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要約

C. tropicalisによって形成されるバイオフィルムに対する抗体の影響を研究するために、2,3-ビス(2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル)-5-カルボキシアニリド-2H-テトラゾリウム(XTT)還元アッセイを使用した96ウェルマイクロタイタープレートベースのプロトコルが本明細書に記載されています。このin vitroプロトコルは、バイオフィルム中のカンジダ種細胞の代謝活性に対する潜在的な新しい抗真菌化合物の効果を確認するために使用できます。

要約

カンジダ 種は、全身性院内感染の4番目に一般的な原因です。全身性または侵襲性カンジダ症は、埋め込み型デバイスまたはカテーテルでのバイオフィルム形成を伴うことが多く、これは病原性および死亡率の増加と関連している。異なる カンジダ 種によって産生されたバイオフィルムは、様々な抗真菌薬に対する耐性が増強される。したがって、 カンジダ バイオフィルムに対する効果的な免疫療法または補助療法を開発する必要があります。細胞性免疫の役割は抗カンジダ 防御において十分に確立されているが、体液性免疫の役割はあまり研究されていない。

バイオフィルム形成と成熟の阻害は防御抗体の主要な機能の1つであると仮定されており、カンジダ・アルビカンス生殖管抗体(CAGTA)は、C.アルビカンスのin vitro増殖とバイオフィルム形成を早期に抑制することが示されています。この論文は、C. tropicalisによって形成されたバイオフィルム上の抗体の役割を評価するための詳細なプロトコルを概説します。このプロトコルの方法論では、96ウェルマイクロタイタープレートでC. tropicalisバイオフィルムを形成し、抗原特異的抗体の存在下または非存在下でインキュベートした後、バイオフィルム中の真菌細胞の代謝活性を測定するための2,3-ビス(2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル)-5-カルボキシアニリド-2H-テトラゾリウム(XTT)アッセイを行います。

特異性は、Sap2特異的抗体枯渇血清を含む適切な血清コントロールを用いて確認した。結果は、免疫動物の血清中に存在する抗体がin vitroでカンジダバイオフィルム成熟を阻害できることを示しています。要約すると、この論文は、侵襲性カンジダ症中のバイオフィルムに対する新しい免疫療法および相乗的または補助的治療の開発における抗体の可能性に関する重要な洞察を提供します。このin vitroプロトコルは、バイオフィルム中のカンジダ種細胞の代謝活性に対する潜在的な新しい抗真菌化合物の効果を確認するために使用できます。

概要

全身性カンジダ症は院内感染の4番目の主要な原因であり、世界中で高い罹患率と死亡率に関連しています。世界的に、全身性カンジダ症は約70万人に影響を及ぼします1。カンジダ種、すなわちC.アルビカンス、C.トロピカリス、C.パラプシロシス、C.グラブラタ、およびC.アウリスは、侵襲性カンジダ感染症の最も一般的な原因です2。 カンジダ種は、バイオフィルム3を産生する日和見病原体です。バイオフィルムは主にカンジダの病原性に関連しており、カンジダはバイオフィルム形成を誘導することにより酸化的および浸透圧ストレス条件に耐えることができます4。バイオフィルムは、病原性因子と細胞壁成分の発現をさらに調節し、高分子外保護マトリックスを形成し、カンジダがさまざまな宿主ニッチに適応するのを助けます4。バイオフィルムは、宿主組織や医療機器への酵母の接着に貢献します5。このように、バイオフィルム内の酵母細胞が宿主の免疫応答を回避できるため、バイオフィルム形成は酵母にとって有利である6。バイオフィルム形成はまた、抗真菌薬の作用から病原性酵母を保護します5。C.アルビカンスバイオフィルムのアムホテリシンBに対する感受性の低下は、Pierceらによって実証されています7,8。さらに、バイオフィルムはフルコナゾールに対する抗真菌薬耐性を示し、全身性カンジダ症の効果的な管理を損ないます9,10。

微生物は、さまざまな生物的および非生物的表面に付着する固有の傾向があり、その結果、バイオフィルムが形成されます。二形性真菌であるカンジダ・アルビカンスは、酵母および菌糸の形で存在し、そのバイオフィルム形成は、さまざまなin vitroおよびin vivoモデルシステムで特徴付けられています11。バイオフィルム形成のステップには、基質へのカンジダ細胞の接着、フィラメント形成、増殖、およびバイオフィルム成熟が含まれる11。最初に、酵母型のC.アルビカンスは、医療機器およびヒト組織を含む基質に接着し、続いてC.アルビカンスの糸状化および菌糸および偽菌糸形態への増殖、そして最後に細胞外マトリックスに埋め込まれたバイオフィルムの成熟が続く11。バイオフィルム形成は、C. albicansの病因メカニズムに大きく寄与しています12。カンジダ種は薬剤耐性バイオフィルムを形成するため、根絶が困難になります13。C.アルビカンスのバイオフィルム産生集団の小さなサブセットは、抗真菌薬アムホテリシンBおよびクロルヘキシジン14に対して非常に耐性があると説明されています。注目すべきことに、バイオフィルム中の酵母細胞は、プランクトン期および増殖期14の酵母細胞と比較して、多剤併用療法に対して高い耐性を示す。バイオフィルム中に存在する酵母細胞は抗真菌薬に対する耐性が高く、バイオフィルム中のC. albicansの生存に寄与していることが示唆されています14。これらの既存の細胞は、変異体ではなくC.アルビカンスの表現型変異体であると報告された14。さらに、「持続性細胞」として知られるカンジダバイオフィルムの細胞は、高用量のアムホテリシンB治療に耐性があり、カンジダの生存に寄与するため、高リスクの個人に再発する全身性カンジダ感染の大きな負担をもたらします15。

カンジダ株における抗真菌薬耐性の増加は、新しい抗真菌剤および免疫療法の研究を必要とする。上記の研究から明らかなように、カンジダバイオフィルムは抗真菌薬に対する感受性の低下を示しています。したがって、カンジダバイオフィルム形成を制御するための改善された免疫療法が必要である。以前の研究では、CAGTAがin vitroでC.アルビカンスのバイオフィルム形成を阻害することにより、全身性カンジダ感染症に対する効果的な保護を提供できることが示されています16。別の研究では、マウスにC.アルビカンスrAls3-Nタンパク質を免疫すると、インビトロでのC.アルビカンスのバイオフィルム形成を妨げる高い抗体価が誘導されることが報告されています17。 抗Als3-N抗体は、バイオフィルムからのC.アルビカンス分散に対しても阻害効果を発揮した17。C.アルビカンスに基づくNDV-3Aワクチンは現在臨床試験中であり、抗NDV-3A血清もC.オーリスバイオフィルム形成を減少させることが見出された18。最近の研究では、全身性カンジダ症のマウスモデルにおける保護メカニズムとして、Sap2抗体によるバイオフィルム形成の阻害が特定されました19。

この論文は、Sap2ワクチン接種マウスのさまざまなグループから得られたポリクローナル血清に存在する抗原特異的抗体が、事前に形成されたカンジダトロピカリスバイオフィルムに及ぼす影響を評価するための詳細なin vitroプロトコルの概要を示しています。これを達成するために、XTT還元アッセイに基づく方法が実験室で最適化および開発され、抗体の有無にかかわらず、バイオフィルムの生存率を高速、高感度、およびハイスループットの方法で測定できます。

XTTアッセイは、細胞生存率、細胞増殖、および細胞毒性の指標として細胞代謝活性を測定するために使用されます20。この比色アッセイは、代謝活性細胞による黄色テトラゾリウム塩ナトリウム3'-[1-(フェニルアミノカルボニル)-3,4-テトラゾリウム]-ビス(4-メトキシ-6-ニトロ)ベンゼンスルホン酸水和物(XTT)のオレンジホルマザン色素への還元に基づいています。生存細胞のみがXTTを減少させることができるので、減少したXTTホルマザンの量は、色の強度および細胞生存率に比例する。形成されたホルマザン色素は水溶性であり、プレートリーダーを使用して直接定量されます。その水溶性の性質により、XTTアッセイは、バイオフィルム構造を破壊することなく、無傷のバイオフィルムの研究、ならびにバイオフィルムの薬物感受性の検査を可能にする21。さらに、この方法は、その使いやすさ、速度、精度、高スループット、および高い再現性のために、カンジダ菌の生存率評価に実装されています7,22。

XTT還元アッセイに加えて、バイオフィルム量の測定のための多数の代替技術も同定されている。これらのいくつかには、MTT還元アッセイ、クリスタルバイオレット染色、DNA定量、定量PCR、タンパク質定量、乾燥細胞重量測定、および生菌コロニーカウントの使用が含まれます。これらの手順は、時間とコストの要件の点で大きく異なります。Taffらは、7つの異なるカン ジダ バイオフィルム定量アッセイの比較分析を実施し、XTTアッセイが C.アルビカンス バイオフィルムの定量的推定のための最も再現性があり、正確で、効率的な方法を提供することを発見しました23。クリスタルバイオレットなどの染色技術には特定の制限があります。クリスタルバイオレット試験は、クリスタルバイオレット染色されたバイオフィルムマトリックスと細胞の光学密度を測定することにより、バイオフィルムの量を間接的に決定します。クリスタルバイオレットアッセイはバイオフィルム質量の良好な尺度を提供するが、微生物細胞および細胞外マトリックス24の両方を染色するので、バイオフィルム生存率の尺度を与えない。Dhaleらはさらに、XTT還元アッセイは、クリスタルバイオレットアッセイと比較して、バイオフィルム産生を検出するための最も感度が高く、再現性があり、正確で、効率的で、特異的な方法であると報告しました25。文献報告によると、XTTアッセイはCFU計数法のCFU/mLパラメータとよく相関しています。ただし、XTTアッセイと比較して、CFU法は労働集約的で遅い26。さらに、分離された生細胞の画分は、初期のバイオフィルム集団27を代表するものではないかもしれない。XTT還元アッセイは、生存率を定量化するための最良の選択肢のようですが、この手法にはいくつかの制限があります。XTT法は、1つの真菌株を含む比較には有用ですが、異なる真菌株および種を比較する場合、その使用が制限される可能性があります。異なる株が異なる能力を持つ基質を代謝するため、詳細な標準化がない場合、菌株間比較は困難な場合があります21。

プロトコル

BALB/cマウスはIITルールキーの小動物施設に収容された。すべての動物を25°Cで12時間:12時間の明暗サイクルで維持し、ペレット食と水を 自由に与えました。すべての動物の手順は、IITルールキーの制度的動物倫理委員会(IAEC)によって承認されました。

1. C.トロピカリスの調製

注:真菌 カンジダトロピカリスは リスクグループ2病原体に属し、BSL2微生物に分類されます。 カンジダ 種を扱うときは、常に認定されたクラスII生物学的安全キャビネットを使用してください。 C. tropicalis での作業中に無菌および滅菌技術を実践し、この病原体を適切に処分するために推奨されるバイオセーフティ手順に従ってください。

  1. サブローデキストロース(SAB)寒天プレート上にC. トロピカリス (ATCC 750株)をストリークします。
  2. SAB寒天プレートから10 mLのSABブロス培地を含む滅菌済みの50 mLコニカルチューブに単一のコロニーを接種することにより、 C.トロピカリスの 一晩成長培養物を調製します。あるいは、 C. tropicalis の凍結グリセロールストックを使用し、100 μLのグリセロールストックを50 mLのSABブロス培地を含む滅菌済みの250 mLコニカルフラスコに接種します。
  3. C. tropicalis培養物をオービタルシェーカーで180 rpm、30°Cで24〜48時間インキュベートします。
  4. 真菌培養物(対数期の細胞)を2,150 × g で21°Cで15分間遠心分離します。
  5. 上清を廃棄し、50 mLの滅菌1x PBSをペレットに加えます。ペレットを洗浄し、穏やかなボルテックスで滅菌1x PBSに再懸濁します。
  6. 2,150 × g で21°Cで15分間遠心分離します。 上清を廃棄し、真菌ペレットを10 mLの滅菌1x PBSに再懸濁します。
  7. 血球計算盤で数えて細胞の濃度を計算します。
  8. RPMI 1640モルホリンプロパンスルホン酸(MOPS)培地で最終密度1.0 ×10 6 細胞/mLで真菌ストックを調製します。ステップ1.6の細胞懸濁液をすぐに使用してください。
    注:96ウェルプレートを1枚セットアップするには、必要な真菌ストックの総容量が10 mL(100 μL/ウェル)です。必要に応じてスケーリングします。

2. C.トロピカリス バイオフィルム形成

  1. 前述のように、96ウェル平底ポリスチレンマイクロタイタープレートでカンジダバイオフィルムを調製します(図1)28,29。
  2. マルチチャンネルピペットを使用して、100 μLの C. tropicalis 培養液(上記のように調製した106 細胞/mLストックから)を96ウェルマイクロタイタープレートに加えます(図2A)。最後の2つの列(11と12)は、真菌細胞を追加しないことで、「真菌と血清なし」および「真菌なし、血清なし」のネガティブコントロールとして保持します。カラム11および12に100 μLのRPMI 1640 MOPS培地のみを入れます。
  3. マイクロタイタープレートを蓋とアルミホイルで覆います。プレートを静止条件下で37°Cで24時間インキュベートします。
  4. 翌日、マルチチャンネルピペットを使用して培地を注意深く吸引します(バイオフィルムに触れたり破壊したりすることなく)。ブロッティングシート上でプレートを逆さまにして軽くたたき、残留培地を取り除きます。
  5. マルチチャンネルピペットを使用して、200 μLの1x PBS(ウェルあたり)でプレートを洗浄します。バイオフィルムを破壊しないように、井戸の側壁に沿ってPBSを非常に穏やかに追加します。マルチチャンネルピペットを使用してPBSを注意深く吸引します。PBS洗浄を2回繰り返します(合計3回の洗浄)。
  6. 余分なPBSを除去するには、生物学的安全キャビネット内でプレート(蓋なし)を室温で30分間風乾します。

3.抗体によるバイオフィルムの処理

注:バイオフィルムは、抗体によるバイオフィルム成熟の阻害を評価するために処理できるようになりました。マウス血清をポリクローナル抗体の供給源として使用した。Sap2免疫の異なる群(Sap2−アルビカンス、Sap2−トロピカリス、およびSap2−パラプシロシス)を、偽免疫マウスと共に眼窩後採血し、血清を前述のように単離した19。抗Sap2抗体の存在は、前述のようにSap2特異的ELISAを用いて確認した19。

  1. 使用前に血清(ポリクローナル抗体の供給源)を56°Cで30分間熱不活性化して、阻害活性における補体の役割を除外します。血清を希釈する前に血清を熱失活させます。
    注:追加のコントロールとして、偽免疫マウス、免疫前マウス、およびSap2特異的抗体枯渇血清からの血清を使用してください19。抗体枯渇血清は、以前の研究19に従って調製した。このプロトコルでテストされた血清の連続希釈(1:25、1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1,600、1:3,200、1:6,400、および1:12,800)のうち、バイオフィルム成熟の阻害は1:25、1:50、および1:100で観察されました。したがって、抑制と血清消費のバランスをとるために1:50が選択されました。
  2. 熱不活化血清サンプルの段階希釈液を滅菌RPMI 1640 MOPS培地(1:50)で調製します。バイオフィルム成熟の阻害について試験するすべての血清サンプルに共通の血清希釈液(1:50)を使用する30。
  3. 選択した血清希釈液100 μLを96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに追加します。サンプルごとに、添付のレイアウトに従って血清希釈液を二重に追加します(図2B)。
    1. 列10では、血清希釈を加えないでください。 真菌のみ のポジティブコントロールのためにRPMI 1640 MOPS培地のみを追加します。
      注:列10、行G1-G8およびH1-H8は、最初にRPMI-MOPSに真菌細胞を持っていました。しかし、RPMI-MOPSは24時間後でもカラム10に追加されたが、行G1-G8はPBSコントロールとして機能し、行H1-H8は24時間後に無血清コントロールとして機能した。
    2. 列11で、すべてのウェルに血清の1:50希釈を加えて、 真菌なしと血清陰性対照として機能します。
    3. 列12では、血清希釈液をウェルに加えないでください。これを 無菌無血清陰性対照として保管してください。
  4. プレートを蓋とアルミホイルで覆います。プレートを37°Cで24時間インキュベートします。

4. バイオフィルム代謝活性推定

  1. 翌日、マルチチャンネルピペットを使用して血清を注意深く吸引します(バイオフィルムに触れたり破壊したりすることなく)。プレートを吸い取りシート上で逆さまにして軽くたたき、残留血清を取り除きます。
  2. マルチチャンネルピペットを使用して200 μLの1x PBS(ウェルあたり)でプレートを洗浄し、バイオフィルムの破壊を避けるためにウェルの側壁に沿ってPBSを追加します。マルチチャンネルピペットを使用してPBSを注意深く吸引し、PBS洗浄を2回繰り返します(合計3回の洗浄)。プレート(蓋なし)を生物学的安全キャビネット内で室温で30分間風乾し、余分なPBSを乾燥させます。
  3. XTT /メナジオンの調製:
    1. XTTを滅菌リンガー乳酸塩で0.5 g / L溶液として調製します。25 mgのXTTを50 mLのフィルター滅菌リンガー乳酸塩に溶解します。アルミホイルで覆った別のチューブに10 mLを分注し、-80°Cで保存します。
    2. メナジオンを10 mMストックとして準備します。8.6 mgのメナジオンを5 mLのアセトンに溶解し、50 μLを100本の別々のマイクロチューブに分配します。アリコートは-80°Cで保存してください。
    3. 使用直前にXTT/メナジオン溶液を調製するには、XTT 10 mLを服用し、メナジオンを1 μL添加して1 μMの作業溶液を得ます。
  4. 96ウェルマイクロタイタープレートのウェルあたり100 μLのXTT/メナジオン溶液を追加します。プレートを蓋とアルミホイルで覆います。プレートを暗所で37°Cで2時間インキュベートします。
  5. 着色された上清80 μLを各ウェルから新しい96ウェルプレートに移します。490 nmでプレートを読み取ります。
  6. 列10(真菌のみ陽性対照)のウェルの吸光度値の平均を計算し、これは式 (1)を用いて各血清サンプルによるバイオフィルム阻害の割合を計算するための基準値として役立つであろう。
    % バイオフィルム阻害 = 100 - figure-protocol-4704× 100 (1)

結果

カンジダ・トロピカリスのバイオフィルムを96ウェルマイクロタイタープレートで増殖させ、倒立顕微鏡を用いて40倍で画像化した(図1A)。バイオフィルムをさらにクリスタルバイオレットを用いて染色し、倒立顕微鏡を用いて40倍で観察した(図1B)。走査型電子顕微鏡は、C.トロピカリスバイオフィルムの代表的な画像を示す(

ディスカッション

カンジダ種によって引き起こされる真菌感染症は、世界中で高い罹患率と死亡率に関連しています。侵襲性真菌感染症の脅威の高まりは、そのような生命を脅かす病気の早期管理を必要とします。ほとんどのカンジダ感染症は、さまざまな医療機器に付着し、病院環境での真菌感染症の持続と再発の原因となるバイオフィルムの形成を伴います31。バイオフィ?...

開示事項

著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

この研究は、ラマリンガスワミ助成金DBT-843-BIO(インド政府バイオテクノロジー省)および早期キャリア研究賞SER-1058-BIO(インド政府科学技術研究委員会)によってS.R.に支援されました。著者らは、ICMR-JRFのP.C.への助成金とDBT-JRFのP.S.への助成金を認めている。著者らは、SEM中のPradeep Singh Thakur氏による原稿と技術支援に関する提案について、Ravikant Ranjan博士に感謝する。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL conical centrifuge tubesBD Falcon546021
1x PBS-Prepared in labNaCl : 4 g
KCl : 0.1 g
Na2HPO4:  0.72 g
KH2PO4 : 0.12 g
Water 500 mL. Adjust pH to 7.4
50 mL conical centrifuge tubesBD Falcon546041
96-well microtiter platesNunc442404
IncubatorGeneric
MenadioneSigmaM5625
Microtiter Plate ReaderGeneric
Multichannel pipette and tipsGeneric
Petri dishesTarson460090
Ringers Lactate-Prepared in labsodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0 
RPMI 1640 MOPSHimediaAT180
Sabouraud dextrose AgarSRL24613
Sabouraud dextrose BrothSRL24835
XTT InvitrogenX6493

参考文献

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