一种基于四唑的可溶性还原测定，用于评估抗体对 热带念珠菌 生物膜的影响

摘要

本文描述了一种基于96孔微量滴定板的方案，使用2，3-双（2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基）-5-甲苯胺-2H-四唑（XTT）还原测定，以研究抗体对 热带梭菌形成的生物膜的影响。该 体外 方案可用于检查潜在的新抗真菌化合物对生物膜中 念珠菌 属细胞代谢活性的影响。

摘要

念珠菌 属是系统性院内感染的第四大常见原因。全身性或侵袭性念珠菌病通常涉及植入装置或导管上的生物膜形成，这与毒力和死亡率增加有关。由不同 念珠菌 物种产生的生物膜对各种抗真菌药物表现出增强的抗性。因此，有必要开发针对 念珠菌 生物膜的有效免疫疗法或辅助治疗。虽然细胞免疫在抗念珠菌 保护中的作用已得到充分证实，但体液免疫的作用研究较少。

据推测，抑制生物膜形成和成熟是保护性抗体的主要功能之一，白色念珠菌胚管抗体（CAGTA）已被证明可以更早地抑制白色念珠菌的体外生长和生物膜形成。本文概述了评估抗体对热带梭菌形成的生物膜的作用的详细方案。该协议的方法涉及在96孔微量滴定板中形成热带梭菌生物膜，然后在存在或不存在抗原特异性抗体的情况下孵育，然后进行2，3-双（2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基）-5-羧苯胺-2H-四唑（XTT）测定，用于测量生物膜中真菌细胞的代谢活性。

通过使用适当的血清对照（包括去除Sap2特异性抗体的血清）证实了特异性。结果表明，免疫动物血清中存在的抗体可以在体外抑制念珠菌生物膜成熟。总之，本文为抗体在开发侵袭性念珠菌病期间针对生物膜的新型免疫疗法和协同或辅助治疗的潜力提供了重要的见解。该体外方案可用于检查潜在的新抗真菌化合物对生物膜中念珠菌属细胞代谢活性的影响。

引言

系统性念珠菌病是院内感染的第四大原因，与全世界的高发病率和死亡率有关。在全球范围内，系统性念珠菌病影响约70万人¹。念珠菌属，即白色念珠菌、热带念珠菌、副念珠菌、光滑念珠菌和耳念珠菌，是侵袭性 念珠菌感染的最常见原因²。念珠菌属是产生生物膜的机会性病原体³.生物膜主要与念珠菌毒力有关，念珠菌可以通过诱导生物膜形成来承受氧化和渗透应激条件⁴。生物膜进一步调节毒力因子和细胞壁成分的表达，形成外聚物保护基质，帮助念珠菌适应不同的宿主生态位⁴。生物膜有助于酵母粘附在宿主组织和医疗器械上⁵.因此，生物膜的形成与酵母的优势有关，因为生物膜内的酵母细胞可以逃避宿主免疫反应⁶。生物膜的形成还可以保护致病酵母免受抗真菌药物的作用⁵。Pierce等人已经证明了白色念珠菌生物膜对两性霉素B的敏感性降低7^，....

研究方案

BALB / c小鼠被饲养在IIT Roorkee的小动物设施中。将所有动物保持在25°C的12h：12h光：暗循环中，并随意提供颗粒日粮 和水。所有动物程序均由IIT Roorkee的机构动物伦理委员会（IAEC）批准。

1.热带梭菌的制备

注意： 真菌热带念珠菌 属于风险组 2 病原体，被归类为 BSL2 微生物。在处理 念珠菌 物种时，请始终使用经过认证的II类生物安全柜。在处理 热带梭菌 期间练习无菌和无菌技术，并遵循推荐的生物安全程序以正确处置这种病原体。

1. 将 热带梭 菌（菌株 ATCC 750）划到萨伯罗葡萄糖 （SAB） 琼脂平板上。
2. 通过将来自 SAB 琼脂平板的单个菌落接种到含有 10 mL SAB 肉汤培养基的无菌 50 mL 锥形管中，制备过夜生长的 热带梭菌 培养物。或者，使用 热带梭菌 的冷冻甘油原液，并将 100 μL 甘油原液接种到含有 50 mL SAB 肉汤培养基的无菌 250 mL 锥形烧瓶中。
3. 在30°C的轨道振荡器中以180rpm孵育C . tropicalis 培养物24-48小时。
4. 在21°C下以2，150....

结果

热带念珠菌 生物膜在96孔微量滴定板中生长，并使用倒置显微镜以40倍成像（图1A）。使用结晶紫进一步染色生物膜，并使用倒置显微镜在40x下观察（图1B）。扫描电子显微镜显示 热带梭菌 生物膜的代表性图像（图1C）。为了进行生物膜抑制测定，按照布局，在时间0将10⁵ 个 念珠菌 细胞添加到96孔微量?.......

讨论

由念珠菌属引起的真菌感染与全世界的高发病率和死亡率有关。侵袭性真菌感染的威胁日益严重，因此需要及早管理这种危及生命的疾病。大多数念珠菌感染涉及生物膜的形成，生物膜粘附在各种医疗设备上，并导致医院环境中真菌感染的持续和复发³¹。生物膜由酵母或菌丝细胞组成，它们对大多数常规抗真菌药物表现出相当大的抗性³²。念珠?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical centrifuge tubes	BD Falcon	546021
1x PBS	-	Prepared in lab	NaCl : 4 g KCl : 0.1 g Na2HPO4:  0.72 g KH2PO4 : 0.12 g Water 500 mL. Adjust pH to 7.4
50 mL conical centrifuge tubes	BD Falcon	546041
96-well microtiter plates	Nunc	442404
Incubator	Generic
Menadione	Sigma	M5625
Microtiter Plate Reader	Generic
Multichannel pipette and tips	Generic
Petri dishes	Tarson	460090
Ringers Lactate	-	Prepared in lab	sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0
RPMI 1640 MOPS	Himedia	AT180
Sabouraud dextrose Agar	SRL	24613
Sabouraud dextrose Broth	SRL	24835
XTT	Invitrogen	X6493