Séparation et prélèvement automatiques de substances liées au cancer à partir d’échantillons cliniques

Résumé

Cet article décrit l’application d’équipements automatisés pour séparer et collecter facilement et efficacement des substances, telles que l’ADN acellulaire et les cellules tumorales circulantes, à partir du sang total.

Résumé

Récemment, des biopsies liquides ont été utilisées pour diagnostiquer diverses maladies, y compris le cancer. Les fluides corporels contiennent de nombreuses substances, y compris des cellules, des protéines et des acides nucléiques provenant de tissus normaux, mais certaines de ces substances proviennent également de la zone malade. L’investigation et l’analyse de ces substances dans les fluides corporels jouent un rôle central dans le diagnostic de diverses maladies. Par conséquent, il est important de séparer avec précision les substances requises, et plusieurs techniques sont développées à cette fin.

Nous avons développé un appareil et une plate-forme de type laboratoire sur disque nommé CD-PRIME. Cet appareil est automatisé et donne de bons résultats pour la contamination et la stabilité des échantillons. De plus, il présente les avantages d’un bon rendement d’acquisition, d’un temps de fonctionnement court et d’une reproductibilité élevée. En outre, selon le type de disque à monter, le plasma contenant de l’ADN acellulaire, les cellules tumorales circulantes, les cellules mononucléées du sang périphérique ou les couches leucocytaires peuvent être séparés. Ainsi, l’acquisition d’une variété de matériaux présents dans les fluides corporels peut être faite pour une variété d’applications en aval, y compris l’étude des omiques.

Introduction

La détection précoce et précise de diverses maladies, y compris le cancer, est le facteur le plus important dans l’établissement d’une stratégie de traitement 1,2,3,4. En particulier, la détection précoce du cancer est étroitement liée à l’augmentation des chances de survie du patient 5,6,7,8. Récemment, les biopsies liquides ont été sous les projecteurs pour la détection précoce du cancer. Les tumeurs solides subissent une angiogenèse et libèrent diverses substances dans le sang. En particulier, des ADN circulants (ADNct), des ARN circulants (ARNct), des protéines, des vésicules telles que les exosomes et des cellules tumorales circulantes (CTC) ont été trouvés dans le sang de patients cancéreux ^2,9. Bien qu’il existe des différences dans la quantité de ces substances, elles sont systématiquement observées non seulement dans les premiers stades, mais aussi dans les derniers stades ^6,10. Cependant, ces différences individuelles sont très élevées; par exemple, la quantité d’ADN acellulaire (cfDNA) contenant de l’ADNct est inférieure à 1 000 ng, et le nombre de CTC est inférieur à 100 dans 10 mL de sang total provenant de patients cancéreux^11,12,13. De nombreuses études ont caractérisé le cancer en utilisant ces substances présentes en moindre quantité (c.-à-d. cfDNA, ADNct et CTC). Pour obtenir des résultats précis, il est important de séparer avec précision de petites quantités de substances de haute pureté^13,14. Les méthodes de centrifugation conventionnelles sont couramment utilisées, mais elles sont difficiles à manipuler et ont une faible pureté en fonction des compétences de l’utilisateur. Depuis la découverte des CTC, plusieurs techniques de séparation ont été développées, telles que la centrifugation ou la séparation de grade de densité, les immunobilles et les méthodes microfluidiques. Plusieurs techniques de confinement ont été développées depuis la découverte des CTC. Cependant, ces techniques sont souvent limitées lorsqu’il est nécessaire d’isoler les cellules des différentes puces et membranes utilisées pour les isoler¹⁵. En outre, les méthodes d’étiquetage nécessitent des équipements tels que FACS, et il y a des limites au processus en aval en raison de la contamination par l’étiquetage.

Récemment, l’utilisation de biopsies liquides a augmenté et diverses études sont en cours pour la détection précoce du cancer. Bien que cette méthode soit simple, il existe encore des difficultés dans l’analyse en aval, et diverses études tentent de surmonter ces difficultés^16,17. En outre, de nombreux sites, y compris les hôpitaux, nécessitent des méthodes automatisées, reproductibles et de haute pureté pratiques à utiliser. Ici, nous avons développé un laboratoire sur disque pour la séparation automatisée des substances des échantillons de sang à la suite d’une biopsie liquide. Ces dispositifs sont basés sur le principe de la centrifugation, de la microfluidique et de la capture de cellules de la taille d’un pore. Il existe trois types de disques : LBx-1 peut acquérir du plasma et une couche leucocytaire, tandis que LBx-2 peut acquérir du plasma et de la PBMC à partir de sang total d’un volume inférieur à 10 mL; FAST-auto peut également acquérir des CTC à l’aide d’une membrane amovible du disque. Jusqu’à quatre de chaque disque peuvent être utilisés en une seule fois. Surtout, l’avantage de cet appareil et de cette méthode est qu’ils peuvent obtenir une variété de substances dérivées du cancer à partir du même échantillon en utilisant une petite quantité de sang. Cela signifie que le sang du patient ne doit être prélevé qu’une seule fois. De plus, il présente l’avantage d’exclure les erreurs dues aux différences dans la période de prélèvement sanguin. Cette plateforme est facile à utiliser et fournit des résultats précis pour les biopsies liquides et les applications en aval. Dans ce protocole, l’utilisation de l’appareil et de la cartouche est introduite.

Protocole

Tous les échantillons de sang total ont été prélevés chez des patients atteints d’un cancer du poumon. La recherche et l’analyse à Clinomics sont effectuées par l’Institut de recherche en génomique du cancer, et l’approbation de la recherche IRB par le gouvernement est dirigée par le Comité d’examen institutionnel du Centre médical Asan (IRB n ° 2021-0802) avec le numéro IRB enregistré pour la recherche à Clinomics.

1. Préparation de l’échantillon

1. Prélever 9 mL de sang total dans un tube de prélèvement de sang stable à l’EDTA ou à l’ADNcf.
2. Bien mélanger en retournant le tube de haut en bas environ 10 fois.
3. Conservez les échantillons à température ambiante (RT; pour un stockage à court terme) ou à 4 °C (pour un stockage à long terme). Ne pas congeler et décongeler.

2. Préparation de l’appareil

1. Appuyez sur l’interrupteur d’alimentation pour allumer l’instrument.
   REMARQUE: Un écran de chargement apparaît sur le pavé tactile et l’instrument est initialisé. Gardez les mains loin de l’instrument pendant l’initialisation. L’écran de sélection de la cartouche s’affiche une fois l’initialisation de l’instrument terminée.
2. Sélectionnez le mode d’échantillonnage à utiliser. Modifiez le nombre d’échantillons en appuyant sur la flèche.

3. Fonctionnement de l’appareil et prélèvement d’échantillons

1. Chargement de la cartouche LBx-1
   1. Sélectionnez le type de cartouche sur l’écran tactile de l’instrument. Modifiez le nombre d’échantillons en appuyant sur le bouton fléché.
   2. Ouvrez la porte de l’instrument et insérez toutes les cartouches à utiliser dans l’ordre du numéro sur le porte-cartouche. Assurez-vous d’insérer correctement la cartouche et le porte-cartouche. Si la cartouche n’est pas insérée correctement, elle peut causer des dommages considérables à l’instrument.
   3. Pour un total de quatre cartouches, placez la cartouche factice dans l’espace vide du porte-cartouche.
   4. Utilisez la molette de support pour monter la cartouche et serrez l’écrou de verrouillage pour la fixer.
   5. Fermez la porte et appuyez sur le bouton RUN sur l’écran du pavé tactile. L’instrument ferme les vannes sur les cartouches, ce qui prend environ 30 s.
   6. Suivez le message pour ouvrir la porte, retirez la roue de support et retirez la cartouche fermée par valve du porte-cartouche.
   7. Placez la cartouche sur la table et préparez-vous à injecter l’échantillon de sang total. Pipeter un maximum de 10 mL d’échantillon de sang total à l’aide d’une pipette sérologique.
      ATTENTION : Dangers de la manipulation du sang. Pendant toute la procédure de manipulation des échantillons de sang et des réactifs, il est important de porter une blouse de laboratoire et des gants de laboratoire. La FS fournie doit être étudiée en profondeur par les travailleurs de laboratoire.
   8. Insérez l’embout de la pipette profondément dans l’entrée de l’échantillon de la cartouche et injectez lentement l’échantillon de sang total.
      NOTE Lorsque vous utilisez plus de 9 mL d’échantillon de sang total, il n’est pas nécessaire d’ajouter une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Lorsque vous utilisez moins de 9 mL d’échantillon de sang total, ajoutez du PBS pour porter le volume total à 9 mL. Par exemple, lorsque vous utilisez 7,2 mL de sang total, veuillez ajouter 1,8 mL de PBS dans l’entrée de l’échantillon. Une pipette sérologique ou une pointe de pipette peut être utilisée pour l’injection de sang total et de PBS. Lorsque vous utilisez moins de 8 mL d’échantillon de sang total, la couche leucocytaire peut ne pas être récupérée même en ajoutant 1 mL de PBS. Pour la préparation de l’ADNg, utilisez 200 μL de sang total, qui a été séparé avant cette étape.
   9. Insérez les cartouches à utiliser dans l’ordre du numéro sur le porte-cartouche. Utilisez la molette de support pour monter la cartouche et serrez l’écrou de verrouillage pour la fixer. Fermez la porte et appuyez sur le bouton OK .
      REMARQUE: Le plasma et la couche leucocytaire sont séparés automatiquement du sang total, ce qui prend environ 30 minutes.
      ATTENTION Danger pendant le fonctionnement. Ouvrir la porte ou toucher l’instrument pendant les opérations rotatives à grande vitesse peut causer des blessures graves. Il existe également un risque de blessure en raison de la charge asymétrique du rotor. Si des vibrations et des bruits inhabituels se produisent lorsque l’instrument démarre à l’enrichissement assisté de la cellule ou en mode expert, le placement de la cartouche peut être asymétrique. Appuyez immédiatement sur la touche d’alimentation pour arrêter et installer correctement la cartouche.
   10. Recherchez le message à l’écran accompagné d’un son d’alarme, qui apparaît lorsque la séparation du plasma et de la couche leucocytaire est terminée.
   11. Arrêtez l’alarme en ouvrant la porte ou en appuyant sur le bouton STOP . Ouvrez la porte, retirez la cartouche et placez-la sur la table.
   12. Récupérer 3 mL de plasma de la sortie de plasma à l’aide d’un embout de pipette de 1 mL. Récupérer la couche leucocytaire de 3 mL de la sortie de la couche leucocytaire à l’aide d’un embout de pipette de 1 mL.
2. Chargement de la cartouche LBx-2
   1. Sélectionnez le nom de la cartouche sur l’écran tactile de l’instrument. Modifiez le nombre d’échantillons en appuyant sur le bouton fléché.
   2. Ouvrez la porte et insérez les cartouches à utiliser dans l’ordre du numéro sur le porte-cartouche.
   3. Pour un total de quatre cartouches, placez la cartouche factice dans l’espace vide du porte-cartouche.
   4. Utilisez la molette de support pour monter la cartouche et serrez l’écrou de verrouillage pour la fixer. Assurez-vous d’insérer correctement la cartouche dans le porte-cartouche. Si la cartouche n’est pas insérée correctement, elle peut causer des dommages considérables à l’instrument.
   5. Fermez la porte et appuyez sur le bouton RUN sur l’écran du pavé tactile. L’instrument ferme les vannes sur la cartouche, ce qui prend environ 30 s.
   6. Suivez le message pour ouvrir la porte, retirez la roue de support, retirez la cartouche fermée par valve du porte-cartouche et placez-la sur la table.
   7. Placez la cartouche sur la table et préparez-vous à injecter la solution de gradient de densité et l’échantillon de sang total. Vérifier le volume de la solution à gradient de densité et du PBS à injecter en fonction du volume de l’échantillon de sang total (tableau supplémentaire 1).
   8. Pipeter la solution de gradient de densité à l’aide d’une pipette sérologique. Insérez l’embout de la pipette profondément dans l’entrée de la cartouche et injectez lentement la solution de gradient de densité.
   9. Après injection de la solution à gradient de densité, pipeter l’échantillon de sang total à l’aide d’une pipette sérologique. Insérez l’embout de la pipette profondément dans l’entrée de l’échantillon de la cartouche et injectez lentement l’échantillon de sang total.
      REMARQUE : Lorsque vous utilisez moins de 9 mL de l’échantillon de sang total, ajoutez le PBS en vous référant à ce tableau (tableau supplémentaire 1).
   10. Insérez les cartouches à utiliser dans l’ordre en fonction du numéro indiqué sur le porte-cartouche. Utilisez la molette de support pour monter la cartouche et serrez l’écrou de verrouillage pour la fixer. Fermez la porte et appuyez sur le bouton OK .
   11. Le plasma et la PBMC sont séparés automatiquement du sang total, ce qui prend environ 30 minutes. Recherchez le message qui apparaît accompagné d’un son d’alarme, lorsque la séparation du plasma et de la PBMC est terminée.
   12. Arrêtez l’alarme en ouvrant la porte ou en appuyant sur le bouton STOP . Ouvrez la porte, retirez la cartouche et placez-la sur la table.
   13. Récupérer 3 mL de plasma de la sortie de plasma à l’aide d’un embout de pipette de 1 mL. Récupérer 3 mL de la PBMC de la prise PBMC à l’aide d’un embout de pipette de 1 mL.
3. Chargement de la cartouche FAST-auto
   1. Sélectionnez la cartouche sur l’écran tactile de l’instrument. Modifiez le nombre d’échantillons en appuyant sur le bouton fléché.
   2. Ouvrez la porte et insérez les cartouches à utiliser dans l’ordre du numéro sur le porte-cartouche. Pour un total de quatre cartouches, placez la cartouche factice dans l’espace vide du porte-cartouche.
   3. Utilisez la molette de support pour monter la cartouche et serrez l’écrou de verrouillage pour la fixer.
   4. Fermez la porte et appuyez sur le bouton RUN de l’écran du pavé tactile. L’instrument ferme les vannes sur la cartouche, ce qui prend environ 30 s.
   5. Suivez le message pour ouvrir la porte, retirez la roue de support et retirez la cartouche fermée par valve du porte-cartouche.
   6. Placez la cartouche sur la table et préparez-vous à injecter la solution de PBS et l’échantillon de sang total. Pipeter 6 mL de solution PBS à l’aide d’une pipette sérologique. Insérez l’embout de la pipette profondément dans l’entrée PBS de la cartouche et injectez lentement 6 ml de la solution PBS.
   7. Après l’injection de la solution de PBS, pipeter 3 mL de sang total ou d’échantillon de PBMC obtenu à partir de LBx-2 à l’aide d’une pipette sérologique, préalablement rincée avec 1% de BSA pour éviter que le résidu ne colle. Insérez l’embout de la pipette profondément dans l’entrée de l’échantillon de la cartouche et injectez lentement l’échantillon de sang total.
   8. Insérez les cartouches à utiliser dans l’ordre du numéro sur le porte-cartouche. Utilisez la molette de support pour monter la cartouche et serrez l’écrou de verrouillage pour la fixer. Fermez la porte et appuyez sur le bouton OK .
   9. Les CTC sont enrichis automatiquement à partir de sang total, ce qui prend environ 15 min. Recherchez un message qui apparaît accompagné d’un son d’alarme lorsque l’enrichissement des CTC est terminé. Arrêtez l’alarme en ouvrant la porte ou en appuyant sur le bouton STOP .
   10. Ouvrez la porte, retirez la cartouche et placez-la sur la table. Insérez le dissolvant de plaque arrière (BPR) dans les quatre trous situés à l’avant de la cartouche. Appuyez sur l’aile bleu foncé avec les pouces des deux mains, puis appuyez sur le corps bleu clair jusqu’à ce qu’il clique.
   11. Retirez délicatement le corps de la cartouche en le soulevant. Soulevez très doucement la membrane filtrante par le bord à l’aide d’une pince à épiler. Assurez-vous d’utiliser le bord extérieur (la partie bord de 1 mm de large) de la membrane filtrante pour pincer et maintenir la membrane filtrante.
   12. Placez soigneusement la membrane filtrante (sur laquelle résident les CTC enrichis) dans un tube de 1,5 mL pour la préparation des acides nucléiques. Si nécessaire, récupérez le sang filtré à la sortie de sang à l’aide d’un embout de pipette de 1 mL.

4. Maintenance du système

1. Préparation pour le nettoyage et la désinfection de l’instrument
   1. Nettoyez toutes les surfaces accessibles de l’instrument et des accessoires une fois par semaine avec de l’éthanol et du tissu séché, ainsi que immédiatement en cas de contamination.
   2. Nettoyez régulièrement le bol et l’arbre du rotor avec de l’alcool (éthanol et isopropanol) ou des désinfectants à base d’alcool.
2. Nettoyage et désinfection de l’instrument
   REMARQUE : pour un dépannage général et d’autres remarques sur la machine, reportez-vous au Tableau supplémentaire 2.
   1. Éteignez l’instrument à l’aide de l’interrupteur d’alimentation principal. Débranchez la fiche d’alimentation du bloc d’alimentation.
   2. Ouvrez la porte et nettoyez et désinfectez toutes les surfaces accessibles de l’instrument, y compris le câble d’alimentation, à l’aide d’un chiffon humide et des produits de nettoyage recommandés.
   3. Vérifiez que l’arbre du rotor n’est pas endommagé. Inspectez l’instrument pour détecter la corrosion et les dommages.
   4. Connectez l’instrument à l’alimentation uniquement s’il est complètement sec à l’intérieur et à l’extérieur.
3. Débranchez la fiche d’alimentation principale et retirez le porte-fusible. Le porte-fusible est situé au-dessus de la prise de courant. Remplacez le fusible usagé par un fusible de rechange du conteneur.

Résultats

Le but de cette technique est d’isoler facilement et automatiquement les substances associées au cancer du sang total. En particulier, tout le monde peut utiliser cette technique dans tous les domaines appropriés de recherche et d’analyse. La séparation simultanée et reproductible de plusieurs substances dans un seul échantillon de sang est significative dans les biopsies liquides. Les disques LBx-1 et LBx-2 sont utilisés pour isoler le plasma et la couche leucocytaire ou PBMC du sang total.

Discussion

La quantité et la concentration d’ADNcf et de CTC dépendent de l’individu, du stade et du type de cancer. Cela dépend également de l’état du patient 2,4,5,10,20. En particulier, dans les stades précoces ou précancéreux du cancer, les concentrations de substances liées au cancer sont très faibles, il y a donc une forte possibilité qu’il ne pu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% BSA (Bovine Serum Albumin)	Sigma-Aldrich	A3059
1.5 mL Microcentrifuge Tube	Axygen	MCT-150-C-S
15 mL Conical Tube	SPL	50015
4150 TapeStation System	Agilent	G2992AA	Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633)
Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit	Apostle	A17622-250	5 mL X 50 preps version
BD Vacutainer blood collection tubes	BD	367525	EDTA Blood Collection Tube (10 mL)
BioViewCCBS	Clinomics		BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment
CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610	Invitrogen	MHCD4522
FAST Auto cartridge	Clinomics	CLX-M3001
LBx-1 cartridge	Clinomics	CLX-M4101
LBx-2 cartridge	Clinomics	CLX-M4201
OPR-2000 instrument	Clinomics	CLX-I2001
Cover Glass	Marienfeld Superior	HSU-0101040
DynaMag 2 Magnet Stand	Thermo Fisher Scientific	12321D
Ficoll Paque Solution	GE healthcare	17-1440-03	density gradient solution
Filter Tip, 10 µL	Axygen	AX-TF-10	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
Filter Tip, 200 µL	Axygen	AX-TF-200	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
Filter Tip, 100 µL	Axygen	AX-TF-100	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
Filter Tip, 1000 µL	Axygen	AX-TF-1000	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody	BioLegend	324204
FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin	BD Biosciences	347653
Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O)	Sigma Aldrich	433284
Kimtech Science Wipers	Yuhan-Kimberly	41117
Latex glove	Microflex	63-754
Magnetic Bead Separation Rack	V&P Scientific	VP 772F2M-2
Manual Pipetting  (0.5-10 µL)	Eppendorf	3120000020
Manual Pipetting  (2-20 µL)	Eppendorf	3120000038
Manual Pipetting  (10-100 µL)	Eppendorf	3120000046
Manual Pipetting  (20-200 µL)	Eppendorf	3120000054
Manual Pipetting  (100-1000 µL)	Eppendorf	3120000062
Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield	abcam	ab104139
Normal Human IgG Control	R&D Systems	1-001-A
OLYMPUS BX-UCB	Olympus	9217316
Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488	Invitrogen	53-9003-82
PBS (Phosphate Buffered Saline Solution)	Corning	21-040CVC
Portable Pipet Aid	Drummond	4-000-201
Slide Glass	Marienfeld Superior	HSU-1000612
StainTray Staining box	Simport	M920
Sterile Serological Pipette (10 mL)	SPL	91010
Triton X-100 solution	Sigma Aldrich	93443
TWEEN 20	Sigma Aldrich	P7949
Whole Blood			Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary.
X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator)	Excelitas	010-00157