Um ensaio de redução solúvel à base de tetrazólio para avaliar o efeito de anticorpos em biofilmes de Candida tropicalis

Resumo

Um protocolo baseado em placa de microtitulação de 96 poços usando um ensaio de redução de 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-carboxanilidade-2H-tetrazólio (XTT) é descrito neste documento, para estudar os efeitos de anticorpos em biofilmes formados por C. tropicalis. Este protocolo in vitro pode ser usado para verificar o efeito de potenciais novos compostos antifúngicos sobre a atividade metabólica de células de espécies de Candida em biofilmes.

Resumo

As espécies de Candida são a quarta causa mais comum de infecções nosocomiais sistêmicas. A candidíase sistêmica ou invasiva frequentemente envolve a formação de biofilme em dispositivos implantados ou cateteres, o que está associado ao aumento da virulência e mortalidade. Biofilmes produzidos por diferentes espécies de Candida exibem maior resistência contra várias drogas antifúngicas. Portanto, há uma necessidade de desenvolver imunoterapias eficazes ou tratamentos adjuvantes contra biofilmes de Candida. Embora o papel da imunidade celular esteja bem estabelecido na proteção anti-Candida, o papel da imunidade humoral tem sido estudado menos.

Foi levantada a hipótese de que a inibição da formação e maturação de biofilme é uma das principais funções dos anticorpos protetores, e os anticorpos do tubo germinativo de Candida albicans (CAGTA) demonstraram suprimir o crescimento in vitro e a formação de biofilme de C. albicans mais cedo. Este artigo descreve um protocolo detalhado para avaliar o papel de anticorpos em biofilmes formados por C. tropicalis. A metodologia para este protocolo envolve a formação de biofilme de C. tropicalis em placas de microtitulação de 96 poços, que foram então incubadas na presença ou ausência de anticorpos antígeno-específicos, seguidas por um ensaio de 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-carboxanilide-2H-tetrazólio (XTT) para medir a atividade metabólica de células fúngicas no biofilme.

A especificidade foi confirmada pelo uso de controles séricos apropriados, incluindo soro depletado de anticorpos específicos de Sap2. Os resultados demonstram que os anticorpos presentes no soro de animais imunizados podem inibir a maturação in vitro do biofilme de Candida. Em resumo, este artigo fornece informações importantes sobre o potencial dos anticorpos no desenvolvimento de novas imunoterapias e tratamentos sinérgicos ou adjuvantes contra biofilmes durante a candidíase invasiva. Este protocolo in vitro pode ser usado para verificar o efeito de potenciais novos compostos antifúngicos sobre a atividade metabólica de células de espécies de Candida em biofilmes.

Introdução

A candidíase sistêmica é a quarta principal causa de infecções nosocomiais, que estão associadas a altas taxas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Globalmente, a candidíase sistêmica afeta aproximadamente 700.000 indivíduos¹. Espécies de Candida, a saber, C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata e C. auris, são a causa mais comum de infecções invasivas por Candida ². As espécies de Candida são patógenos oportunistas que produzem biofilmes³. Os biofilmes estão predominantemente associados à virulência de Candida, e a Candida pode suportar condições de estresse oxidativo e osmótico induzindo a formação de biofilme⁴. Os biofilmes modulam ainda mais a expressão de fatores de virulência e componentes da parede celular e formam uma matriz protetora exopolimérica, ajudando a Candida a se adaptar a diferentes nichos de hospedeiros⁴. Os biofilmes contribuem para a aderência da levedura nos tecidos do hospedeiro e instrumentos médicos⁵. Como tal, a formação de biofilme está associada a uma vantagem para as leveduras, uma vez que as células de levedura dentro dos biofilmes podem evadir a resposta imune do hospedeiro⁶. A formação de biofilme também protege as leveduras patogênicas da ação de drogas antifúngicas⁵. A diminuição da suscetibilidade dos biofilmes de C. albicans à anfotericina B foi demonstrada por Pierce et ^al.7,8. Além disso, os biofilmes demonstram resistência a medicamentos antifúngicos ao fluconazol, o que prejudica o manejo efetivo da candidíase sistêmica ^9,10.

Os micróbios têm uma tendência intrínseca a aderir a várias superfícies bióticas e abióticas, o que resulta na formação de biofilme. Candida albicans, que é um fungo dimórfico, existe nas formas levedura e hifal, e sua formação de biofilme tem sido caracterizada em vários sistemas modelo in vitro e in vivo ¹¹. As etapas da formação do biofilme incluem a adesão das células de Candida ao substrato, a filamentação, a proliferação e a maturação do biofilme¹¹. Inicialmente, a forma de levedura de C. albicans adere a substratos, incluindo dispositivos médicos e tecido humano, seguida de filamentação e proliferação de C. albicans em formas hifais e pseudo-hifais e, finalmente, maturação de biofilmes embutidos na matriz extracelular¹¹. A formação de biofilme contribui em grande parte para os mecanismos de patogênese de C. albicans ¹². As espécies de Candida formam biofilmes resistentes a medicamentos, o que torna sua erradicação desafiadora¹³. Um pequeno subconjunto da população produtora de biofilme de C. albicans tem sido descrito como altamente resistente aos antifúngicos anfotericina B e clorexidina¹⁴. Vale ressaltar que as células de levedura em biofilmes apresentam alta resistência à poliquimioterapia em comparação com as células de levedura na fase planctônica e na fase de proliferação¹⁴. Tem sido sugerido que as células de levedura existentes em biofilmes são altamente tolerantes a drogas antifúngicas, o que contribui para a sobrevivência de C. albicans em biofilmes¹⁴. Essas células existentes foram relatadas como variantes fenotípicas de C. albicans e não mutantes¹⁴. Além disso, células de biofilmes de Candida conhecidas como "células persistentes" são tolerantes a altas doses de tratamento com anfotericina B e contribuem para a sobrevivência de Candida, representando assim uma grande carga de infecções sistêmicas recorrentes por Candida em indivíduos de alto risco¹⁵.

O aumento da resistência a medicamentos antifúngicos em cepas de Candida requer pesquisa para novos agentes antifúngicos e imunoterapias. Como evidenciado a partir dos estudos acima mencionados, os biofilmes de Candida mostram diminuição da suscetibilidade a drogas antifúngicas. Portanto, há uma necessidade de imunoterapias melhoradas para controlar a formação de biofilme de Candida. Estudos anteriores mostraram que a CAGTA pode fornecer proteção eficaz contra infecções sistêmicas por Candida, inibindo a formação de biofilme de C. albicans in vitro¹⁶. Outro estudo relatou que a imunização de camundongos com a proteína rAls3-N de C. albicans induz altos títulos de anticorpos que interferem na formação de biofilme de C. albicans in vitro ¹⁷. Os anticorpos anti-Als3-N também exerceram efeito inibitório sobre a dispersão de C. albicans a partir de biofilmes¹⁷. A vacina NDV-3A à base de C. albicans está atualmente em fase de ensaio clínico e os soros anti-NDV-3A também reduziram a formação de biofilme de C. auris ¹⁸. Um estudo recente identificou a inibição da formação de biofilme por anticorpos Sap2 como mecanismo de proteção em um modelo murino de candidíase sistêmica¹⁹.

Este trabalho descreve um protocolo in vitro detalhado para avaliar o efeito de anticorpos antígeno-específicos presentes no soro policlonal obtidos de diferentes grupos de camundongos vacinados com Sap2 em biofilmes pré-formados de Candida tropicalis . Para isso, um método baseado em um ensaio de redução de XTT foi otimizado e desenvolvido em laboratório, que pode medir a viabilidade do biofilme de forma rápida, sensível e de alto rendimento, na presença ou ausência de anticorpos.

O ensaio XTT é utilizado para medir a atividade metabólica celular como indicador de viabilidade celular, proliferação celular e citotoxicidade²⁰. Este ensaio colorimétrico baseia-se na redução de um sal de tetrazólio amarelo, sódio 3'-[1-(fenilaminocarbonil)-3,4-tetrazólio]-bis (4-metoxi-6-nitro) benzeno sulfônico hidratado (XTT) para um corante formazan laranja por células metabolicamente ativas. Como apenas células viáveis podem reduzir o XTT, a quantidade de XTT formazan reduzido é proporcional à intensidade da cor e à viabilidade celular. O corante formazan formado é solúvel em água e é diretamente quantificado usando um leitor de placas. Devido à sua natureza solúvel em água, o ensaio XTT permite o estudo de biofilmes intactos, bem como o exame da suscetibilidade a fármacos bioplápticos, sem interrupção da estrutura do biofilme²¹. Além disso, esse método é implementado nas avaliações de viabilidade fúngica de Candida devido à sua facilidade de uso, velocidade, precisão, alto rendimento e alto grau de reprodutibilidade ^7,22.

Além do ensaio de redução de XTT, inúmeras técnicas alternativas também foram identificadas para a medição da quantidade de biofilme. Alguns deles incluem o uso do ensaio de redução de MTT, coloração violeta cristalina, quantificação de DNA, PCR quantitativa, quantificação de proteínas, medição do peso das células secas e contagem viável de colônias. Esses procedimentos variam muito em termos de seus requisitos de tempo e custo. Taff et al. realizaram uma análise comparativa de sete diferentes ensaios de quantificação de biofilme de Candida e descobriram que o ensaio de XTT forneceu o método mais reprodutível, preciso e eficiente para a estimativa quantitativa de biofilmes de C. albicans ²³. Técnicas de coloração como o violeta cristal têm certas limitações; o teste de violeta cristal determina indiretamente a quantidade de biofilme medindo a densidade óptica da matriz e das células de biofilme coradas com violeta cristal. Embora o ensaio de violeta cristal forneça uma boa medida de massa de biofilme, ele não fornece uma medida de viabilidade do biofilme, pois cora tanto as células microbianas quanto a matriz extracelular²⁴. Dhale et al. relataram ainda que o ensaio de redução de XTT foi o método mais sensível, reprodutível, preciso, eficiente e específico para detectar a produção de biofilme em comparação com o ensaio violeta cristal²⁵. Relatos da literatura têm mostrado que o ensaio de XTT se correlaciona bem com o parâmetro UFC/mL no método de contagem de UFC. No entanto, em comparação com o ensaio XTT, o método CFU é trabalhoso e lento²⁶. Além disso, a fração de células vivas destacadas pode não ser representativa da população inicial de biofilme²⁷. Embora o ensaio de redução de XTT pareça a melhor opção disponível para quantificar a viabilidade, existem algumas limitações dessa técnica. Embora o método XTT seja útil para comparações envolvendo uma cepa fúngica, seu uso pode ser limitado ao comparar diferentes cepas e espécies de fungos. Comparações entre cepas podem ser difíceis na ausência de padronização detalhada, uma vez que diferentes cepas metabolizam substratos com diferentes capacidades²¹.

Protocolo

Camundongos BALB/c foram alojados no Small Animal Facility no IIT Roorkee. Todos os animais foram mantidos em um ciclo claro:escuro de 12 h:12 h a 25 °C e receberam dieta de pellets e água ad libitum. Todos os procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Ética Animal (IAEC) do IIT Roorkee.

1. Preparação de C. tropicalis

NOTA: O fungo Candida tropicalis pertence aos patógenos do Grupo de Risco 2 e é classificado como um microrganismo BSL2. Sempre use armários de segurança biológica de classe II certificados ao trabalhar com espécies de Candida . Praticar técnicas assépticas e estéreis durante o trabalho com C. tropicalis e seguir os procedimentos de biossegurança recomendados para o descarte adequado deste patógeno.

1. Streak C. tropicalis (cepa ATCC 750) em uma placa de ágar Sabouraud dextrose (SAB).
2. Preparar uma cultura cultivada durante a noite de C. tropicalis inoculando uma única colônia da placa de ágar SAB em um tubo cônico estéril de 50 mL contendo 10 mL de caldo de shab. Alternativamente, use um estoque de glicerol congelado de C. tropicalis e inocular 100 μL do estoque de glicerol em um frasco cônico estéril de 250 mL contendo 50 mL de caldo de meio de caldo.
3. Incubar cultura de C. tropicalis em agitador orbital a 180 rpm a 30 °C por 24-48 h.
4. Centrifugar a cultura fúngica (células em fase logarítmica) a 2.150 × g durante 15 min a 21 °C.
5. Descarte o sobrenadante e adicione 50 mL de PBS 1x estéril ao pellet. Lave e ressuscite o pellet em PBS estéril 1x com vórtice suave.
6. Centrifugar novamente a 2.150 × g durante 15 min a 21 °C. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet fúngico em 10 mL de PBS 1x estéril.
7. Calcule a concentração de células contando com um hemocitômetro.
8. Preparar estoques de fungos em uma densidade final de 1,0 × 10⁶ células/mL em meio de ácido morfolinepropanosulfônico (MOPS) RPMI 1640. Use a suspensão celular da etapa 1.6 imediatamente.
   NOTA: Para configurar uma placa de 96 poços, o volume total de estoque fúngico necessário é de 10 mL (100 μL/poço). Dimensione conforme necessário.

2. Formação do biofilme de C. tropicalis

1. Preparar biofilmes de Candida em uma placa de microtitulação de poliestireno de fundo plano de 96 poços, conforme descrito anteriormente (Figura 1)^28,29.
2. Adicionar 100 μL de cultura de C. tropicalis (de 10 a⁶ células/mL de estoque, preparada como acima) a uma placa de microtitulação de 96 poços usando uma pipeta multicanal (Figura 2A). Mantenha as duas últimas colunas (11 e 12) como controles negativos "sem fungo mais soro" e "sem fungo e sem soro", não adicionando células fúngicas. Encha as colunas 11 e 12 com 100 μL de RPMI 1640 MOPS apenas em média.
3. Cubra a placa de microtitulação com uma tampa e papel alumínio. Incubar a placa durante 24 h a 37 °C em condições estacionárias.
4. No dia seguinte, aspirar o meio cuidadosamente usando uma pipeta multicanal (sem tocar ou interromper os biofilmes). Bata suavemente na placa em uma posição invertida em folhas de blotting para remover qualquer meio residual.
5. Lave a placa com 200 μL de 1x PBS (por poço) usando uma pipeta multicanal. Adicione PBS muito suavemente ao longo das paredes laterais do poço para evitar interromper os biofilmes. Aspirar o PBS cuidadosamente usando uma pipeta multicanal. Repita a lavagem PBS 2x (um total de três lavagens).
6. Para remover o excesso de PBS, seque a placa ao ar (sem a tampa) por 30 minutos à temperatura ambiente, dentro de um armário de segurança biológica.

3. Tratamento do biofilme com anticorpos

NOTA: Os biofilmes podem agora ser processados para avaliar a inibição da maturação do biofilme por anticorpos. O soro murino foi utilizado como fonte de anticorpos policlonais. Diferentes grupos de camundongos imunizados com Sap2 (Sap2-albicans, Sap2-tropicalis e Sap2-parapsilosis), juntamente com camundongos imunizados simuladamente, foram sangrados retro-orbitalmente e o soro foi isolado conforme descrito anteriormente¹⁹. A presença de anticorpos anti-Sap2 foi confirmada usando ELISA específico para Sap2, conforme descrito anteriormente¹⁹.

1. Realizar inativação térmica do soro (fonte de anticorpos policlonais) a 56 °C durante 30 min antes de utilizar para descartar o papel do complemento na atividade inibitória. Inative o soro pelo calor antes de fazer a diluição do soro.
   NOTA: Use soro de camundongos imunizados simuladamente, camundongos pré-imunes e soro depletado de anticorpos específicos do Sap2 como controles adicionais¹⁹. O soro depletado de anticorpos foi preparado de acordo com um estudo anterior¹⁹. Dentre as diluições seriadas (1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1.600, 1:3.200, 1:6.400 e 1:12.800) para soro testado neste protocolo, observou-se inibição da maturação do biofilme em 1:25, 1:50 e 1:100; assim, 1:50 foi selecionado para encontrar um equilíbrio entre inibição e consumo de soro.
2. Preparar diluições em série de amostras de soro inativadas pelo calor em meio estéril RPMI 1640 MOPS (1:50). Utilizar uma diluição sérica comum (1:50) para todas as amostras de soro a serem testadas quanto à inibição da maturação do biofilme³⁰.
3. Adicionar 100 μL da diluição sérica seleccionada a cada alvéolo da placa de microtitulação de 96 alvéolos. Para cada amostra, adicionar diluições séricas em duplicata, de acordo com o esquema em anexo (Figura 2B).
   1. Na coluna 10, não adicione diluição sérica; adicionar apenas o meio RPMI 1640 MOPS para o controle positivo somente de fungos .
      NOTA: Coluna 10, linhas G1-G8 e H1-H8 inicialmente tinham células fúngicas em RPMI-MOPS. No entanto, enquanto o RPMI-MOPS foi adicionado à coluna 10 mesmo após 24 h, as linhas G1-G8 serviram como controle PBS e as linhas H1-H8 como controle sem soro após 24 h.
   2. Na coluna 11, adicionar uma diluição de soro de 1:50 a todos os poços para servir como o não fungo mais o controle sérico negativo.
   3. Na coluna 12, não adicione diluição sérica a nenhum alvéolo; manter isso como o não fungo sem controle negativo sérico.
4. Cubra a placa com uma tampa e papel alumínio. Incubar a placa durante 24 h a 37 °C.

4. Estimativa da atividade metabólica do biofilme

1. No dia seguinte, aspirar o soro cuidadosamente usando uma pipeta multicanal (sem tocar ou interromper os biofilmes). Bata suavemente na placa em uma posição invertida em folhas de blotting para remover qualquer soro residual.
2. Lave a placa com 200 μL de 1x PBS (por poço) usando uma pipeta multicanal, adicionando o PBS ao longo das paredes laterais do poço para evitar interromper os biofilmes. Aspirar o PBS cuidadosamente usando uma pipeta multicanal e repetir a lavagem PBS 2x (um total de três lavagens). Seque a placa ao ar (sem tampa) por 30 minutos à temperatura ambiente, dentro de um armário de segurança biológica para secar qualquer excesso de PBS.
3. Preparação de XTT/menadiona:
   1. Preparar XTT em Ringers Lactate estéril como uma solução de 0,5 g/L. Dissolva 25 mg de XTT em 50 mL de Ringers Lactato esterilizado por filtro. Aliquot 10 mL em tubos separados cobertos com folha de alumínio e armazenar a -80 °C.
   2. Prepare a menadiona como um estoque de 10 mM. Dissolver 8,6 mg de menadiona em 5 mL de acetona e distribuir 50 μL em 100 microtubos separados. Conservar as alíquotas a -80 °C.
   3. Prepare a solução de XTT/menadiona imediatamente antes da utilização, tomando 10 ml de XTT e adicionando 1 μL de menadiona para obter uma solução de trabalho de 1 μM.
4. Adicionar 100 μL da solução de XTT/menadiona por alvéolo da placa de microtitulação de 96 poços. Cubra a placa com uma tampa e papel alumínio. Incubar a placa durante 2 h a 37 °C no escuro.
5. Transfira 80 μL do sobrenadante colorido de cada poço para uma placa fresca de 96 poços. Leia a placa a 490 nm.
6. Calcular a média dos valores de absorbância dos poços na coluna 10 (controle positivo somente de fungos), que servirá como valor de referência para o cálculo da porcentagem de inibição do biofilme por cada amostra de soro usando a equação (1).
   % de inibição do biofilme = 100 - × 100 (1)

Resultados

Os biofilmes de Candida tropicalis foram cultivados em placas de microtitulação de 96 poços e fotografados a 40x utilizando microscópio invertido (Figura 1A). O biofilme foi ainda corado com cristal violeta e observado a 40x com microscópio invertido (Figura 1B). A microscopia eletrônica de varredura mostra uma imagem representativa do biofilme de C. tropicalis (Figura 1C). Para a realização do ensaio de in...

Discussão

As infecções fúngicas causadas por espécies de Candida estão associadas a altas taxas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. A crescente ameaça de infecção fúngica invasiva requer o manejo precoce de tais doenças com risco de vida. A maioria das infecções por Candida envolve a formação de biofilmes, que aderem a uma variedade de dispositivos médicos e são responsáveis pela persistência e recorrência de infecções fúngicas em ambientes hospitalares³¹. Os ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical centrifuge tubes	BD Falcon	546021
1x PBS	-	Prepared in lab	NaCl : 4 g KCl : 0.1 g Na2HPO4:  0.72 g KH2PO4 : 0.12 g Water 500 mL. Adjust pH to 7.4
50 mL conical centrifuge tubes	BD Falcon	546041
96-well microtiter plates	Nunc	442404
Incubator	Generic
Menadione	Sigma	M5625
Microtiter Plate Reader	Generic
Multichannel pipette and tips	Generic
Petri dishes	Tarson	460090
Ringers Lactate	-	Prepared in lab	sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0
RPMI 1640 MOPS	Himedia	AT180
Sabouraud dextrose Agar	SRL	24613
Sabouraud dextrose Broth	SRL	24835
XTT	Invitrogen	X6493