임상 샘플에서 암 관련 물질의 자동 분리 및 수집

요약

이 백서에서는 전혈에서 무세포 DNA 및 순환 종양 세포와 같은 물질을 쉽고 효율적으로 분리하고 수집하기 위한 자동화 장비의 적용에 대해 설명합니다.

초록

최근에는 암을 비롯한 다양한 질병을 진단하기 위해 액체 생검이 사용되었습니다. 체액에는 정상 조직에서 유래한 세포, 단백질 및 핵산을 포함한 많은 물질이 포함되어 있지만 이러한 물질 중 일부는 질병 부위에서도 유래합니다. 체액에서 이러한 물질의 조사 및 분석은 다양한 질병의 진단에 중추적인 역할을 합니다. 따라서 필요한 물질을 정확하게 분리하는 것이 중요하며,이를 위해 여러 기술이 개발되었습니다.

우리는 CD-PRIME이라는 랩 온 어 디스크 유형의 장치 및 플랫폼을 개발했습니다. 이 장치는 자동화되어 있으며 시료 오염 및 시료 안정성에 대해 우수한 결과를 제공합니다. 또한 우수한 획득 수율, 짧은 작동 시간 및 높은 재현성의 장점이 있습니다. 또한, 장착할 디스크의 종류에 따라, 무세포 DNA를 포함하는 혈장, 순환 종양 세포, 말초 혈액 단핵 세포 또는 버피 코트가 분리될 수 있다. 따라서, 체액에 존재하는 다양한 물질의 획득은 오믹스의 연구를 포함하는 다양한 다운스트림 응용을 위해 수행될 수 있다.

서문

암을 포함한 다양한 질병의 조기에 정확한 발견은 치료 전략 ^1,2,3,4를 수립하는 데 가장 중요한 요소입니다. 특히, 암의 조기 발견은 환자 ^5,6,7,8의 생존 기회 증가와 밀접한 관련이 있습니다. 최근에는 암의 조기 발견을 위해 액체 생검이 각광을 받고 있습니다. 고형 종양은 혈관 신생을 겪고 다양한 물질을 혈액으로 방출합니다. 특히, 암 환자의 혈액에서 순환 DNA (ctDNA), 순환 RNA (ctRNA), 단백질, 엑소 좀과 같은 소포 및 순환 종양 세포 (CTC)가 발견되었습니다 ^2,9. 이러한 물질의 양에는 차이가 있지만 초기 단계뿐만 아니라 후기 단계 ^6,10에서도 일관되게 관찰됩니다. 그러나 이러한 개인차는 매우 높습니다. 예를 들어, ctDNA를 함유하는 무세포 DNA (cfDNA)의 양은 1,000 ng 미만이고, CTC의 수는 암 환자 11,12,13의 전혈 10 mL 중 ¹⁰⁰ 개 미만이다. 많은 연구에서 적은 양으로 존재하는 이러한 물질(즉, cfDNA, ctDNA 및 CTC)을 사용하여 암을 특성화했습니다. 정확한 결과를 얻으려면 고순도^13,14로 소량의 물질을 정확하게 분리하는 것이 중요합니다. 종래의 원심분리 방법이 일반적으로 사용되지만 사용자의 기술에 따라 취급이 어렵고 순도가 낮습니다. CTC의 발견 이후, 원심분리 또는 밀도 등급 분리, 면역비드 및 미세유체 방법과 같은 여러 분리 기술이 개발되었습니다. CTC가 발견된 이후 몇 가지 격납 기술이 개발되었습니다. 그러나, 이들 기술은 세포를 단리하는데 사용되는 다양한 칩 및 멤브레인으로부터 세포를 단리할 필요가 있을 때 종종 제한된다(¹⁵). 또한 태깅 방식에는 FACS와 같은 장비가 필요하며, 태깅 오염으로 인해 다운스트림 공정에 한계가 있습니다.

최근에는 액체 생검의 사용이 증가하고 암의 조기 발견을위한 다양한 연구가 진행되고 있습니다. 이 방법은 간단하지만 다운 스트림 분석에는 여전히 어려움이 있으며 이러한 어려움을 극복하기 위해 다양한 연구가 시도되고 있습니다^16,17. 또한 병원을 포함한 많은 현장에서는 사용하기 편리한 자동화되고 재현 가능한 고순도 분석법이 필요합니다. 여기에서 우리는 액체 생검 후 혈액 샘플에서 물질을 자동으로 분리하기 위한 랩-온-어-디스크를 개발했습니다. 이러한 장치는 원심분리, 미세유체공학 및 기공 크기의 세포 포획 원리를 기반으로 합니다. 디스크에는 세 가지 유형이 있습니다 : LBx-1은 혈장 및 버피 코트를 얻을 수 있고 LBx-2는 10mL 미만의 부피로 전혈에서 혈장 및 PBMC를 얻을 수 있습니다. FAST-auto는 디스크에서 제거 가능한 멤브레인을 사용하여 CTC를 획득 할 수도 있습니다. 한 번에 최대 4개의 디스크를 사용할 수 있습니다. 무엇보다도 이 장치 및 방법의 장점은 소량의 혈액을 이용하여 동일한 시료로부터 다양한 암 유래 물질을 얻을 수 있다는 점이다. 이것은 환자의 혈액을 한 번만 채취하면된다는 것을 의미합니다. 또한 혈액 채취 기간의 차이로 인한 오류를 배제할 수 있는 장점이 있습니다. 이 플랫폼은 사용하기 쉽고 액체 생검 및 다운스트림 응용 분야에 대한 정확한 결과를 제공합니다. 이 프로토콜에서는 장치 및 카트리지의 사용법이 소개됩니다.

프로토콜

모든 전혈 샘플은 폐암 환자로부터 수득하였다. 클라이노믹스의 연구 및 분석은 암유전체학연구소에서 수행하며, 정부의 IRB 연구 승인은 서울아산의료원 기관심의위원회(IRB NO. 2021-0802)가 주도하고 있으며, IRB 번호는 클라이노믹스에 등록되어 있습니다.

1. 샘플 준비

1. 9mL의 전혈을 EDTA 또는 cfDNA 안정 혈액 수집 튜브에 수집합니다.
2. 튜브를 위아래로 약 10회 뒤집어 잘 섞는다.
3. 샘플을 실온(RT, 단기 보관용) 또는 4°C(장기 보관용)에서 보관하십시오. 얼거나 해동하지 마십시오.

2. 장치 준비

1. 전원 스위치를 눌러 기기를 켭니다.
   참고: 터치패드에 로딩 화면이 나타나고 기기가 초기화됩니다. 초기화하는 동안 악기에서 손을 떼지 마십시오. 기기 초기화가 완료된 후 카트리지 선택 화면이 나타납니다.
2. 사용할 샘플 모드를 선택합니다. 화살표를 눌러 샘플 수를 변경합니다.

3. 장치 작동 및 샘플 수집

1. LBx-1 카트리지 적재
   1. 기기의 터치스크린 패널에서 카트리지 유형을 선택합니다. 화살표 버튼을 눌러 샘플 수를 변경합니다.
   2. 기기의 도어를 열고 사용할 모든 카트리지를 카트리지 홀더의 번호 순서대로 삽입합니다. 카트리지와 카트리지 홀더를 올바르게 삽입했는지 확인하십시오. 카트리지를 올바르게 삽입하지 않으면 기기가 크게 손상될 수 있습니다.
   3. 총 4개의 카트리지의 경우 카트리지 홀더의 빈 공간에 더미 카트리지를 놓습니다.
   4. 지지 휠을 사용하여 카트리지를 장착하고 잠금 너트를 조여 고정합니다.
   5. 도어를 닫고 터치패드 화면의 RUN 버튼을 누릅니다. 기기는 카트리지의 밸브를 닫으며 약 30 초가 걸립니다.
   6. 메시지에 따라 도어를 열고 지지 휠을 제거한 다음 카트리지 홀더에서 밸브 닫힘 카트리지를 제거합니다.
   7. 카트리지를 테이블 위에 놓고 전혈 샘플을 주입 할 준비를하십시오. 혈청학적 피펫을 사용하여 최대 10mL의 전혈 샘플을 피펫팅합니다.
      주의: 피를 만질 때의 위험성. 혈액 샘플 및 시약을 취급하는 전체 과정에서 실험실 코트와 실험실 장갑을 착용하는 것이 중요합니다. 제공된 MSDS는 실험실 작업자가 철저히 연구해야 합니다.
   8. 피펫 팁을 카트리지의 샘플 입구 깊숙이 삽입하고 전혈 샘플을 천천히 주입합니다.
      노트 9mL 이상의 전혈 샘플을 사용하는 경우 인산염 완충 식염수(PBS)를 추가할 필요가 없습니다. 9mL 미만의 전혈 샘플을 사용하는 경우 PBS를 추가하여 총 부피를 9mL로 만듭니다. 예를 들어, 7.2mL의 전혈을 사용하는 경우 1.8mL의 PBS를 샘플 입구에 추가하십시오. 혈청 학적 피펫 또는 피펫 팁은 전혈 및 PBS 주입에 사용할 수 있습니다. 8mL 미만의 전혈 검체를 사용하는 경우 PBS 1mL를 추가해도 버피 코트가 회복되지 않을 수 있습니다. gDNA 전처리를 위해, 이 단계 전에 분리된 200 μL의 전혈을 사용한다.
   9. 사용할 카트리지를 카트리지 홀더의 번호 순서대로 삽입합니다. 지지 휠을 사용하여 카트리지를 장착하고 잠금 너트를 조여 고정합니다. 도어를 닫고 OK 버튼을 누릅니다.
      알림: 혈장과 버피 코트는 전혈에서 자동으로 분리되며 약 30분이 소요됩니다.
      주의 작동 중 위험. 고속 회전 작업 중에 도어를 열거 나 기기를 만지면 심각한 부상을 입을 수 있습니다. 로터의 비대칭 하중으로 인한 부상의 위험도 있습니다. 기기가 보조 셀 농축 또는 전문가 모드에서 시작될 때 비정상적인 진동과 소음이 발생하면 카트리지 배치가 비대칭일 수 있습니다. 즉시 전원 키를 눌러 카트리지를 중지하고 올바르게 설치하십시오.
   10. 플라즈마와 버피 코트의 분리가 완료되면 나타나는 알람 소리와 함께 화면에서 메시지를 찾으십시오.
   11. 도어를 열거나 STOP 버튼을 눌러 알람을 중지하십시오. 도어를 열고 카트리지를 제거한 다음 테이블 위에 놓습니다.
   12. 1mL 피펫 팁을 사용하여 혈장 배출구에서 3mL의 혈장을 회수합니다. 1mL 피펫 팁을 사용하여 버피 코트 배출구에서 3mL의 버피 코트를 회수합니다.
2. LBx-2 카트리지 넣기
   1. 기기의 터치스크린 패널에서 카트리지 이름을 선택합니다. 화살표 버튼을 눌러 샘플 수를 변경합니다.
   2. 도어를 열고 사용할 카트리지를 카트리지 홀더의 번호 순서대로 삽입합니다.
   3. 총 4개의 카트리지의 경우 카트리지 홀더의 빈 공간에 더미 카트리지를 놓습니다.
   4. 지지 휠을 사용하여 카트리지를 장착하고 잠금 너트를 조여 고정합니다. 카트리지 홀더에 카트리지를 올바르게 삽입했는지 확인하십시오. 카트리지를 올바르게 삽입하지 않으면 기기가 크게 손상될 수 있습니다.
   5. 도어를 닫고 터치패드 화면의 RUN 버튼을 누릅니다. 기기는 카트리지의 밸브를 닫으며 약 30 초가 걸립니다.
   6. 메시지에 따라 도어를 열고 지지 휠을 제거한 다음 카트리지 홀더에서 밸브 닫힘 카트리지를 제거하고 테이블 위에 놓습니다.
   7. 카트리지를 테이블 위에 놓고 밀도 구배 용액과 전혈 샘플을 주입할 준비를 합니다. 전혈 시료의 부피에 따라 주입되는 농도구배 용액과 PBS의 부피를 확인하였다(보충표 1).
   8. 혈청학적 피펫을 사용하여 밀도 구배 용액을 피펫팅한다. 피펫 팁을 카트리지 입구 깊숙이 삽입하고 밀도 구배 용액을 천천히 주입합니다.
   9. 밀도 구배 용액을 주입한 후, 혈청학적 피펫을 사용하여 전혈 샘플을 피펫팅한다. 피펫 팁을 카트리지의 샘플 입구 깊숙이 삽입하고 전혈 샘플을 천천히 주입합니다.
      참고: 9mL 미만의 전혈 샘플을 사용하는 경우 이 표(보충 표 1)를 참조하여 PBS를 추가합니다.
   10. 사용할 카트리지를 카트리지 홀더의 번호에 따라 순서대로 삽입합니다. 지지 휠을 사용하여 카트리지를 장착하고 잠금 너트를 조여 고정합니다. 도어를 닫고 OK 버튼을 누릅니다.
   11. 혈장과 PBMC는 대략 30 분이 걸리는 전혈에서 자동적으로 분리됩니다. 경보음과 함께 나타나는 메시지를 찾습니다., 플라즈마와 PBMC의 분리가 완료될 때.
   12. 도어를 열거나 STOP 버튼을 눌러 알람을 중지하십시오. 도어를 열고 카트리지를 제거한 다음 테이블 위에 놓습니다.
   13. 1mL 피펫 팁을 사용하여 혈장 배출구에서 3mL의 혈장을 회수합니다. 1mL 피펫 팁을 사용하여 PBMC 출구로부터 PBMC의 3mL를 회수한다.
3. FAST-자동 카트리지 넣기
   1. 기기의 터치 스크린 패널에서 카트리지를 선택합니다. 화살표 버튼을 눌러 샘플 수를 변경합니다.
   2. 도어를 열고 사용할 카트리지를 카트리지 홀더의 번호 순서대로 삽입합니다. 총 4개의 카트리지의 경우 카트리지 홀더의 빈 공간에 더미 카트리지를 놓습니다.
   3. 지지 휠을 사용하여 카트리지를 장착하고 잠금 너트를 조여 고정합니다.
   4. 도어를 닫고 터치패드 화면의 RUN 버튼을 누릅니다. 기기는 카트리지의 밸브를 닫으며 약 30 초가 걸립니다.
   5. 메시지에 따라 도어를 열고 지지 휠을 제거한 다음 카트리지 홀더에서 밸브 닫힘 카트리지를 제거합니다.
   6. 카트리지를 테이블 위에 놓고 PBS 용액과 전혈 샘플을 주입할 준비를 합니다. 혈청학적 피펫을 사용하여 PBS 용액 6mL를 피펫팅합니다. 피펫 팁을 카트리지의 PBS 입구 깊숙이 삽입하고 PBS 용액 6mL를 천천히 주입합니다.
   7. PBS 용액을 주입한 후, 혈청학적 피펫을 사용하여 LBx-2로부터 수득한 전혈 또는 PBMC 샘플 3 mL를 피펫팅하고, 잔류물의 점착을 방지하기 위해 1% BSA로 미리 헹구었다. 피펫 팁을 카트리지의 샘플 입구 깊숙이 삽입하고 전혈 샘플을 천천히 주입합니다.
   8. 사용할 카트리지를 카트리지 홀더의 번호 순서대로 삽입합니다. 지지 휠을 사용하여 카트리지를 장착하고 잠금 너트를 조여 고정합니다. 도어를 닫고 OK 버튼을 누릅니다.
   9. CTC는 전혈에서 자동으로 농축되며 약 15분이 소요됩니다. CTC의 보강이 완료되면 경보음과 함께 나타나는 메시지를 찾습니다. 도어를 열거나 STOP 버튼을 눌러 알람을 중지하십시오.
   10. 도어를 열고 카트리지를 제거한 다음 테이블 위에 놓습니다. 후면판 제거제(BPR)를 카트리지 전면에 있는 4개의 구멍에 삽입합니다. 양손의 엄지 손가락으로 진한 파란색 날개를 누른 다음 연한 파란색 몸체가 딸깍 소리가 날 때까지 누릅니다.
   11. 카트리지 본체를 들어 올려 조심스럽게 제거합니다. 핀셋을 사용하여 가장자리로 필터 멤브레인을 매우 부드럽게 들어 올립니다. 필터 멤브레인의 외부 테두리(1mm 너비 가장자리 부분)를 사용하여 필터 멤브레인을 꼬집고 잡으십시오.
   12. 핵산 준비를 위해 필터 멤브레인(농축 CTC가 상주하는 곳)을 1.5mL 튜브에 조심스럽게 넣습니다. 필요한 경우 여과된 혈액을 1mL 피펫 팁을 사용하여 혈액 배출구로 회수합니다.

4. 시스템 유지 보수

1. 기기의 청소 및 소독 준비
   1. 장비와 액세서리의 접근 가능한 모든 표면은 에탄올과 건조 티슈를 사용하여 일주일에 한 번 청소하고 오염된 경우에도 즉시 청소하십시오.
   2. 알코올 (에탄올 및 이소프로판올) 또는 알코올 기반 소독제를 사용하여 보울과 로터 샤프트를 정기적으로 청소하십시오.
2. 기기 청소 및 소독
   참고: 기기에 대한 일반적인 문제 해결 및 기타 참고 사항은 보충 표 2를 참조하십시오.
   1. 주전원 스위치를 사용하여 기기를 끕니다. 전원 공급 장치에서 전원 플러그를 뽑습니다.
   2. 문을 열고 광고로 전원 케이블을 포함하여 기기의 접근 가능한 모든 표면을 청소하고 소독하십시오.amp 천과 권장 세척제.
   3. 로터 샤프트가 손상되지 않았는지 확인하십시오. 기기의 부식 및 손상 여부를 검사하십시오.
   4. 기기가 내부와 외부가 완전히 건조한 경우에만 전원 공급 장치에 연결하십시오.
3. 주 전원 플러그를 뽑고 퓨즈 홀더를 제거하십시오. 퓨즈 홀더는 전원 소켓 위에 있습니다. 사용한 퓨즈를 컨테이너의 예비 퓨즈로 교체하십시오.

결과

이 기술의 목표는 전혈에서 암 관련 물질을 쉽고 자동으로 분리하는 것입니다. 특히 누구나 모든 적합한 연구 및 분석 분야에서이 기술을 사용할 수 있습니다. 단일 혈액 샘플에서 여러 물질을 동시에 재현 가능하게 분리하는 것은 액체 생검에서 중요합니다. LBx-1 및 LBx-2 디스크는 전혈에서 혈장 및 버피 코트 또는 PBMC를 분리하는 데 사용됩니다. 그림 1 은이 장치의 적용에 ?...

토론

cfDNA와 CTC의 양과 농도는 암의 개인, 단계 및 유형에 따라 다릅니다. 또한 환자 2,4,5,10,20의 상태에 따라 다릅니다. 특히 암의 초기 또는 전암기에서는 암 관련 물질의 농도가 매우 낮아 검출이 불가능할 가능성이 높다. 그럼에도 불구하고 조기 발견은 환자의 생존 및 치료 전?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% BSA (Bovine Serum Albumin)	Sigma-Aldrich	A3059
1.5 mL Microcentrifuge Tube	Axygen	MCT-150-C-S
15 mL Conical Tube	SPL	50015
4150 TapeStation System	Agilent	G2992AA	Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633)
Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit	Apostle	A17622-250	5 mL X 50 preps version
BD Vacutainer blood collection tubes	BD	367525	EDTA Blood Collection Tube (10 mL)
BioViewCCBS	Clinomics		BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment
CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610	Invitrogen	MHCD4522
FAST Auto cartridge	Clinomics	CLX-M3001
LBx-1 cartridge	Clinomics	CLX-M4101
LBx-2 cartridge	Clinomics	CLX-M4201
OPR-2000 instrument	Clinomics	CLX-I2001
Cover Glass	Marienfeld Superior	HSU-0101040
DynaMag 2 Magnet Stand	Thermo Fisher Scientific	12321D
Ficoll Paque Solution	GE healthcare	17-1440-03	density gradient solution
Filter Tip, 10 µL	Axygen	AX-TF-10	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
Filter Tip, 200 µL	Axygen	AX-TF-200	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
Filter Tip, 100 µL	Axygen	AX-TF-100	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
Filter Tip, 1000 µL	Axygen	AX-TF-1000	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody	BioLegend	324204
FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin	BD Biosciences	347653
Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O)	Sigma Aldrich	433284
Kimtech Science Wipers	Yuhan-Kimberly	41117
Latex glove	Microflex	63-754
Magnetic Bead Separation Rack	V&P Scientific	VP 772F2M-2
Manual Pipetting  (0.5-10 µL)	Eppendorf	3120000020
Manual Pipetting  (2-20 µL)	Eppendorf	3120000038
Manual Pipetting  (10-100 µL)	Eppendorf	3120000046
Manual Pipetting  (20-200 µL)	Eppendorf	3120000054
Manual Pipetting  (100-1000 µL)	Eppendorf	3120000062
Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield	abcam	ab104139
Normal Human IgG Control	R&D Systems	1-001-A
OLYMPUS BX-UCB	Olympus	9217316
Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488	Invitrogen	53-9003-82
PBS (Phosphate Buffered Saline Solution)	Corning	21-040CVC
Portable Pipet Aid	Drummond	4-000-201
Slide Glass	Marienfeld Superior	HSU-1000612
StainTray Staining box	Simport	M920
Sterile Serological Pipette (10 mL)	SPL	91010
Triton X-100 solution	Sigma Aldrich	93443
TWEEN 20	Sigma Aldrich	P7949
Whole Blood			Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary.
X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator)	Excelitas	010-00157