一种基于四唑的可溶性还原测定，用于评估抗体对 热带念珠菌 生物膜的影响

摘要

本文描述了一种基于96孔微量滴定板的方案，使用2，3-双（2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基）-5-甲苯胺-2H-四唑（XTT）还原测定，以研究抗体对 热带梭菌形成的生物膜的影响。该 体外 方案可用于检查潜在的新抗真菌化合物对生物膜中 念珠菌 属细胞代谢活性的影响。

摘要

念珠菌 属是系统性院内感染的第四大常见原因。全身性或侵袭性念珠菌病通常涉及植入装置或导管上的生物膜形成，这与毒力和死亡率增加有关。由不同 念珠菌 物种产生的生物膜对各种抗真菌药物表现出增强的抗性。因此，有必要开发针对 念珠菌 生物膜的有效免疫疗法或辅助治疗。虽然细胞免疫在抗念珠菌 保护中的作用已得到充分证实，但体液免疫的作用研究较少。

据推测，抑制生物膜形成和成熟是保护性抗体的主要功能之一，白色念珠菌胚管抗体（CAGTA）已被证明可以更早地抑制白色念珠菌的体外生长和生物膜形成。本文概述了评估抗体对热带梭菌形成的生物膜的作用的详细方案。该协议的方法涉及在96孔微量滴定板中形成热带梭菌生物膜，然后在存在或不存在抗原特异性抗体的情况下孵育，然后进行2，3-双（2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基）-5-羧苯胺-2H-四唑（XTT）测定，用于测量生物膜中真菌细胞的代谢活性。

通过使用适当的血清对照（包括去除Sap2特异性抗体的血清）证实了特异性。结果表明，免疫动物血清中存在的抗体可以在体外抑制念珠菌生物膜成熟。总之，本文为抗体在开发侵袭性念珠菌病期间针对生物膜的新型免疫疗法和协同或辅助治疗的潜力提供了重要的见解。该体外方案可用于检查潜在的新抗真菌化合物对生物膜中念珠菌属细胞代谢活性的影响。

引言

系统性念珠菌病是院内感染的第四大原因，与全世界的高发病率和死亡率有关。在全球范围内，系统性念珠菌病影响约70万人¹。念珠菌属，即白色念珠菌、热带念珠菌、副念珠菌、光滑念珠菌和耳念珠菌，是侵袭性 念珠菌感染的最常见原因²。念珠菌属是产生生物膜的机会性病原体³.生物膜主要与念珠菌毒力有关，念珠菌可以通过诱导生物膜形成来承受氧化和渗透应激条件⁴。生物膜进一步调节毒力因子和细胞壁成分的表达，形成外聚物保护基质，帮助念珠菌适应不同的宿主生态位⁴。生物膜有助于酵母粘附在宿主组织和医疗器械上⁵.因此，生物膜的形成与酵母的优势有关，因为生物膜内的酵母细胞可以逃避宿主免疫反应⁶。生物膜的形成还可以保护致病酵母免受抗真菌药物的作用⁵。Pierce等人已经证明了白色念珠菌生物膜对两性霉素B的敏感性降低7^，8。此外，生物膜显示出对氟康唑的抗真菌药物耐药性，这损害了系统性念珠菌病的有效管理^9，10。

微生物具有粘附在各种生物和非生物表面的内在倾向，从而导致生物膜的形成。 白色念珠菌是一种二态性真菌，以酵母和菌丝形式存在，其生物膜形成已在各种体外和体内模型系统中表征¹¹。生物膜形成的步骤包括念珠菌细胞与底物的粘附、细丝化、增殖和生物膜成熟¹¹。最初，白色念珠菌的酵母形式粘附在基质上，包括医疗器械和人体组织，然后是白色念珠菌的丝化和增殖成菌丝和假菌丝形式，最后是嵌入细胞外基质的生物膜成熟¹¹。生物膜的形成在很大程度上有助于白色念珠菌的发病机制¹²。念珠菌物种形成耐药生物膜，这使得根除它们具有挑战性¹³。白色念珠菌生物膜产生人群的一小部分已被描述为对抗真菌药物两性霉素 B 和氯己定¹⁴ 具有高度耐药性。值得注意的是，与浮游阶段和增殖阶段的酵母细胞相比，生物膜中的酵母细胞对多药治疗表现出高抗性¹⁴。有人提出，存在于生物膜中的酵母细胞对抗真菌药物具有高度耐受性，这有助于白色念珠菌在生物膜中的存活¹⁴。据报道，这些现有细胞是白色念珠菌的表型变体，而不是突变体¹⁴。此外，被称为"持久细胞"的念珠菌生物膜细胞可耐受高剂量的两性霉素-B治疗并有助于念珠菌存活，从而对高风险个体反复出现的全身性念珠菌感染构成巨大负担¹⁵。

念珠菌菌株中抗真菌耐药性的增加需要研究新的抗真菌药物和免疫疗法。从上述研究中可以明显看出，念珠菌生物膜显示出对抗真菌药物的敏感性降低。因此，需要改进免疫疗法来控制念珠菌生物膜的形成。早期的研究表明，CAGTA可以通过在体外抑制白色念珠菌生物膜的形成来提供有效的保护，以防止全身性念珠菌感染¹⁶。另一项研究报告说，用白色念珠菌rAls3-N蛋白免疫小鼠诱导高抗体滴度，干扰白色念珠菌生物膜的体外形成¹⁷。 抗Als3-N抗体也对白色念珠菌从生物膜中扩散产生抑制作用¹⁷。基于白色念珠菌的NDV-3A疫苗目前正在临床试验中，还发现抗NDV-3A血清可减少耳念珠菌生物膜的形成¹⁸。最近的一项研究发现，Sap2抗体抑制生物膜形成是系统性念珠菌病小鼠模型中的保护机制¹⁹。

本文概述了详细的 体外 方案，用于评估从不同组Sap2疫苗接种小鼠获得的多克隆血清中存在的抗原特异性抗体对预制热带 念珠菌 生物膜的影响。为了实现这一目标，在实验室中优化并开发了一种基于XTT还原测定的方法，该方法可以在存在或不存在抗体的情况下以快速，灵敏和高通量的方式测量生物膜活力。

XTT 测定用于测量细胞代谢活性，作为细胞活力、细胞增殖和细胞毒性的指标²⁰。该比色测定基于通过代谢活性细胞将黄色四唑盐钠 3'-[1-（苯氨基羰基）-3，4-四唑]-双（4-甲氧基-6-硝基）苯磺酸水合物 （XTT） 还原为橙色甲臜染料。由于只有活细胞才能降低XTT，因此还原的XTT甲臜的量与颜色强度和细胞活力成正比。形成的甲臜染料是水溶性的，使用酶标仪直接定量。由于其水溶性，XTT测定允许研究完整的生物膜，以及检查生物膜药物敏感性，而不会破坏生物膜结构²¹。此外，该方法由于其易用性、速度、准确性、高通量和高重现性而用于念珠菌真菌活力评估7^，22。

除了 XTT 还原测定外，还确定了用于测量生物膜数量的许多替代技术。其中一些包括使用 MTT 还原测定、结晶紫染色、DNA 定量、定量 PCR、蛋白质定量、干细胞重量测量和活菌落计数。这些程序在时间和成本要求方面差异很大。Taff 等人对七种不同的 念珠 菌生物膜定量测定进行了比较分析，发现 XTT 测定为 定量估计白色念珠菌 生物膜提供了最可重复、最准确和最有效的方法²³。结晶紫等染色技术有一定的局限性;结晶紫测试通过测量结晶紫染色的生物膜基质和细胞的光密度间接确定生物膜的量。尽管结晶紫测定提供了生物膜质量的良好测量，但它不能测量生物膜活力，因为它会染色微生物细胞和细胞外基质²⁴。Dhale等人进一步报告说，与结晶紫测定²⁵相比，XTT还原测定是检测生物膜产生的最灵敏，可重复，准确，有效和特异性的方法。文献报告表明，XTT 测定与 CFU 计数方法中的 CFU/mL 参数密切相关。然而，与XTT测定相比，CFU方法是劳动密集型且缓慢的²⁶。此外，分离的活细胞的比例可能不代表初始生物膜群²⁷。尽管 XTT 还原测定似乎是量化活力的最佳选择，但该技术存在一些局限性。虽然XTT方法对于涉及一种真菌菌株的比较很有用，但在比较不同的真菌菌株和物种时，其使用可能会受到限制。在没有详细标准化的情况下，菌株间比较可能很困难，因为不同的菌株代谢具有不同能力的底物²¹。

研究方案

BALB / c小鼠被饲养在IIT Roorkee的小动物设施中。将所有动物保持在25°C的12h:12h光:暗循环中，并随意提供颗粒日粮 和水。所有动物程序均由IIT Roorkee的机构动物伦理委员会（IAEC）批准。

1.热带梭菌的制备

注意: 真菌热带念珠菌 属于风险组 2 病原体，被归类为 BSL2 微生物。在处理 念珠菌 物种时，请始终使用经过认证的II类生物安全柜。在处理 热带梭菌 期间练习无菌和无菌技术，并遵循推荐的生物安全程序以正确处置这种病原体。

1. 将 热带梭 菌（菌株 ATCC 750）划到萨伯罗葡萄糖 （SAB） 琼脂平板上。
2. 通过将来自 SAB 琼脂平板的单个菌落接种到含有 10 mL SAB 肉汤培养基的无菌 50 mL 锥形管中，制备过夜生长的 热带梭菌 培养物。或者，使用 热带梭菌 的冷冻甘油原液，并将 100 μL 甘油原液接种到含有 50 mL SAB 肉汤培养基的无菌 250 mL 锥形烧瓶中。
3. 在30°C的轨道振荡器中以180rpm孵育C . tropicalis 培养物24-48小时。
4. 在21°C下以2，150× g 离心真菌培养物（对数期细胞）15分钟。
5. 弃去上清液，向沉淀中加入 50 mL 无菌 1x PBS。用温和的涡旋将沉淀洗涤并重悬于无菌 1x PBS 中。
6. 在21°C下再次以2，150× g 离心15分钟。 弃去上清液并将真菌沉淀重悬于 10 mL 无菌 1x PBS 中。
7. 通过用血细胞计数器计数来计算细胞浓度。
8. 在 RPMI 1640 吗啉丙烷磺酸 （MOPS） 培养基中以 1.0 × 10⁶ 个细胞/mL 的最终密度制备真菌原液。立即使用步骤1.6中的细胞悬液。
   注意:要设置一个 96 孔板，所需的总真菌原液体积为 10 mL（100 μL/孔）。根据需要进行扩展。

2. 热带梭菌 生物膜形成

1. 如前所述，在96孔平底聚苯乙烯微量滴定板中制备 念珠菌 生物膜（图1）^28，29。
2. 使用多通道移液器将 100 μL 热带 梭菌 培养物（来自 10⁶ 个细胞/mL 储备液，如上所述制备）添加到 96 孔微量滴定板中（图 2A）。通过不添加真菌细胞，将最后两列（11和12）保留为"无真菌加血清"和"无真菌和无血清"阴性对照。单独用 100 μL RPMI 1640 MOPS 培养基填充第 11 列和第 12 列。
3. 用盖子和铝箔盖住微量滴定板。在静止条件下将板在37°C孵育24小时。
4. 第二天，使用多通道移液器小心吸出培养基（不要接触或破坏生物膜）。在转印纸上以倒置位置轻轻敲击板以去除任何残留介质。
5. 使用多通道移液器用 200 μL 1x PBS（每孔）清洗板。沿着孔的侧壁非常温和地添加PBS，以避免破坏生物膜。使用多通道移液器小心吸出PBS。重复PBS洗涤2次（总共三次洗涤）。
6. 为了去除多余的PBS，在室温下在生物安全柜内风干板（没有盖子）30分钟。

3. 用抗体处理生物膜

注意:现在可以处理生物膜以评估抗体对生物膜成熟的抑制。小鼠血清用作多克隆抗体的来源。将不同组的Sap2免疫小鼠（Sap2-白色念珠菌，Sap2-热带和Sap2-副病）与假免疫小鼠一起进行眶后出血，并如前所述分离血清¹⁹。如前所述，使用Sap2特异性ELISA确认了抗Sap2抗体的存在¹⁹。

1. 使用前在56°C下对血清（多克隆抗体的来源）进行热灭活30分钟，以排除补体在抑制活性中的作用。在稀释血清之前加热灭活血清。
   注意:使用假免疫小鼠，免疫前小鼠和Sap2特异性抗体耗尽血清的血清作为附加对照¹⁹。根据先前的研究¹⁹制备抗体耗尽的血清。在该方案中测试的血清的连续稀释（1:25、1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1，600、1:3，200、1:6，400 和 1:12，800）中，观察到生物膜成熟的抑制在 1:25、1:50 和 1:100;因此，选择1:50以在抑制和血清消耗之间取得平衡。
2. 在无菌RPMI 1640 MOPS培养基（1:50）中制备热灭活血清样品的连续稀释液。对所有要测试的血清样品使用普通血清稀释液（1:50）以抑制生物膜成熟³⁰。
3. 向 96 孔微量滴定板的每个孔中加入 100 μL 所选血清稀释液。对于每个样品，按照随附的布局一式两份添加血清稀释液（图2B）。
   1. 在第10列中，不要添加血清稀释液;仅添加RPMI 1640 MOPS培养基作为 仅 真菌阳性对照。
      注意:第 10 列，G1-G8 和 H1-H8 行最初在 RPMI-MOPS 中具有真菌细胞。然而，虽然即使在24 h后将RPMI-MOPS添加到第10列，但G1-G8行作为PBS对照，H1-H8行作为24小时后无血清对照。
   2. 在第 11 列中，向所有孔中加入 1:50 的血清稀释液，作为 无真菌加血清阴性对照。
   3. 在第12栏中，不要向任何孔中添加血清稀释液;保持这是无 真菌无血清阴性对照。
4. 用盖子和铝箔盖住盘子。将板在37°C孵育24小时。

4. 生物膜代谢活性估计

1. 第二天，使用多通道移液管小心地吸出血清（不要接触或破坏生物膜）。在印迹纸上以倒置位置轻轻敲击板以去除任何残留的血清。
2. 使用多通道移液器用 200 μL 1x PBS（每孔）清洗板，沿孔侧壁添加 PBS 以避免破坏生物膜。使用多通道移液器小心地吸出PBS，并重复PBS洗涤2次（总共三次洗涤）。在室温下将板（不带盖子）风干30分钟，在生物安全柜内干燥任何多余的PBS。
3. XTT/甲萘醌的制备:
   1. 在无菌乳酸林格斯溶液中制备 XTT，作为 0.5 g/L 溶液。将 25 mg XTT 溶解在 50 mL 过滤灭菌的乳酸林格斯中。将10 mL分装在覆盖有铝箔的单独管中，并储存在-80°C。
   2. 准备甲萘醌作为10 mM储备液。将 8.6 mg 甲萘醌溶解在 5 mL 丙酮中，并将 50 μL 分布在 100 个单独的微管中。将等分试样储存在-80°C。
   3. 在使用前制备XTT/甲萘醌溶液，取10 mL XTT并加入1 μL甲萘醌以获得1 μM工作溶液。
4. 每孔 96 孔微量滴定板加入 100 μL XTT/甲萘醌溶液。用盖子和铝箔盖住盘子。将板在37°C下在黑暗中孵育2小时。
5. 将 80 μL 有色上清液从每个孔转移到新鲜的 96 孔板中。读取 490 nm 处的板。
6. 计算第10列（仅真菌阳性对照）中孔的吸光度值的平均值，该值将作为使用公式 （1）计算每个血清样品生物膜抑制百分比的参考值。
   % 生物膜抑制 = 100 - × 100 （1）

结果

热带念珠菌 生物膜在96孔微量滴定板中生长，并使用倒置显微镜以40倍成像（图1A）。使用结晶紫进一步染色生物膜，并使用倒置显微镜在40x下观察（图1B）。扫描电子显微镜显示 热带梭菌 生物膜的代表性图像（图1C）。为了进行生物膜抑制测定，按照布局，在时间0将10⁵ 个 念珠菌 细胞添加到96孔微量?...

讨论

由念珠菌属引起的真菌感染与全世界的高发病率和死亡率有关。侵袭性真菌感染的威胁日益严重，因此需要及早管理这种危及生命的疾病。大多数念珠菌感染涉及生物膜的形成，生物膜粘附在各种医疗设备上，并导致医院环境中真菌感染的持续和复发³¹。生物膜由酵母或菌丝细胞组成，它们对大多数常规抗真菌药物表现出相当大的抗性³²。念珠?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical centrifuge tubes	BD Falcon	546021
1x PBS	-	Prepared in lab	NaCl : 4 g KCl : 0.1 g Na2HPO4:  0.72 g KH2PO4 : 0.12 g Water 500 mL. Adjust pH to 7.4
50 mL conical centrifuge tubes	BD Falcon	546041
96-well microtiter plates	Nunc	442404
Incubator	Generic
Menadione	Sigma	M5625
Microtiter Plate Reader	Generic
Multichannel pipette and tips	Generic
Petri dishes	Tarson	460090
Ringers Lactate	-	Prepared in lab	sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0
RPMI 1640 MOPS	Himedia	AT180
Sabouraud dextrose Agar	SRL	24613
Sabouraud dextrose Broth	SRL	24835
XTT	Invitrogen	X6493