칸디다 트로피칼리스 생물막에 대한 항체의 효과를 평가하기 위한 가용성 테트라졸륨 기반 환원 분석

요약

C. tropicalis에 의해 형성된 생물막에 대한 항체의 효과를 연구하기 위해 2,3-비스(2-메톡시-4-니트로-5-설포페닐)-5-카르복사닐리드-2H-테트라졸륨(XTT) 환원 분석을 사용하는 96웰 마이크로타이터 플레이트 기반 프로토콜이 본원에 설명되어 있습니다. 이 시험관 내 프로토콜은 생물막에서 칸디다 종 세포의 대사 활성에 대한 잠재적 인 새로운 항진균 화합물의 효과를 확인하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

칸디다 종은 전신 병원 감염의 네 번째로 흔한 원인입니다. 전신 또는 침습성 칸디다증은 종종 이식 된 장치 또는 카테터에 생물막 형성을 수반하며, 이는 독성 및 사망률 증가와 관련이 있습니다. 다른 칸디다 종에 의해 생성 된 생물막은 다양한 항진균제에 대해 향상된 내성을 나타냅니다. 따라서, 칸디다 생물막에 대한 효과적인 면역요법 또는 보조 치료법을 개발할 필요가 있다. 세포 면역의 역할은 항 칸디다 보호에서 잘 확립되어 있지만 체액 면역의 역할은 덜 연구되었습니다.

생물막 형성 및 성숙의 억제는 보호 항체의 주요 기능 중 하나이며, 칸디다 알비칸스 생식관 항체(CAGTA)는 C. 알비칸스의 시험관 내 성장 및 생물막 형성을 조기에 억제하는 것으로 나타났습니다. 이 논문은 C. tropicalis에 의해 형성된 생물막에 대한 항체의 역할을 평가하기위한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜의 방법론은 96웰 마이크로타이터 플레이트에서 C. tropicalis 생물막을 형성한 다음 항원 특이적 항체의 존재 또는 부재 하에서 배양한 다음 생물막에서 진균 세포의 대사 활성을 측정하기 위한 2,3-비스(2-메톡시-4-니트로-5-설포페닐)-5-카르복사닐리드-2H-테트라졸륨(XTT) 분석을 포함합니다.

특이성은 Sap2-특이적 항체-고갈된 혈청을 포함하는 적절한 혈청 대조군을 사용하여 확인하였다. 상기 결과는 면역화된 동물의 혈청에 존재하는 항체가 시험관내에서 칸디다 생물막 성숙을 억제할 수 있음을 입증한다. 요약하면, 이 논문은 침습성 칸디다증 동안 생물막에 대한 새로운 면역 요법 및 시너지 또는 보조 치료법을 개발하는 데 있어 항체의 잠재력에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 이 시험관 내 프로토콜은 생물막에서 칸디다 종 세포의 대사 활성에 대한 잠재적 인 새로운 항진균 화합물의 효과를 확인하는 데 사용할 수 있습니다.

서문

전신 칸디다증은 전 세계적으로 높은 이환율 및 사망률과 관련된 병원 감염의 네 번째 주요 원인입니다. 전 세계적으로 전신성 칸디다증은 약 700,000명의 개인에게 영향을 미칩니다¹. 칸디다 종, 즉 C. 알비칸스, C. 트로피칼리스, C. 파라프실라증, C. 글라브라타, 및 C. 아우리스는 침습성 칸디다 감염의 가장 흔한 원인입니다². 칸디다 종은 생물막을 생성하는 기회 주의적 병원체입니다³. 생물막은 주로 칸디다 균병과 관련이 있으며, 칸디다 균은 생물막 형성을 유도하여 산화 및 삼투압 스트레스 조건을 견딜 수 있습니다⁴. 생물막은 독성 인자 및 세포벽 성분의 발현을 추가로 조절하고 외중합체 보호 매트릭스를 형성하여 칸디다가 다른 숙주 틈새에 적응하도록 돕습니다⁴. 생물막은 숙주 조직 및 의료 기구에 대한 효모 부착에 기여합니다⁵. 이와 같이, 생물막 형성은 효....

프로토콜

BALB/c 마우스는 IIT Roorkee의 Small Animal Facility에 보관되었습니다. 모든 동물은 25°C에서 12h:12h 빛:다크 주기로 유지되었고, 펠릿 식이 및 물 adlibitum이 제공되었다. 모든 동물 절차는 IIT Roorkee의 기관 동물 윤리위원회 (IAEC)의 승인을 받았습니다.

1. C. 트로피칼리스의 제조

알림: 곰팡이 칸디다 트로피칼리스는 위험 그룹 2 병원체에 속하며 BSL2 미생물로 분류됩니다. 칸디다 종으로 작업 할 때는 항상 인증 된 클래스 II 생물 안전 캐비닛을 사용하십시오. C. tropicalis 로 작업하는 동안 무균 및 멸균 기술을 연습하고이 병원체의 적절한 폐기를 위해 권장되는 생물 안전 절차를 따르십시오.

1. 줄무늬 C. 트로피칼리스 (ATCC 750 균주)를 사부라우 덱스트로스(SAB) 한천 플레이트 상으로.
2. SAB 한천 플레이트의 단일 콜로니를 SAB 배지 10mL가 포함된 멸균 50mL 원뿔형 튜브에 접종하여 C. tropicalis 의 하룻밤 성장 배양....

결과

칸디다 트로피칼리스 생물막은 96웰 마이크로타이터 플레이트에서 성장시키고 도립 현미경을 사용하여 40x에서 이미징했습니다(그림 1A). 생물막을 크리스탈 바이올렛을 사용하여 추가로 염색하고 도립 현미경을 사용하여 40x에서 관찰했습니다 (그림 1B). 주사 전자 현미경은 C. tropicalis 생물막의 대표 이미지를 보여줍니다 (?.......

토론

칸디다 종에 의한 곰팡이 감염은 전 세계적으로 높은 이환율 및 사망률과 관련이 있습니다. 침습성 곰팡이 감염의 위협이 증가함에 따라 생명을 위협하는 질병의 조기 관리가 필요합니다. 대부분의 칸디다 감염은 다양한 의료 기기에 부착되고 병원 환경에서 곰팡이 감염의 지속과 재발을 담당하는 생물막의 형성을 포함합니다³¹. 생물막은 효모 또는 균사 세포로 구.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical centrifuge tubes	BD Falcon	546021
1x PBS	-	Prepared in lab	NaCl : 4 g KCl : 0.1 g Na2HPO4:  0.72 g KH2PO4 : 0.12 g Water 500 mL. Adjust pH to 7.4
50 mL conical centrifuge tubes	BD Falcon	546041
96-well microtiter plates	Nunc	442404
Incubator	Generic
Menadione	Sigma	M5625
Microtiter Plate Reader	Generic
Multichannel pipette and tips	Generic
Petri dishes	Tarson	460090
Ringers Lactate	-	Prepared in lab	sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0
RPMI 1640 MOPS	Himedia	AT180
Sabouraud dextrose Agar	SRL	24613
Sabouraud dextrose Broth	SRL	24835
XTT	Invitrogen	X6493