Nr. 2021-0802) geleitet, wobei die IRB-Nummer für die Forschung bei Clinomics registriert ist.

1. Probenvorbereitung

1. Sammeln Sie 9 ml Vollblut in einem EDTA- oder cfDNA-stabilen Blutentnahmeröhrchen.
2. Mischen Sie gut, indem Sie das Röhrchen ca. 10 Mal auf und ab drehen.
3. Lagern Sie die Proben bei Raumtemperatur (RT; für Ku....

Ergebnisse

Ziel dieser Technik ist es, krebsassoziierte Substanzen einfach und automatisch aus dem Vollblut zu isolieren. Insbesondere kann jeder diese Technik in allen geeigneten Forschungs- und Analysebereichen einsetzen. Die gleichzeitige und reproduzierbare Trennung mehrerer Substanzen in einer einzigen Blutprobe ist bei Flüssigbiopsien von Bedeutung. Die LBx-1- und LBx-2-Scheiben werden zur Isolierung von Plasma und Buffy Coat oder PBMC aus Vollblut verwendet. Abbildung 1 zeigt die Materialien, d.......

Diskussion

Die Menge und Konzentration von cfDNA und CTC hängt vom Individuum, dem Stadium und der Art des Krebses ab. Es hängt auch vom Zustand des Patienten^ab 2,4,5,10,20. Insbesondere in den frühen oder präkanzerösen Stadien von Krebs sind die Konzentrationen krebsrelevanter Substanzen sehr gering, so dass eine hohe Wahrscheinlichkeit besteht, dass sie nicht nach.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% BSA (Bovine Serum Albumin)	Sigma-Aldrich	A3059
1.5 mL Microcentrifuge Tube	Axygen	MCT-150-C-S
15 mL Conical Tube	SPL	50015
4150 TapeStation System	Agilent	G2992AA	Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633)
Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit	Apostle	A17622-250	5 mL X 50 preps version
BD Vacutainer blood collection tubes	BD	367525	EDTA Blood Collection Tube (10 mL)
BioViewCCBS	Clinomics		BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment
CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610	Invitrogen	MHCD4522
FAST Auto cartridge	Clinomics	CLX-M3001
LBx-1 cartridge	Clinomics	CLX-M4101
LBx-2 cartridge	Clinomics	CLX-M4201
OPR-2000 instrument	Clinomics	CLX-I2001
Cover Glass	Marienfeld Superior	HSU-0101040
DynaMag 2 Magnet Stand	Thermo Fisher Scientific	12321D
Ficoll Paque Solution	GE healthcare	17-1440-03	density gradient solution
Filter Tip, 10 µL	Axygen	AX-TF-10	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
Filter Tip, 200 µL	Axygen	AX-TF-200	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
Filter Tip, 100 µL	Axygen	AX-TF-100	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
Filter Tip, 1000 µL	Axygen	AX-TF-1000	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody	BioLegend	324204
FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin	BD Biosciences	347653
Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O)	Sigma Aldrich	433284
Kimtech Science Wipers	Yuhan-Kimberly	41117
Latex glove	Microflex	63-754
Magnetic Bead Separation Rack	V&P Scientific	VP 772F2M-2
Manual Pipetting  (0.5-10 µL)	Eppendorf	3120000020
Manual Pipetting  (2-20 µL)	Eppendorf	3120000038
Manual Pipetting  (10-100 µL)	Eppendorf	3120000046
Manual Pipetting  (20-200 µL)	Eppendorf	3120000054
Manual Pipetting  (100-1000 µL)	Eppendorf	3120000062
Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield	abcam	ab104139
Normal Human IgG Control	R&D Systems	1-001-A
OLYMPUS BX-UCB	Olympus	9217316
Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488	Invitrogen	53-9003-82
PBS (Phosphate Buffered Saline Solution)	Corning	21-040CVC
Portable Pipet Aid	Drummond	4-000-201
Slide Glass	Marienfeld Superior	HSU-1000612
StainTray Staining box	Simport	M920
Sterile Serological Pipette (10 mL)	SPL	91010
Triton X-100 solution	Sigma Aldrich	93443
TWEEN 20	Sigma Aldrich	P7949
Whole Blood			Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary.
X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator)	Excelitas	010-00157