Separação Automática e Coleta de Substâncias Relacionadas ao Câncer de Amostras Clínicas

Resumo

Este artigo descreve a aplicação de equipamentos automatizados para separar e coletar substâncias de forma fácil e eficiente, como DNA livre de células e células tumorais circulantes, do sangue total.

Resumo

Recentemente, biópsias líquidas têm sido usadas para diagnosticar várias doenças, incluindo câncer. Os fluidos corporais contêm muitas substâncias, incluindo células, proteínas e ácidos nucleicos originários de tecidos normais, mas algumas dessas substâncias também se originam da área doente. A investigação e análise dessas substâncias nos fluidos corporais desempenham um papel fundamental no diagnóstico de várias doenças. Portanto, é importante separar com precisão as substâncias necessárias, e várias técnicas são desenvolvidas para serem usadas para esse fim.

Desenvolvemos um tipo de dispositivo e plataforma lab-on-a-disc chamado CD-PRIME. Este dispositivo é automatizado e tem bons resultados para contaminação da amostra e estabilidade da amostra. Além disso, tem vantagens de um bom rendimento de aquisição, um curto tempo de operação e alta reprodutibilidade. Além disso, dependendo do tipo de disco a ser montado, plasma contendo DNA livre de células, células tumorais circulantes, células mononucleares do sangue periférico ou casacos bufantes podem ser separados. Assim, a aquisição de uma variedade de materiais presentes nos fluidos corporais pode ser feita para uma variedade de aplicações a jusante, incluindo o estudo da ômica.

Introdução

A detecção precoce e precisa de várias doenças, incluindo o câncer, é o fator mais importante para o estabelecimento de uma estratégia de tratamento ^1,2,3,4. Em particular, a detecção precoce do câncer está intimamente relacionada ao aumento das chances de sobrevida do paciente 5,6,7,8. Recentemente, biópsias líquidas têm estado no centro das atenções para a detecção precoce do câncer. Os tumores sólidos sofrem angiogênese e liberam várias substâncias no sangue. Em particular, DNAs circulantes (ctDNAs), RNAs circulantes (ctRNAs), proteínas, vesículas, como exossomos, e células tumorais circulantes (CTCs) foram encontrados no sangue de pacientes com câncer ^2,9. Embora existam diferenças na quantidade dessas substâncias, elas são consistentemente observadas não apenas nos estágios iniciais, mas também nos estágios posteriores ^6,10. No entanto, essas diferenças individuais são muito altas; por exemplo, a quantidade de DNA livre de células (cfDNA) contendo ctDNA é inferior a 1.000 ng, e o número de CTCs é inferior a 100 em 10 mL de sangue total de pacientes com câncer^11,12,13. Muitos estudos caracterizaram o câncer usando essas substâncias presentes em quantidades menores (ou seja, cfDNA, ctDNA e CTCs). Para obter resultados precisos, é importante separar com precisão pequenas quantidades de substâncias com alta pureza^13,14. Os métodos convencionais de centrifugação são comumente usados, mas são difíceis de manusear e têm baixa pureza, dependendo da habilidade do usuário. Desde a descoberta das CTCs, várias técnicas de separação foram desenvolvidas, como centrifugação ou separação de grau de densidade, imunoesferas e métodos microfluídicos. Várias técnicas de contenção foram desenvolvidas desde a descoberta das CTCs. No entanto, essas técnicas são frequentemente limitadas quando é necessário isolar células dos vários cavacos e membranas utilizados para isolá-las¹⁵. Além disso, os métodos de marcação exigem equipamentos como o FACS, e há limites para o processo a jusante devido à contaminação por marcação.

Recentemente, o uso de biópsias líquidas aumentou, e vários estudos estão sendo realizados para a detecção precoce do câncer. Embora esse método seja simples, ainda existem dificuldades na análise a jusante, e vários estudos estão tentando superar essas dificuldades^16,17. Além disso, muitos locais, incluindo hospitais, exigem métodos automatizados, reprodutíveis e de alta pureza que sejam convenientes de usar. Aqui, desenvolvemos um laboratório em um disco para a separação automatizada de substâncias de amostras de sangue após uma biópsia líquida. Esses dispositivos são baseados no princípio da centrifugação, microfluídica e captura de células do tamanho de poros. Existem três tipos de discos: LBx-1 pode adquirir plasma e pelagem bufante, enquanto LBx-2 pode adquirir plasma e PBMC do sangue total com um volume inferior a 10 mL; O FAST-auto também pode adquirir CTCs usando uma membrana removível do disco. Até quatro de cada disco podem ser usados em uma execução. Acima de tudo, a vantagem deste dispositivo e método é que ele pode obter uma variedade de substâncias derivadas do câncer da mesma amostra usando uma pequena quantidade de sangue. Isso significa que o sangue do paciente só precisa ser retirado uma vez. Além disso, tem a vantagem de excluir erros devido a diferenças no período de amostragem de sangue. Esta plataforma é fácil de usar e fornece resultados precisos para biópsias líquidas e aplicações a jusante. Neste protocolo, o uso do dispositivo e do cartucho é introduzido.

Protocolo

Todas as amostras de sangue total foram obtidas de pacientes com câncer de pulmão. A pesquisa e a análise na Clinomics são realizadas pelo Cancer Genomics Research Institute, e a aprovação da pesquisa do IRB pelo governo é liderada pelo Comitê de Revisão Institucional do Asan Medical Center (IRB NO. 2021-0802) com o número do IRB registrado para pesquisa na Clinomics.

1. Preparação da amostra

1. Colete 9 mL de sangue total em um tubo de coleta de sangue estável em EDTA ou cfDNA.
2. Misture bem virando o tubo para cima e para baixo aproximadamente 10 vezes.
3. Conservar as amostras à temperatura ambiente (RT; para armazenagem a curto prazo) ou a 4 °C (para armazenagem a longo prazo). Não congele e descongele.

2. Preparação do dispositivo

1. Pressione o interruptor de energia para ligar o instrumento.
   NOTA: Uma tela de carregamento aparece no touchpad e o instrumento é inicializado. Mantenha as mãos afastadas do instrumento durante a inicialização. A tela de seleção do cartucho é exibida após a conclusão da inicialização do instrumento.
2. Selecione o modo de exemplo a ser usado. Altere o número de amostras pressionando a seta.

3. Operação do dispositivo e coleta de amostras

1. Carregamento do cartucho LBx-1
   1. Selecione o tipo de cartucho no painel touchscreen do instrumento. Altere o número de amostras pressionando o botão de seta.
   2. Abra a porta do instrumento e insira todos os cartuchos a serem usados na ordem do número no suporte do cartucho. Certifique-se de que insere corretamente o cartucho e o suporte do cartucho. Se o cartucho não for inserido corretamente, pode causar danos consideráveis ao instrumento.
   3. Para um total de quatro cartuchos, coloque o cartucho fictício no espaço vazio do suporte do cartucho.
   4. Use a roda de suporte para montar o cartucho e aperte a porca de bloqueio para prendê-lo.
   5. Feche a porta e pressione o botão RUN na tela do touchpad. O instrumento fecha as válvulas nos cartuchos, o que leva aproximadamente 30 s.
   6. Siga a mensagem para abrir a porta, remover a roda de suporte e remover o cartucho fechado com válvula do suporte do cartucho.
   7. Coloque o cartucho sobre a mesa e prepare-se para injetar a amostra de sangue total. Pipetar um máximo de 10 ml de amostra de sangue total utilizando uma pipeta serológica.
      CUIDADO: Perigos de manusear sangue. Durante todo o procedimento de manuseio de amostras de sangue e reagentes, é importante usar um jaleco de laboratório e luvas de laboratório. A FISPQ fornecida deve ser minuciosamente estudada pelos trabalhadores do laboratório.
   8. Insira a ponta da pipeta profundamente na entrada da amostra do cartucho e injete lentamente a amostra de sangue total.
      NOTA Ao usar mais ou igual a 9 mL de amostra de sangue total, nenhuma adição de solução salina tamponada com fosfato (PBS) é necessária. Ao usar menos de 9 mL de amostra de sangue total, adicione PBS para fazer o volume total para 9 mL. Por exemplo, ao usar 7,2 mL de sangue total, adicione 1,8 mL de PBS na entrada da amostra. Uma pipeta sorológica ou uma ponta de pipeta pode ser usada para a injeção de sangue total e PBS. Ao usar menos de 8 mL de amostra de sangue total, o revestimento bufante pode não ser recuperado, mesmo adicionando 1 mL de PBS. Para a preparação do gDNA, use 200 μL de sangue total, que foi separado antes desta etapa.
   9. Insira os cartuchos a serem usados na ordem do número no suporte do cartucho. Use a roda de suporte para montar o cartucho e aperte a porca de bloqueio para prendê-lo. Feche a porta e pressione o botão OK .
      NOTA: O plasma e o inchaço são separados do sangue total automaticamente, o que leva aproximadamente 30 minutos.
      CUIDADO Perigo durante a operação. Abrir a porta ou tocar no instrumento durante operações de rotação de alta velocidade pode causar ferimentos graves. Há também um risco de lesão devido à carga assimétrica do rotor. Se ocorrerem vibrações e ruídos incomuns quando o instrumento for iniciado no enriquecimento celular assistido ou no modo especialista, a colocação do cartucho pode ser assimétrica. Pressione imediatamente a tecla liga/desliga para parar e instalar corretamente o cartucho.
   10. Procure a mensagem na tela acompanhada por um som de alarme, que aparece quando a separação do plasma e do casaco bufante está completa.
   11. Pare o alarme abrindo a porta ou pressionando o botão STOP . Abra a porta, retire o cartucho e coloque-o sobre a mesa.
   12. Recupere 3 mL de plasma da saída plasmática usando uma ponta de pipeta de 1 mL. Recupere a pelagem bufante de 3 mL da saída da pelagem bufante usando uma ponta de pipeta de 1 mL.
2. Carregando o cartucho LBx-2
   1. Selecione o nome do cartucho no painel touchscreen do instrumento. Altere o número de amostras pressionando o botão de seta.
   2. Abra a porta e insira os cartuchos a serem usados na ordem do número no suporte do cartucho.
   3. Para um total de quatro cartuchos, coloque o cartucho fictício no espaço vazio do suporte do cartucho.
   4. Use a roda de suporte para montar o cartucho e aperte a porca de bloqueio para prendê-lo. Certifique-se de inserir corretamente o cartucho no suporte do cartucho. Se o cartucho não for inserido corretamente, pode causar danos consideráveis ao instrumento.
   5. Feche a porta e pressione o botão RUN na tela do touchpad. O instrumento fecha as válvulas no cartucho, o que leva aproximadamente 30 s.
   6. Siga a mensagem para abrir a porta, remover a roda de suporte, remover o cartucho fechado com válvula do suporte do cartucho e colocá-lo sobre a mesa.
   7. Coloque o cartucho sobre a mesa e prepare-se para injetar a solução de gradiente de densidade e a amostra de sangue total. Verificar o volume da solução de gradiente de densidade e PBS a injetar, dependendo do volume da amostra de sangue total (Tabela Suplementar 1).
   8. Pipetar a solução de gradiente de densidade utilizando uma pipeta serológica. Insira a ponta da pipeta profundamente na entrada do cartucho e injete lentamente a solução de gradiente de densidade.
   9. Após a injeção da solução de gradiente de densidade, pipetar a amostra de sangue total utilizando uma pipeta serológica. Insira a ponta da pipeta profundamente na entrada da amostra do cartucho e injete lentamente a amostra de sangue total.
      NOTA: Ao usar menos de 9 mL da amostra de sangue total, adicione PBS consultando esta tabela (Tabela Suplementar 1).
   10. Insira os cartuchos a serem usados em ordem de acordo com o número no suporte do cartucho. Use a roda de suporte para montar o cartucho e aperte a porca de bloqueio para prendê-lo. Feche a porta e pressione o botão OK .
   11. O plasma e o PBMC são separados do sangue total automaticamente, o que leva aproximadamente 30 minutos. Procure a mensagem que aparece acompanhada por um som de alarme, quando a separação do plasma e do PBMC estiver completa.
   12. Pare o alarme abrindo a porta ou pressionando o botão STOP . Abra a porta, retire o cartucho e coloque-o sobre a mesa.
   13. Recupere 3 mL de plasma da saída plasmática usando uma ponta de pipeta de 1 mL. Recupere 3 mL do PBMC da saída do PBMC usando uma ponta de pipeta de 1 mL.
3. Carregando o cartucho FAST-auto
   1. Selecione o cartucho no painel de tela sensível ao toque do instrumento. Altere o número de amostras pressionando o botão de seta.
   2. Abra a porta e insira os cartuchos a serem usados na ordem do número no suporte do cartucho. Para um total de quatro cartuchos, coloque o cartucho fictício no espaço vazio do suporte do cartucho.
   3. Use a roda de suporte para montar o cartucho e aperte a porca de bloqueio para prendê-lo.
   4. Feche a porta e pressione o botão RUN na tela do touch pad. O instrumento fecha as válvulas no cartucho, o que leva aproximadamente 30 s.
   5. Siga a mensagem para abrir a porta, remover a roda de suporte e remover o cartucho fechado com válvula do suporte do cartucho.
   6. Coloque o cartucho sobre a mesa e prepare-se para injetar a solução de PBS e a amostra de sangue total. Pipeta 6 mL de solução de PBS utilizando uma pipeta sorológica. Insira a ponta da pipeta profundamente na entrada PBS do cartucho e injete lentamente 6 mL da solução PBS.
   7. Após a injeção da solução de PBS, pipeta 3 mL de sangue total ou amostra de PBMC obtida de LBx-2 utilizando uma pipeta sorológica, que foi previamente enxaguada com 1% de BSA para evitar a aderência do resíduo. Insira a ponta da pipeta profundamente na entrada da amostra do cartucho e injete lentamente a amostra de sangue total.
   8. Insira os cartuchos a serem usados na ordem do número no suporte do cartucho. Use a roda de suporte para montar o cartucho e aperte a porca de bloqueio para prendê-lo. Feche a porta e pressione o botão OK .
   9. CTCs são enriquecidos a partir de sangue total automaticamente, o que leva aproximadamente 15 min. Procure uma mensagem que apareça acompanhada por um som de alarme quando o enriquecimento das CTCs estiver concluído. Pare o alarme abrindo a porta ou pressionando o botão STOP .
   10. Abra a porta, retire o cartucho e coloque-o sobre a mesa. Insira o removedor da placa traseira (BPR) nos quatro orifícios na parte frontal do cartucho. Pressione a asa azul escura com os polegares de ambas as mãos e, em seguida, pressione o corpo azul claro até que ele clique.
   11. Remova cuidadosamente o corpo do cartucho levantando-o. Pegue muito suavemente a membrana do filtro pela borda usando um tweezer. Certifique-se de usar a borda externa (a parte da borda de 1 mm de largura) da membrana do filtro para apertar e segurar a membrana do filtro.
   12. Coloque cuidadosamente a membrana filtrante (na qual as CTCs enriquecidas estão residindo) em um tubo de 1,5 mL para preparação de ácido nucleico. Se necessário, recupere o sangue filtrado para a saída de sangue usando uma ponta de pipeta de 1 mL.

4. Manutenção do sistema

1. Preparação para limpeza e desinfecção do instrumento
   1. Limpe todas as superfícies acessíveis do instrumento e dos acessórios uma vez por semana usando etanol e tecido seco, e também imediatamente quando contaminado.
   2. Limpe a tigela e o eixo do rotor regularmente usando álcool (etanol e isopropanol) ou desinfetantes à base de álcool.
2. Limpeza e desinfecção do instrumento
   NOTA: Para obter soluções gerais de problemas e outras observações sobre a máquina, consulte a Tabela Suplementar 2.
   1. Desligue o instrumento usando o interruptor de alimentação principal. Desconecte o plugue de alimentação da fonte de alimentação.
   2. Abra a porta e limpe e desinfete todas as superfícies acessíveis do instrumento, incluindo o cabo de alimentação, usando um pano úmido e os agentes de limpeza recomendados.
   3. Verifique se há danos no eixo do rotor. Inspecione o instrumento quanto à corrosão e danos.
   4. Conecte o instrumento à fonte de alimentação somente se ele estiver totalmente seco por dentro e por fora.
3. Desconecte o plugue de alimentação principal e remova o suporte do fusível. O suporte do fusível está localizado acima da tomada de energia. Substitua o fusível usado por um reservado do recipiente.

Resultados

O objetivo desta técnica é isolar de forma fácil e automática substâncias associadas ao câncer do sangue total. Em particular, qualquer um pode usar esta técnica em todos os campos adequados de pesquisa e análise. A separação simultânea e reprodutível de múltiplas substâncias em uma única amostra de sangue é significativa em biópsias líquidas. Os discos LBx-1 e LBx-2 são usados para isolar plasma e buffy coat ou PBMC do sangue total. A Figura 1 mostra os materiais separado...

Discussão

A quantidade e a concentração de cfDNA e CTC dependem do indivíduo, estágio e tipo de câncer. Depende também da condição do paciente 2,4,5,10,20. Em particular, nos estágios iniciais ou pré-cancerosos do câncer, as concentrações de substâncias relacionadas ao câncer são muito baixas, por isso há uma grande possibilidade de que não possa ser d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% BSA (Bovine Serum Albumin)	Sigma-Aldrich	A3059
1.5 mL Microcentrifuge Tube	Axygen	MCT-150-C-S
15 mL Conical Tube	SPL	50015
4150 TapeStation System	Agilent	G2992AA	Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633)
Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit	Apostle	A17622-250	5 mL X 50 preps version
BD Vacutainer blood collection tubes	BD	367525	EDTA Blood Collection Tube (10 mL)
BioViewCCBS	Clinomics		BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment
CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610	Invitrogen	MHCD4522
FAST Auto cartridge	Clinomics	CLX-M3001
LBx-1 cartridge	Clinomics	CLX-M4101
LBx-2 cartridge	Clinomics	CLX-M4201
OPR-2000 instrument	Clinomics	CLX-I2001
Cover Glass	Marienfeld Superior	HSU-0101040
DynaMag 2 Magnet Stand	Thermo Fisher Scientific	12321D
Ficoll Paque Solution	GE healthcare	17-1440-03	density gradient solution
Filter Tip, 10 µL	Axygen	AX-TF-10	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
Filter Tip, 200 µL	Axygen	AX-TF-200	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
Filter Tip, 100 µL	Axygen	AX-TF-100	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
Filter Tip, 1000 µL	Axygen	AX-TF-1000	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody	BioLegend	324204
FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin	BD Biosciences	347653
Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O)	Sigma Aldrich	433284
Kimtech Science Wipers	Yuhan-Kimberly	41117
Latex glove	Microflex	63-754
Magnetic Bead Separation Rack	V&P Scientific	VP 772F2M-2
Manual Pipetting  (0.5-10 µL)	Eppendorf	3120000020
Manual Pipetting  (2-20 µL)	Eppendorf	3120000038
Manual Pipetting  (10-100 µL)	Eppendorf	3120000046
Manual Pipetting  (20-200 µL)	Eppendorf	3120000054
Manual Pipetting  (100-1000 µL)	Eppendorf	3120000062
Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield	abcam	ab104139
Normal Human IgG Control	R&D Systems	1-001-A
OLYMPUS BX-UCB	Olympus	9217316
Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488	Invitrogen	53-9003-82
PBS (Phosphate Buffered Saline Solution)	Corning	21-040CVC
Portable Pipet Aid	Drummond	4-000-201
Slide Glass	Marienfeld Superior	HSU-1000612
StainTray Staining box	Simport	M920
Sterile Serological Pipette (10 mL)	SPL	91010
Triton X-100 solution	Sigma Aldrich	93443
TWEEN 20	Sigma Aldrich	P7949
Whole Blood			Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary.
X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator)	Excelitas	010-00157