Ein löslicher Tetrazolium-basierter Reduktionstest zur Bewertung der Wirkung von Antikörpern auf Candida tropicalis-Biofilme

Zusammenfassung

Ein 96-Well-Mikrotiterplatten-basiertes Protokoll unter Verwendung eines 2,3-Bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-carboxanilid-2H-tetrazolium (XTT)-Reduktionstests wird hierin beschrieben, um die Auswirkungen von Antikörpern auf Biofilme zu untersuchen, die von C. tropicalis gebildet werden. Dieses In-vitro-Protokoll kann verwendet werden, um die Wirkung potenzieller neuer antimykotischer Verbindungen auf die metabolische Aktivität von Candida-Spezies-Zellen in Biofilmen zu überprüfen.

Zusammenfassung

Candida-Arten sind die vierthäufigste Ursache für systemische nosokomiale Infektionen. Die systemische oder invasive Candidiasis beinhaltet häufig die Bildung von Biofilmen auf implantierten Geräten oder Kathetern, was mit einer erhöhten Virulenz und Mortalität einhergeht. Biofilme, die von verschiedenen Candida-Arten produziert werden, zeigen eine erhöhte Resistenz gegen verschiedene Antimykotika. Daher besteht die Notwendigkeit, wirksame Immuntherapien oder Zusatzbehandlungen gegen Candida-Biofilme zu entwickeln. Während die Rolle der zellulären Immunität im Anti-Candida-Schutz gut etabliert ist, wurde die Rolle der humoralen Immunität weniger untersucht.

Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Hemmung der Biofilmbildung und -reifung eine der Hauptfunktionen schützender Antikörper ist, und Candida albicans Keimrohrantikörper (CAGTA) haben gezeigt, dass sie das In-vitro-Wachstum und die Biofilmbildung von C. albicans früher unterdrücken. Dieser Artikel skizziert ein detailliertes Protokoll zur Bewertung der Rolle von Antikörpern auf Biofilmen, die von C. tropicalis gebildet werden. Die Methodik für dieses Protokoll beinhaltet die C. tropicalis-Biofilmbildung in 96-Well-Mikrotiterplatten, die dann in Gegenwart oder Abwesenheit von Antigen-spezifischen Antikörpern inkubiert wurden, gefolgt von einem 2,3-Bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-carboxanilid-2H-tetrazolium (XTT)-Assay zur Messung der metabolischen Aktivität von Pilzzellen im Biofilm.

Die Spezifität wurde durch geeignete Serumkontrollen, einschließlich Sap2-spezifischem Antikörper-depleted Serum, bestätigt. Die Ergebnisse zeigen, dass Antikörper, die im Serum immunisierter Tiere vorhanden sind, die Candida-Biofilmreifung in vitro hemmen können. Zusammenfassend liefert dieser Artikel wichtige Erkenntnisse über das Potenzial von Antikörpern bei der Entwicklung neuartiger Immuntherapien und synergistischer oder ergänzender Behandlungen gegen Biofilme während der invasiven Candidiasis. Dieses In-vitro-Protokoll kann verwendet werden, um die Wirkung potenzieller neuer antimykotischer Verbindungen auf die metabolische Aktivität von Candida-Spezies-Zellen in Biofilmen zu überprüfen.

Einleitung

Die systemische Candidiasis ist die vierte Hauptursache für nosokomiale Infektionen, die weltweit mit hohen Morbiditäts- und Mortalitätsraten einhergehen. Weltweit betrifft die systemische Candidiasis etwa 700.000 Personen¹. Candida-Arten, nämlich C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata und C. auris, sind die häufigste Ursache für invasive Candida-Infektionen ². Candida-Arten sind opportunistische Krankheitserreger, die Biofilme produzieren³. Biofilme sind überwiegend mit Candida-Virulenz assoziiert, und Candida kann oxidativen und osmotischen Stressbedingungen standhalten, indem es die Biofilmbildung induziert⁴. Biofilme modulieren die Expression von Virulenzfaktoren und Zellwandkomponenten weiter und bilden eine exopolymere Schutzmatrix, die Candida hilft, sich an verschiedene Wirtsnischen anzupassen⁴. Biofilme tragen zur Hefehaftung auf Wirtsgewebe und medizinischen Instrumenten bei⁵. Daher ist die Biofilmbildung mit einem Vorteil für Hefen verbunden, da Hefezellen innerhalb der Biofilme der Immunantwort des Wirts ausweichen können⁶. Die Biofilmbildung schützt auch die pathogenen Hefen vor der Wirkung von Antimykotika⁵. Eine verminderte Empfindlichkeit von C. albicans-Biofilmen gegenüber Amphotericin B wurde von Pierce et ^al.7,8 nachgewiesen. Darüber hinaus zeigen Biofilme eine antimykotische Arzneimittelresistenz gegen Fluconazol, was die effektive Behandlung der systemischen Candidiasis beeinträchtigt ^9,10.

Mikroben haben eine intrinsische Tendenz, an verschiedenen biotischen und abiotischen Oberflächen zu haften, was zur Biofilmbildung führt. Candida albicans, ein dimorpher Pilz, existiert in Hefe- und Hyphenformen, und seine Biofilmbildung wurde in verschiedenen in vitro und in vivo Modellsystemen charakterisiert¹¹. Die Schritte der Biofilmbildung umfassen die Adhäsion von Candida-Zellen am Substrat, die Filamentierung, die Proliferation und die Biofilmreifung¹¹. Zunächst haftet die Hefeform von C. albicans an Substraten, einschließlich medizinischer Geräte und menschlichem Gewebe, gefolgt von der Filamentierung und Proliferation von C. albicans in Hyphen- und Pseudohyphalformen und schließlich der Reifung von Biofilmen, die in die extrazelluläre Matrix¹¹ eingebettet sind. Die Biofilmbildung trägt wesentlich zu den Pathogenesemechanismen von C. albicans bei¹². Candida-Arten bilden arzneimittelresistente Biofilme, was ihre Ausrottung schwierig macht¹³. Eine kleine Untergruppe der C. albicans-Biofilm-produzierenden Population wurde als sehr resistent gegen die Antimykotika Amphotericin B und Chlorhexidin¹⁴ beschrieben. Bemerkenswert ist, dass Hefezellen in Biofilmen im Vergleich zu Hefezellen in der Planktonphase und Proliferationsphase¹⁴ eine hohe Resistenz gegen Multidrug-Therapie aufweisen. Es wurde vorgeschlagen, dass Hefezellen, die in Biofilmen vorhanden sind, sehr tolerant gegenüber Antimykotika sind, was zum Überleben von C. albicans in Biofilmen beiträgt¹⁴. Es wurde berichtet, dass diese vorhandenen Zellen phänotypische Varianten von C. albicans und keine Mutanten sind¹⁴. Darüber hinaus sind Zellen von Candida-Biofilmen, die als "Persister-Zellen" bekannt sind, tolerant gegenüber hohen Dosen der Amphotericin-B-Behandlung und tragen zum Überleben von Candida bei, wodurch eine große Belastung durch wiederkehrende systemische Candida-Infektionen bei Hochrisikopersonen darstellt¹⁵.

Die Zunahme der antimykotischen Arzneimittelresistenz bei Candida-Stämmen erfordert die Erforschung neuer Antimykotika und Immuntherapien. Wie aus den oben genannten Studien hervorgeht, zeigen Candida-Biofilme eine verminderte Anfälligkeit für Antimykotika. Daher besteht ein Bedarf an verbesserten Immuntherapien, um die Bildung von Candida-Biofilmen zu kontrollieren. Frühere Studien haben gezeigt, dass CAGTA einen wirksamen Schutz vor systemischen Candida-Infektionen bieten kann, indem es die Biofilmbildung von C. albicans in vitro^{hemmt 16}. Eine andere Studie berichtete, dass die Immunisierung von Mäusen mit C. albicans rAls3-N-Protein hohe Antikörpertiter induziert, die die Biofilmbildung von C. albicans in vitro¹⁷ stören. Anti-Als3-N-Antikörper übten auch eine hemmende Wirkung auf die Ausbreitung von C. albicans aus Biofilmen^{aus 17}. Der NDV-3A-Impfstoff auf Basis von C. albicans befindet sich derzeit in der klinischen Prüfung und es wurde auch festgestellt, dass Anti-NDV-3A-Seren die Biofilmbildung von C. auris reduzieren¹⁸. Eine kürzlich durchgeführte Studie identifizierte die Hemmung der Biofilmbildung durch Sap2-Antikörper als Schutzmechanismus in einem murinen Modell der systemischen Candidiasis¹⁹.

Dieser Artikel skizziert ein detailliertes In-vitro-Protokoll zur Bewertung der Wirkung von antigenspezifischen Antikörpern, die in polyklonalem Serum aus verschiedenen Gruppen von Sap2-geimpften Mäusen auf vorgeformten Candida tropicalis-Biofilmen vorhanden sind. Um dies zu erreichen, wurde eine auf einem XTT-Reduktionsassay basierende Methode optimiert und im Labor entwickelt, die die Biofilmlebensfähigkeit schnell, empfindlich und mit hohem Durchsatz in Gegenwart oder Abwesenheit von Antikörpern messen kann.

Der XTT-Assay wird verwendet, um die zelluläre Stoffwechselaktivität als Indikator für Zelllebensfähigkeit, Zellproliferation und Zytotoxizität zu messen²⁰. Dieser kolorimetrische Assay basiert auf der Reduktion eines gelben Tetrazoliumsalzes, Natrium 3'-[1-(phenylaminocarbonyl)-3,4-tetrazolium]-bis(4-methoxy-6-nitro) benzolsulfonsäurehydrat (XTT) zu einem orangefarbenen Formazanfarbstoff durch metabolisch aktive Zellen. Da nur lebensfähige Zellen XTT reduzieren können, ist die Menge an reduziertem XTT-Formazan proportional zur Intensität der Farbe und Zelllebensfähigkeit. Der gebildete Formazan-Farbstoff ist wasserlöslich und wird direkt mit einem Plattenleser quantifiziert. Aufgrund seiner wasserlöslichen Natur ermöglicht der XTT-Assay die Untersuchung intakter Biofilme sowie die Untersuchung der Empfindlichkeit von Biofilmarzneimitteln ohne Störung der Biofilmstruktur²¹. Darüber hinaus wird diese Methode aufgrund ihrer Benutzerfreundlichkeit, Geschwindigkeit, Genauigkeit, ihres hohen Durchsatzes und ihres hohen Reproduzierbarkeitsgrades in Candida-Pilzlebensfähigkeitsbewertungen implementiert ^7,22.

Neben dem XTT-Reduktionstest wurden auch zahlreiche alternative Techniken zur Messung der Biofilmmenge identifiziert. Einige davon umfassen die Verwendung des MTT-Reduktionsassays, die Kristallviolettfärbung, die DNA-Quantifizierung, die quantitative PCR, die Proteinquantifizierung, die Messung des Trockenzellgewichts und die Zählung lebensfähiger Kolonien. Diese Verfahren unterscheiden sich stark in Bezug auf ihren Zeit- und Kostenaufwand. Taff et al. führten eine vergleichende Analyse von sieben verschiedenen Candida-Biofilm-Quantifizierungsassays durch und stellten fest, dass der XTT-Assay die reproduzierbarste, genaueste und effizienteste Methode für die quantitative Schätzung von C. albicans-Biofilmen darstellte²³. Färbetechniken wie Kristallviolett haben bestimmte Einschränkungen; Der Kristallvioletttest bestimmt indirekt die Menge an Biofilm, indem er die optische Dichte der kristallviolett gefärbten Biofilmmatrix und -zellen misst. Obwohl der kristallviolette Assay ein gutes Maß für die Biofilmmasse liefert, gibt er kein Maß für die Biofilmlebensfähigkeit, da er sowohl mikrobielle Zellen als auch die extrazelluläre Matrix färbt²⁴. Dhale et al. berichteten weiter, dass der XTT-Reduktionstest die empfindlichste, reproduzierbarste, genaueste, effizienteste und spezifischste Methode zum Nachweis der Biofilmproduktion im Vergleich zum kristallvioletten Assay²⁵ war. Literaturberichte haben gezeigt, dass der XTT-Assay gut mit dem CFU/mL-Parameter in der CFU-Zählmethode korreliert. Im Vergleich zum XTT-Assay ist die CFU-Methode jedoch arbeitsintensiv und langsam²⁶. Darüber hinaus ist der Anteil abgelöster lebender Zellen möglicherweise nicht repräsentativ für die ursprüngliche Biofilmpopulation²⁷. Obwohl der XTT-Reduktionstest die beste verfügbare Option zur Quantifizierung der Lebensfähigkeit zu sein scheint, gibt es einige Einschränkungen dieser Technik. Während die XTT-Methode für Vergleiche mit einem Pilzstamm nützlich ist, kann ihre Verwendung beim Vergleich verschiedener Pilzstämme und -arten begrenzt sein. Vergleiche zwischen Stämmen können ohne detaillierte Standardisierung schwierig sein, da verschiedene Stämme Substrate mit unterschiedlichen Fähigkeiten metabolisieren²¹.

Protokoll

BALB/c-Mäuse wurden in der Kleintiereinrichtung des IIT Roorkee untergebracht. Alle Tiere wurden in einem 12 h:12 h Hell-Dunkel-Zyklus bei 25 °C gehalten und mit einem Pelletfutter und Wasser ad libitum versorgt. Alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Ethics Committee (IAEC) des IIT Roorkee genehmigt.

1. Zubereitung von C. tropicalis

HINWEIS: Der Pilz Candida tropicalis gehört zu den Erregern der Risikogruppe 2 und wird als BSL2-Mikroorganismus eingestuft. Verwenden Sie bei der Arbeit mit Candida-Arten immer zertifizierte biologische Sicherheitswerkbänke der Klasse II. Üben Sie aseptische und sterile Techniken während der Arbeit mit C. tropicalis und befolgen Sie die empfohlenen Biosicherheitsverfahren für die ordnungsgemäße Entsorgung dieses Erregers.

1. Streifen Sie C. tropicalis (Stamm ATCC 750) auf eine Sabouraud Dextrose (SAB) Agarplatte.
2. Bereiten Sie eine über Nacht gewachsene Kultur von C. tropicalis vor, indem Sie eine einzelne Kolonie von der SAB-Agarplatte in ein steriles 50-ml-konisches Röhrchen mit 10 ml SAB-Brühemedium impfen. Alternativ können Sie eine gefrorene Glycerinbrühe von C. tropicalis verwenden und 100 μL der Glycerinbrühe in einen sterilen 250-ml-Konikenkolben mit 50 ml SAB-Brühemedium inokulieren.
3. C. tropicalis-Kultur in einem Orbitalschüttler bei 180 U/min bei 30 °C für 24-48 h inkubieren.
4. Zentrifugieren Sie die Pilzkultur (Zellen in logarithmischer Phase) bei 2.150 × g für 15 min bei 21 °C.
5. Verwerfen Sie den Überstand und geben Sie 50 mL steriles 1x PBS zum Pellet. Waschen und resuspendieren Sie das Pellet in sterilem 1x PBS mit leichtem Wirbel.
6. Erneut bei 2.150 × g für 15 min bei 21 °C zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pilzpellet in 10 ml sterilem 1x PBS.
7. Berechnen Sie die Konzentration der Zellen durch Zählen mit einem Hämozytometer.
8. Pilzbestände mit einer Enddichte von 1,0 × 10⁶ Zellen/ml in RPMI 1640 Morpholinepropansulfonsäure (MOPS) -Medium vorbereiten. Verwenden Sie die Zellsuspension aus Schritt 1.6 sofort.
   HINWEIS: Um eine 96-Well-Platte einzurichten, beträgt das gesamte benötigte Pilzvolumen 10 ml (100 μL / Well). Skalieren Sie nach Bedarf.

2. C. tropicalis Biofilmbildung

1. Candida-Biofilme werden in einer 96-Well-Polystyrol-Mikrotiterplatte mit flachem Boden hergestellt, wie zuvor beschrieben (Abbildung 1)^28,29.
2. 100 μL C. tropicalis-Kultur (aus 10⁶ Zellen/ml, wie oben vorbereitet) unter Verwendung einer Mehrkanalpipette zu einer 96-Well-Mikrotiterplatte geben (Abbildung 2A). Halten Sie die letzten beiden Spalten (11 und 12) als "kein Pilz plus Serum" und "kein Pilz und kein Serum" Negativkontrollen, indem Sie keine Pilzzellen hinzufügen. Füllen Sie die Spalten 11 und 12 allein mit 100 μL RPMI 1640 MOPS medium.
3. Decken Sie die Mikrotiterplatte mit einem Deckel und Aluminiumfolie ab. Die Platte 24 h bei 37 °C unter stationären Bedingungen inkubieren.
4. Am nächsten Tag saugen Sie das Medium vorsichtig mit einer Mehrkanalpipette ab (ohne die Biofilme zu berühren oder zu stören). Klopfen Sie die Platte vorsichtig in umgekehrter Position auf die Löschbleche, um das restliche Medium zu entfernen.
5. Waschen Sie die Platte mit 200 μL 1x PBS (pro Vertiefung) mit einer Mehrkanalpipette. Fügen Sie PBS sehr vorsichtig entlang der Seitenwände des Bohrlochs hinzu, um zu vermeiden, dass Biofilme gestört werden. Saugen Sie das PBS vorsichtig mit einer Mehrkanalpipette ab. Wiederholen Sie die PBS-Wäsche 2x (insgesamt drei Wäschen).
6. Um überschüssiges PBS zu entfernen, trocknen Sie die Platte (ohne Deckel) 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer biologischen Sicherheitswerkbank an der Luft.

3. Behandlung von Biofilm mit Antikörpern

HINWEIS: Biofilme können nun verarbeitet werden, um die Hemmung der Biofilmreifung durch Antikörper zu beurteilen. Murines Serum wurde als Quelle für polyklonale Antikörper verwendet. Verschiedene Gruppen von Sap2-immunisierten (Sap2-albicans, Sap2-tropicalis und Sap2-Parapsilose) zusammen mit scheinimmunisierten Mäusen wurden retroorbital geblutet und das Serum wurde wie zuvor beschrieben isoliert¹⁹. Das Vorhandensein von Anti-Sap2-Antikörpern wurde mit Sap2-spezifischem ELISA bestätigt, wie zuvor beschrieben¹⁹.

1. Führen Sie vor der Anwendung eine Hitzeinaktivierung des Serums (Quelle polyklonaler Antikörper) bei 56 °C für 30 min durch, um die Rolle des Komplements bei der hemmenden Aktivität auszuschließen. Inaktivieren Sie das Serum vor der Serumverdünnung.
   HINWEIS: Verwenden Sie Serum von scheinimmunisierten Mäusen, präimmunen Mäusen und Sap2-spezifischem Antikörper-depletiertem Serum als zusätzliche Kontrollen¹⁹. Das serumreicherte Serum mit Antikörpermangel wurde gemäß einer früheren Studie^{hergestellt 19}. Unter den seriellen Verdünnungen (1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1.600, 1:3.200, 1:6.400 und 1:12.800) für Serum, das in diesem Protokoll getestet wurde, wurde eine Hemmung der Biofilmreifung bei 1:25, 1:50 und 1:100 beobachtet; Daher wurde 1:50 ausgewählt, um ein Gleichgewicht zwischen Hemmung und Serumkonsum zu finden.
2. Bereiten Sie serielle Verdünnungen von hitzeinaktivierten Serumproben in sterilem RPMI 1640 MOPS-Medium (1:50) vor. Verwenden Sie eine übliche Serumverdünnung (1:50) für alle zu testenden Serumproben auf Hemmung der Biofilmreifung³⁰.
3. Fügen Sie 100 μL der ausgewählten Serumverdünnung zu jeder Vertiefung der 96-Well-Mikrotiterplatte hinzu. Fügen Sie für jede Probe die Serumverdünnungen in zweifacher Ausfertigung gemäß dem beigefügten Layout hinzu (Abbildung 2B).
   1. In Spalte 10 keine Serumverdünnung hinzufügen; Fügen Sie nur RPMI 1640 MOPS medium für die reine Pilz-Positivkontrolle hinzu.
      HINWEIS: Spalte 10, Zeilen G1-G8 und H1-H8 hatten ursprünglich Pilzzellen in RPMI-MOPS. Während RPMI-MOPS jedoch auch nach 24 h in Spalte 10 hinzugefügt wurde, dienten die Reihen G1-G8 als PBS-Kontrolle und die Reihen H1-H8 als No-Serum-Kontrolle nach 24 h.
   2. Fügen Sie in Spalte 11 eine 1:50-Verdünnung Serum in alle Vertiefungen hinzu, um als Negativkontrolle ohne Pilz plus Serum zu dienen.
   3. In Spalte 12 keine Serumverdünnung in eine Vertiefung geben; Halten Sie dies als die keine Pilz kein Serum Negativkontrolle.
4. Decken Sie die Platte mit einem Deckel und Aluminiumfolie ab. Die Platte 24 h bei 37 °C inkubieren.

4. Abschätzung der Biofilm-Stoffwechselaktivität

1. Am nächsten Tag saugen Sie das Serum vorsichtig mit einer Mehrkanalpipette ab (ohne die Biofilme zu berühren oder zu stören). Klopfen Sie die Platte vorsichtig in umgekehrter Position auf die Löschblätter, um das restliche Serum zu entfernen.
2. Waschen Sie die Platte mit 200 μL 1x PBS (pro Vertiefung) mit einer Mehrkanalpipette und fügen Sie das PBS entlang der Seitenwände des Bohrlochs hinzu, um eine Störung der Biofilme zu vermeiden. Saugen Sie das PBS vorsichtig mit einer Mehrkanalpipette ab und wiederholen Sie die PBS-Wäsche 2x (insgesamt drei Wäschen). Trocknen Sie die Platte (ohne Deckel) 30 Minuten lang an der Luft bei Raumtemperatur in einer biologischen Sicherheitswerkbank, um überschüssiges PBS zu trocknen.
3. Vorbereitung von XTT / Menadion:
   1. Bereiten Sie XTT in sterilem Ringers Lactate als 0,5 g/L Lösung vor. 25 mg XTT werden in 50 ml filtersterilisiertem Ringers-Laktat gelöst. Aliquot 10 mL in separaten Röhrchen mit Aluminiumfolie abdecken und bei -80 °C lagern.
   2. Menadione als 10 mM Vorrat vorbereiten. Lösen Sie 8,6 mg Menadion in 5 ml Aceton auf und verteilen Sie 50 μL in 100 separaten Mikroröhrchen. Lagern Sie die Aliquots bei -80 °C.
   3. Bereiten Sie XTT / Menadion-Lösung kurz vor Gebrauch vor, indem Sie 10 ml XTT nehmen und 1 μL Menadion hinzufügen, um eine 1 μM Arbeitslösung zu erhalten.
4. Fügen Sie 100 μL der XTT/Menadion-Lösung pro Vertiefung der 96-Well-Mikrotiterplatte hinzu. Decken Sie die Platte mit einem Deckel und Aluminiumfolie ab. Die Platte 2 h bei 37 °C im Dunkeln ausbrüten.
5. 80 μL des farbigen Überstands aus jeder Vertiefung in eine frische 96-Well-Platte überführen. Lesen Sie die Platte bei 490 nm.
6. Berechnen Sie den Mittelwert der Absorptionswerte der Vertiefungen in Spalte 10 (reine Pilz-Positivkontrolle), der als Referenzwert für die Berechnung der prozentualen Biofilmhemmung durch jede Serumprobe unter Verwendung von Gleichung (1) dient.
   % Biofilmhemmung = 100 - × 100 (1)

Ergebnisse

Candida tropicalis Biofilme wurden in 96-Well-Mikrotiterplatten gezüchtet und mit einem inversen Mikroskop 40x abgebildet (Abbildung 1A). Der Biofilm wurde weiter mit Kristallviolett angefärbt und 40x mit einem inversen Mikroskop beobachtet (Abbildung 1B). Die Rasterelektronenmikroskopie zeigt ein repräsentatives Bild des Biofilms von C. tropicalis (Abbildung 1C). Zur Durchführung des Biofilm-Inhibitionstests w...

Diskussion

Pilzinfektionen, die durch Candida-Arten verursacht werden, sind weltweit mit hohen Morbiditäts- und Mortalitätsraten verbunden. Die wachsende Bedrohung durch invasive Pilzinfektionen erfordert die frühzeitige Behandlung solcher lebensbedrohlichen Erkrankungen. Die meisten Candida-Infektionen beinhalten die Bildung von Biofilmen, die an einer Vielzahl von Medizinprodukten haften und für die Persistenz und das Wiederauftreten von Pilzinfektionen in Krankenhäusern verantwortlich sind

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical centrifuge tubes	BD Falcon	546021
1x PBS	-	Prepared in lab	NaCl : 4 g KCl : 0.1 g Na2HPO4:  0.72 g KH2PO4 : 0.12 g Water 500 mL. Adjust pH to 7.4
50 mL conical centrifuge tubes	BD Falcon	546041
96-well microtiter plates	Nunc	442404
Incubator	Generic
Menadione	Sigma	M5625
Microtiter Plate Reader	Generic
Multichannel pipette and tips	Generic
Petri dishes	Tarson	460090
Ringers Lactate	-	Prepared in lab	sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0
RPMI 1640 MOPS	Himedia	AT180
Sabouraud dextrose Agar	SRL	24613
Sabouraud dextrose Broth	SRL	24835
XTT	Invitrogen	X6493