הפרדה ואיסוף אוטומטיים של חומרים הקשורים לסרטן מדגימות קליניות

Summary

מאמר זה מתאר את היישום של ציוד אוטומטי כדי להפריד ולאסוף בקלות וביעילות, כגון DNA ללא תאים ותאי גידול במחזור, מדם שלם.

Abstract

לאחרונה, ביופסיות נוזליות שימשו לאבחון מחלות שונות, כולל סרטן. נוזלי גוף מכילים חומרים רבים, כולל תאים, חלבונים וחומצות גרעין שמקורם ברקמות רגילות, אך חלק מחומרים אלה מקורם גם באזור החולה. החקירה והניתוח של חומרים אלה בנוזלי הגוף ממלאים תפקיד מרכזי באבחון מחלות שונות. לכן, חשוב להפריד במדויק את החומרים הנדרשים, וכמה טכניקות מפותחות לשימוש למטרה זו.

פיתחנו סוג מעבדה על דיסק של מכשיר ופלטפורמה בשם CD-PRIME. מכשיר זה הוא אוטומטי ויש לו תוצאות טובות עבור זיהום מדגם ויציבות הדגימה. יתר על כן, יש לו יתרונות של תשואת רכישה טובה, זמן פעולה קצר, ושכפול גבוה. בנוסף, בהתאם לסוג הדיסק שיש להרכיב, ניתן להפריד פלזמה המכילה DNA ללא תאים, תאי גידול במחזור, תאים חד-גרעיניים של דם היקפי או ציפויי באפי. לפיכך, רכישת מגוון חומרים הנמצאים בנוזלי הגוף יכולה להיעשות עבור מגוון רחב של יישומים במורד הזרם, כולל המחקר של omics.

Introduction

גילוי מוקדם ומדויק של מחלות שונות, כולל סרטן, הוא הגורם החשוב ביותר בקביעת אסטרטגיית טיפול 1,2,3,4. בפרט, גילוי מוקדם של סרטן קשור קשר הדוק עם סיכויי הישרדות מוגברים עבור המטופל 5,6,7,8. לאחרונה, ביופסיות נוזליות היו באור הזרקורים לגילוי מוקדם של סרטן. גידולים מוצקים עוברים אנגיוגנזה ומשחררים חומרים שונים לדם. בפרט, דנ"א במחזור (ctDNAs), רנ"א במחזור (ctRNAs), חלבונים, שלפוחיות כגון אקסוזומים ותאי גידול במחזור הדם (CTCs) נמצאו בדמם של חולי סרטן ^2,9. למרות שיש הבדלים בכמות החומרים הללו, הם נצפים בעקביות לא רק בשלבים המוקדמים אלא גם בשלבים מאוחרים יותר ^6,10. עם זאת, הבדלים בודדים אלה הם גבוהים מאוד; לדוגמה, כמות הדנ"א נטול התאים (cfDNA) המכילה ctDNA היא פחות מ-1,000 ננוגרם, ומספר ה-CTCs קטן מ-100 ב-10 מ"ל של דם שלם מחולי סרטן^11,12,13. מחקרים רבים אפיינו סרטן בשימוש בחומרים אלה בכמויות קטנות יותר (כלומר, cfDNA, ctDNA ו- CTCs). כדי להשיג תוצאות מדויקות, חשוב להפריד במדויק כמויות קטנות של חומרים עם טוהר גבוה^13,14. שיטות צנטריפוגה קונבנציונליות משמשות בדרך כלל, אך הן קשות לטיפול ויש להן טוהר נמוך בהתאם למיומנות המשתמש. מאז גילוי ה-CTCs, פותחו מספר טכניקות הפרדה, כגון צנטריפוגה או הפרדת דרגות צפיפות, אימונובייד ושיטות מיקרופלואידיות. מספר טכניקות הכלה פותחו מאז גילוי CTCs. עם זאת, טכניקות אלה מוגבלות לעתים קרובות כאשר יש צורך לבודד תאים מן השבבים השונים ואת הממברנות המשמשים לבודד אותם¹⁵. כמו כן, שיטות התיוג דורשות ציוד כגון FACS, ויש מגבלות לתהליך במורד הזרם עקב זיהום תיוג.

לאחרונה, השימוש בביופסיות נוזליות גדל, ומחקרים שונים נערכים לגילוי מוקדם של סרטן. למרות ששיטה זו פשוטה, עדיין ישנם קשיים בניתוח במורד הזרם, ומחקרים שונים מנסים להתגבר על קשיים אלה^16,17. בנוסף, אתרים רבים, כולל בתי חולים, דורשים שיטות אוטומטיות, ניתנות לשחזור וטוהר גבוה הנוחות לשימוש. כאן פיתחנו מעבדה על דיסק להפרדה אוטומטית של חומרים מדגימות דם לאחר ביופסיה נוזלית. התקנים אלה מבוססים על העיקרון של צנטריפוגה, מיקרופלואידיקה ולכידת תאים בגודל נקבוביות. ישנם שלושה סוגים של דיסקים: LBx-1 יכול לרכוש פלזמה וציפוי באפי, בעוד LBx-2 יכול לרכוש פלזמה ו- PBMC מדם שלם עם נפח של פחות מ -10 מ"ל; FAST-auto יכול גם לרכוש CTCs באמצעות קרום הניתן להסרה מהדיסק. ניתן להשתמש בעד ארבעה מכל דיסק בהפעלה אחת. מעל לכל, היתרון של מכשיר ושיטה זו הוא כי הוא יכול לקבל מגוון רחב של חומרים שמקורם בסרטן מאותה דגימה באמצעות כמות קטנה של דם. משמעות הדבר היא כי הדם של המטופל רק צריך להיות נמשך פעם אחת. בנוסף, יש לו את היתרון של אי הכללת טעויות עקב הבדלים בתקופת דגימת הדם. פלטפורמה זו קלה לשימוש ומספקת תוצאות מדויקות עבור ביופסיות נוזליות ויישומים במורד הזרם. בפרוטוקול זה, השימוש במכשיר ובמחסנית מוצג.

Protocol

כל דגימות הדם השלמות התקבלו מחולי סרטן ריאות. המחקר והניתוח בקלינומיקס מתבצעים על ידי המכון לחקר גנומיקה של סרטן, ואישור מחקר IRB על ידי הממשלה מובל על ידי ועדת הביקורת המוסדית של המרכז הרפואי אסאן (IRB NO. 2021-0802) עם מספר IRB רשום למחקר בקלינומיקס.

1. הכנת מדגם

1. אסוף 9 מ"ל של דם שלם לתוך צינור איסוף דם יציב EDTA או cfDNA.
2. מערבבים היטב על ידי היפוך הצינור למעלה ולמטה כ-10 פעמים.
3. אחסנו את הדגימות בטמפרטורת החדר (RT; לאחסון לטווח קצר) או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס (לאחסון לטווח ארוך). אין להקפיא ולהפשיר.

2. הכנת המכשיר

1. לחץ על מתג ההפעלה כדי להפעיל את המכשיר.
   הערה: מסך טעינה מופיע בלוח המגע, והכלי מאותחל. יש להרחיק את הידיים מהמכשיר במהלך האתחול. מסך בחירת המחסנית מופיע לאחר השלמת אתחול המכשיר.
2. בחר את המצב לדוגמה לשימוש. שנה את מספר הדוגמאות על-ידי לחיצה על החץ.

3. הפעלת המכשיר ואיסוף הדגימות

1. העמסת מחסנית LBx-1
   1. בחר את סוג המחסנית בלוח מסך המגע של המכשיר. שנה את מספר הדוגמאות על-ידי לחיצה על לחצן החץ.
   2. פתח את דלת המכשיר והכנס את כל המחסניות לשימוש לפי סדר המספר על מחזיק המחסנית. הקפד להכניס כראוי את המחסנית ואת מחזיק המחסנית. אם המחסנית אינה מוכנסת כראוי, הדבר עלול לגרום נזק ניכר למכשיר.
   3. לקבלת ארבע מחסניות בסך הכל, הנח את מחסנית הדמה בשטח הריק של מחזיק המחסנית.
   4. השתמש בגלגל התמיכה כדי להרכיב את המחסנית ולהדק את אום הנעילה כדי לאבטח אותה.
   5. סגור את הדלת ולחץ על לחצן RUN במסך לוח המגע. המכשיר סוגר את השסתומים על מחסניות, אשר לוקח כ 30 שניות.
   6. עקוב אחר ההודעה כדי לפתוח את הדלת, להסיר את גלגל התמיכה ולהסיר את המחסנית הסגורה באמצעות שסתום ממחזיק המחסנית.
   7. מניחים את המחסנית על השולחן ומתכוננים להזריק את כל דגימת הדם. פיפטה מקסימום של 10 מ"ל של דגימת דם שלמה באמצעות פיפטה סרולוגית.
      אזהרה: סכנות הטיפול בדם. במהלך כל הליך הטיפול בדגימות דם וריאגנטים, חשוב ללבוש מעיל מעבדה וכפפות מעבדה. MSDS בתנאי צריך להיות נחקר ביסודיות על ידי עובדי המעבדה.
   8. הכנס את קצה הפיפטה עמוק לתוך כניסת הדגימה של המחסנית והזריק באיטיות את כל דגימת הדם.
      הערה בעת שימוש ביותר או שווה ל-9 מ"ל של דגימת דם שלמה, אין צורך בתוספת מלח עם מאגר פוספט (PBS). בעת שימוש בפחות מ-9 מ"ל של דגימת דם שלמה, הוסף PBS כדי להפוך את הנפח הכולל ל-9 מ"ל. לדוגמה, בעת שימוש ב- 7.2 מ"ל של דם שלם, אנא הוסף 1.8 מ"ל של PBS לכניסת הדגימה. פיפטה סרולוגית או קצה פיפטה יכולים לשמש להזרקת דם שלם ו- PBS. בעת שימוש בפחות מ-8 מ"ל של דגימת דם שלמה, ייתכן שלא ניתן לשחזר את הפרווה של באפי אפילו על ידי הוספת 1 מ"ל של PBS. להכנת gDNA, השתמש ב-200 μL של דם שלם, שהופרד לפני שלב זה.
   9. הכנס את המחסניות לשימוש לפי סדר המספר במחזיק המחסנית. השתמש בגלגל התמיכה כדי להרכיב את המחסנית ולהדק את אום הנעילה כדי לאבטח אותה. סגור את הדלת ולחץ על בסדר לחצן.
      הערה: פלזמה ופרווה באפי מופרדות מדם שלם באופן אוטומטי, מה שאורך כ-30 דקות.
      שים לב סכנה במהלך הפעולה. פתיחת הדלת או נגיעה במכשיר במהלך פעולות סיבוב במהירות גבוהה עלולה לגרום לפציעות חמורות. קיים גם סיכון לפציעה עקב העמסה אסימטרית של הרוטור. אם רעידות ורעשים חריגים מתרחשים כאשר המכשיר מתחיל בהעשרת תאים בסיוע או במצב מומחה, מיקום המחסנית עשוי להיות לא סימטרי. לחץ מיד על מקש ההפעלה כדי לעצור ולהתקין כראוי את המחסנית.
   10. חפשו את ההודעה על המסך המלווה בצליל אזעקה, המופיע כאשר ההפרדה בין הפלזמה למעיל באפי הושלמה.
   11. עצור את השעון המעורר על-ידי פתיחת הדלת או לחיצה על לחצן STOP . פתח את הדלת, הסר את המחסנית והנח אותה על השולחן.
   12. לשחזר 3 מ"ל של פלזמה מן מוצא פלזמה באמצעות קצה פיפטה 1 מ"ל. שחזר את ציפוי באפי של 3 מ"ל משקע מעיל באפי באמצעות קצה פיפטה של 1 מ"ל.
2. טעינת מחסנית LBx-2
   1. בחר את שם המחסנית בלוח מסך המגע של המכשיר. שנה את מספר הדוגמאות על-ידי לחיצה על לחצן החץ.
   2. פתח את הדלת והכנס את המחסניות לשימוש לפי סדר המספר על מחזיק המחסנית.
   3. לקבלת ארבע מחסניות בסך הכל, הנח את מחסנית הדמה בשטח הריק של מחזיק המחסנית.
   4. השתמש בגלגל התמיכה כדי להרכיב את המחסנית ולהדק את אום הנעילה כדי לאבטח אותה. הקפד להכניס כראוי את המחסנית למחזיק המחסנית. אם המחסנית אינה מוכנסת כראוי, הדבר עלול לגרום נזק ניכר למכשיר.
   5. סגור את הדלת ולחץ על לחצן RUN במסך לוח המגע. המכשיר סוגר את השסתומים על המחסנית, אשר לוקח כ 30 שניות.
   6. עקוב אחר ההודעה כדי לפתוח את הדלת, להסיר את גלגל התמיכה, להסיר את המחסנית הסגורה באמצעות שסתום ממחזיק המחסנית ולהניח אותה על השולחן.
   7. מניחים את המחסנית על השולחן ומתכוננים להזריק את תמיסת שיפוע הצפיפות ואת כל דגימת הדם. בדוק את נפח תמיסת שיפוע הצפיפות ואת PBS שיש להזריק בהתאם לנפח דגימת הדם כולה (טבלה משלימה 1).
   8. פיפטה את תמיסת גרדיאנט הצפיפות באמצעות פיפטה סרולוגית. הכנס את קצה הפיפטה עמוק לתוך פתח הכניסה של המחסנית והזרק באיטיות את תמיסת שיפוע הצפיפות.
   9. לאחר הזרקת תמיסת שיפוע הצפיפות, פיפטה את כל דגימת הדם באמצעות פיפטה סרולוגית. הכנס את קצה הפיפטה עמוק לתוך כניסת הדגימה של המחסנית והזריק באיטיות את כל דגימת הדם.
      הערה: בעת שימוש בפחות מ-9 מ"ל מדגימת הדם כולה, הוסף PBS על-ידי הפניה לטבלה זו (טבלה משלימה 1).
   10. הכנס את המחסניות לשימוש לפי המספר על מחזיק המחסנית. השתמש בגלגל התמיכה כדי להרכיב את המחסנית ולהדק את אום הנעילה כדי לאבטח אותה. סגור את הדלת ולחץ על בסדר לחצן.
   11. פלזמה ו- PBMC מופרדים מדם שלם באופן אוטומטי, מה שלוקח בערך 30 דקות. חפש את ההודעה המופיעה מלווה בצליל אזעקה, כאשר הפרדת הפלזמה וה- PBMC הושלמה.
   12. עצור את השעון המעורר על-ידי פתיחת הדלת או לחיצה על לחצן STOP . פתח את הדלת, הסר את המחסנית והנח אותה על השולחן.
   13. לשחזר 3 מ"ל של פלזמה מן מוצא פלזמה באמצעות קצה פיפטה 1 מ"ל. שחזר 3 מ"ל של PBMC משקע PBMC באמצעות קצה פיפטה של 1 מ"ל.
3. טעינת מחסנית FAST-auto
   1. בחר את המחסנית בלוח מסך המגע של המכשיר. שנה את מספר הדוגמאות על-ידי לחיצה על לחצן החץ.
   2. פתח את הדלת והכנס את המחסניות לשימוש לפי סדר המספר על מחזיק המחסנית. לקבלת ארבע מחסניות בסך הכל, הנח את מחסנית הדמה בשטח הריק של מחזיק המחסנית.
   3. השתמש בגלגל התמיכה כדי להרכיב את המחסנית ולהדק את אום הנעילה כדי לאבטח אותה.
   4. סגור את הדלת ולחץ על לחצן RUN במסך משטח המגע. המכשיר סוגר את השסתומים על המחסנית, אשר לוקח כ 30 שניות.
   5. עקוב אחר ההודעה כדי לפתוח את הדלת, להסיר את גלגל התמיכה ולהסיר את המחסנית הסגורה באמצעות שסתום ממחזיק המחסנית.
   6. מניחים את המחסנית על השולחן ומתכוננים להזריק את תמיסת ה- PBS ודגימת דם שלמה. פיפטה 6 מ"ל של תמיסת PBS באמצעות פיפטה סרולוגית. הכנס את קצה הפיפטה עמוק לתוך כניסת ה- PBS של המחסנית והזרק באיטיות 6 מ"ל של תמיסת PBS.
   7. לאחר הזרקת תמיסת PBS, פיפטה 3 מ"ל של דם שלם או דגימת PBMC שהתקבלה מ- LBx-2 באמצעות פיפטה סרולוגית, אשר נשטפה בעבר עם 1% BSA כדי למנוע הידבקות של שאריות. הכנס את קצה הפיפטה עמוק לתוך כניסת הדגימה של המחסנית והזריק באיטיות את כל דגימת הדם.
   8. הכנס את המחסניות לשימוש לפי סדר המספר במחזיק המחסנית. השתמש בגלגל התמיכה כדי להרכיב את המחסנית ולהדק את אום הנעילה כדי לאבטח אותה. סגור את הדלת ולחץ על בסדר לחצן.
   9. CTCs מועשרים מדם שלם באופן אוטומטי, אשר לוקח בערך 15 דקות. חפש הודעה שמופיעה מלווה בצליל אזעקה עם השלמת העשרת ה- CTCs. עצור את השעון המעורר על-ידי פתיחת הדלת או לחיצה על לחצן STOP .
   10. פתח את הדלת, הסר את המחסנית והנח אותה על השולחן. הכנס את מסיר הלוח האחורי (BPR) לארבעת החורים בחזית המחסנית. לחץ על הכנף הכחולה כהה עם האגודלים של שתי הידיים, ולאחר מכן לחץ על הגוף הכחול בהיר עד שהוא לוחץ.
   11. הסר בזהירות את גוף המחסנית על ידי הרמתה. מרימים בעדינות רבה את קרום המסנן עד הקצה באמצעות פינצטה. אנא הקפידו להשתמש בשפה החיצונית (החלק בעל הקצה הרחב של 1 מ"מ) של קרום המסנן כדי לצבוט ולהחזיק את קרום המסנן.
   12. בזהירות למקם את קרום המסנן (שעליו CTCs מועשרים שוכנים) לתוך צינור 1.5 מ"ל להכנת חומצת גרעין. במידת הצורך, לשחזר את הדם מסונן לשקע הדם באמצעות קצה פיפטה 1 מ"ל.

4. תחזוקת המערכת

1. הכנה לניקוי וחיטוי המכשיר
   1. נקו את כל המשטחים הנגישים של המכשיר והאביזרים פעם בשבוע באמצעות אתנול ורקמות מיובשות, וגם מיד כאשר מזוהמים.
   2. נקו את הקערה ואת פיר הרוטור באופן קבוע באמצעות אלכוהול (אתנול ואיזופרופנול) או חומרי חיטוי על בסיס אלכוהול.
2. ניקוי וחיטוי המכשיר
   הערה: לפתרון בעיות כלליות ולהערות אחרות במחשב, עיין בטבלה משלימה 2.
   1. כבה את המכשיר באמצעות מתג ההפעלה הראשי. נתק את תקע החשמל מספק הכוח.
   2. פתחו את הדלת ונקו וחטאו את כל המשטחים הנגישים של המכשיר, כולל כבל החשמל, באמצעות מטלית לחה וחומרי הניקוי המומלצים.
   3. בדוק את פיר הרוטור עבור נזק. בדוק את המכשיר עבור קורוזיה ונזק.
   4. חבר את המכשיר לספק הכוח רק אם הוא יבש לחלוטין מבפנים ומבחוץ.
3. נתקו את תקע החשמל הראשי והסירו את מחזיק הנתיכים. מחזיק הנתיך ממוקם מעל שקע החשמל. החלף את הנתיך המשומש בנתיך רזרבי מהמיכל.

תוצאות

המטרה של טכניקה זו היא לבודד בקלות ובאופן אוטומטי חומרים הקשורים לסרטן מדם שלם. בפרט, כל אחד יכול להשתמש בטכניקה זו בכל תחומי המחקר והניתוח המתאימים. ההפרדה בו זמנית וניתנת לשחזור של חומרים מרובים בדגימת דם אחת היא משמעותית בביופסיות נוזליות. דיסקיות LBx-1 ו- LBx-2 משמשות לבידוד פלזמה וציפוי בא...

Discussion

הכמות והריכוז של cfDNA ו- CTC תלויים באדם, בשלב ובסוג הסרטן. זה גם תלוי במצבו של המטופל 2,4,5,10,20. בפרט, בשלבים המוקדמים או הטרום סרטניים של סרטן, הריכוזים של חומרים הקשורים לסרטן הם נמוכים מאוד, ולכן קיימת אפש...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% BSA (Bovine Serum Albumin)	Sigma-Aldrich	A3059
1.5 mL Microcentrifuge Tube	Axygen	MCT-150-C-S
15 mL Conical Tube	SPL	50015
4150 TapeStation System	Agilent	G2992AA	Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633)
Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit	Apostle	A17622-250	5 mL X 50 preps version
BD Vacutainer blood collection tubes	BD	367525	EDTA Blood Collection Tube (10 mL)
BioViewCCBS	Clinomics		BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment
CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610	Invitrogen	MHCD4522
FAST Auto cartridge	Clinomics	CLX-M3001
LBx-1 cartridge	Clinomics	CLX-M4101
LBx-2 cartridge	Clinomics	CLX-M4201
OPR-2000 instrument	Clinomics	CLX-I2001
Cover Glass	Marienfeld Superior	HSU-0101040
DynaMag 2 Magnet Stand	Thermo Fisher Scientific	12321D
Ficoll Paque Solution	GE healthcare	17-1440-03	density gradient solution
Filter Tip, 10 µL	Axygen	AX-TF-10	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
Filter Tip, 200 µL	Axygen	AX-TF-200	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
Filter Tip, 100 µL	Axygen	AX-TF-100	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
Filter Tip, 1000 µL	Axygen	AX-TF-1000	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody	BioLegend	324204
FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin	BD Biosciences	347653
Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O)	Sigma Aldrich	433284
Kimtech Science Wipers	Yuhan-Kimberly	41117
Latex glove	Microflex	63-754
Magnetic Bead Separation Rack	V&P Scientific	VP 772F2M-2
Manual Pipetting  (0.5-10 µL)	Eppendorf	3120000020
Manual Pipetting  (2-20 µL)	Eppendorf	3120000038
Manual Pipetting  (10-100 µL)	Eppendorf	3120000046
Manual Pipetting  (20-200 µL)	Eppendorf	3120000054
Manual Pipetting  (100-1000 µL)	Eppendorf	3120000062
Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield	abcam	ab104139
Normal Human IgG Control	R&D Systems	1-001-A
OLYMPUS BX-UCB	Olympus	9217316
Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488	Invitrogen	53-9003-82
PBS (Phosphate Buffered Saline Solution)	Corning	21-040CVC
Portable Pipet Aid	Drummond	4-000-201
Slide Glass	Marienfeld Superior	HSU-1000612
StainTray Staining box	Simport	M920
Sterile Serological Pipette (10 mL)	SPL	91010
Triton X-100 solution	Sigma Aldrich	93443
TWEEN 20	Sigma Aldrich	P7949
Whole Blood			Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary.
X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator)	Excelitas	010-00157