Ein löslicher Tetrazolium-basierter Reduktionstest zur Bewertung der Wirkung von Antikörpern auf Candida tropicalis-Biofilme

Zusammenfassung

Ein 96-Well-Mikrotiterplatten-basiertes Protokoll unter Verwendung eines 2,3-Bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-carboxanilid-2H-tetrazolium (XTT)-Reduktionstests wird hierin beschrieben, um die Auswirkungen von Antikörpern auf Biofilme zu untersuchen, die von C. tropicalis gebildet werden. Dieses In-vitro-Protokoll kann verwendet werden, um die Wirkung potenzieller neuer antimykotischer Verbindungen auf die metabolische Aktivität von Candida-Spezies-Zellen in Biofilmen zu überprüfen.

Zusammenfassung

Candida-Arten sind die vierthäufigste Ursache für systemische nosokomiale Infektionen. Die systemische oder invasive Candidiasis beinhaltet häufig die Bildung von Biofilmen auf implantierten Geräten oder Kathetern, was mit einer erhöhten Virulenz und Mortalität einhergeht. Biofilme, die von verschiedenen Candida-Arten produziert werden, zeigen eine erhöhte Resistenz gegen verschiedene Antimykotika. Daher besteht die Notwendigkeit, wirksame Immuntherapien oder Zusatzbehandlungen gegen Candida-Biofilme zu entwickeln. Während die Rolle der zellulären Immunität im Anti-Candida-Schutz gut etabliert ist, wurde die Rolle der humoralen Immunität weniger untersucht.

Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Hemmung der Biofilmbildung und -reifung eine der Hauptfunktionen schützender Antikörper ist, und Candida albicans Keimrohrantikörper (CAGTA) haben gezeigt, dass sie das In-vitro-Wachstum und die Biofilmbildung von C. albicans früher unterdrücken. Dieser Artikel skizziert ein detailliertes Protokoll zur Bewertung der Rolle von Antikörpern auf Biofilmen, die von C. tropicalis gebildet werden. Die Methodik für dieses Protokoll beinhaltet die C. tropicalis-Biofilmbildung in 96-Well-Mikrotiterplatten, die dann in Gegenwart oder Abwesenheit von Antigen-spezifischen Antikörpern inkubiert wurden, gefolgt von einem 2,3-Bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-carboxanilid-2H-tetrazolium (XTT)-Assay zur Messung der metabolischen Aktivität von Pilzzellen im Biofilm.

Die Spezifität wurde durch geeignete Serumkontrollen, einschließlich Sap2-spezifischem Antikörper-depleted Serum, bestätigt. Die Ergebnisse zeigen, dass Antikörper, die im Serum immunisierter Tiere vorhanden sind, die Candida-Biofilmreifung in vitro hemmen können. Zusammenfassend liefert dieser Artikel wichtige Erkenntnisse über das Potenzial von Antikörpern bei der Entwicklung neuartiger Immuntherapien und synergistischer oder ergänzender Behandlungen gegen Biofilme während der invasiven Candidiasis. Dieses In-vitro-Protokoll kann verwendet werden, um die Wirkung potenzieller neuer antimykotischer Verbindungen auf die metabolische Aktivität von Candida-Spezies-Zellen in Biofilmen zu überprüfen.

Einleitung

Die systemische Candidiasis ist die vierte Hauptursache für nosokomiale Infektionen, die weltweit mit hohen Morbiditäts- und Mortalitätsraten einhergehen. Weltweit betrifft die systemische Candidiasis etwa 700.000 Personen¹. Candida-Arten, nämlich C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata und C. auris, sind die häufigste Ursache für invasive Candida-Infektionen ². Candida-Arten sind opportunistische Krankheitserreger, die Biofilme produzieren³. Biofilme sind überwiegend mit Candida-Virulenz assoziiert, ....

Protokoll

BALB/c-Mäuse wurden in der Kleintiereinrichtung des IIT Roorkee untergebracht. Alle Tiere wurden in einem 12 h:12 h Hell-Dunkel-Zyklus bei 25 °C gehalten und mit einem Pelletfutter und Wasser ad libitum versorgt. Alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Ethics Committee (IAEC) des IIT Roorkee genehmigt.

1. Zubereitung von C. tropicalis

HINWEIS: Der Pilz Candida tropicalis gehört zu den Erregern der Risikogruppe 2 und wird als BSL2-Mikroorganismus eingestuft. Verwenden Sie bei der Arbeit mit Candida-Arten immer zertifizierte biologische Sicherheitswerkbä....

Ergebnisse

Candida tropicalis Biofilme wurden in 96-Well-Mikrotiterplatten gezüchtet und mit einem inversen Mikroskop 40x abgebildet (Abbildung 1A). Der Biofilm wurde weiter mit Kristallviolett angefärbt und 40x mit einem inversen Mikroskop beobachtet (Abbildung 1B). Die Rasterelektronenmikroskopie zeigt ein repräsentatives Bild des Biofilms von C. tropicalis (Abbildung 1C). Zur Durchführung des Biofilm-Inhibitionstests w.......

Diskussion

Pilzinfektionen, die durch Candida-Arten verursacht werden, sind weltweit mit hohen Morbiditäts- und Mortalitätsraten verbunden. Die wachsende Bedrohung durch invasive Pilzinfektionen erfordert die frühzeitige Behandlung solcher lebensbedrohlichen Erkrankungen. Die meisten Candida-Infektionen beinhalten die Bildung von Biofilmen, die an einer Vielzahl von Medizinprodukten haften und für die Persistenz und das Wiederauftreten von Pilzinfektionen in Krankenhäusern verantwortlich sind

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical centrifuge tubes	BD Falcon	546021
1x PBS	-	Prepared in lab	NaCl : 4 g KCl : 0.1 g Na2HPO4:  0.72 g KH2PO4 : 0.12 g Water 500 mL. Adjust pH to 7.4
50 mL conical centrifuge tubes	BD Falcon	546041
96-well microtiter plates	Nunc	442404
Incubator	Generic
Menadione	Sigma	M5625
Microtiter Plate Reader	Generic
Multichannel pipette and tips	Generic
Petri dishes	Tarson	460090
Ringers Lactate	-	Prepared in lab	sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0
RPMI 1640 MOPS	Himedia	AT180
Sabouraud dextrose Agar	SRL	24613
Sabouraud dextrose Broth	SRL	24835
XTT	Invitrogen	X6493