JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Antikorların C. tropicalis tarafından oluşturulan biyofilmler üzerindeki etkilerini incelemek için 2,3-bis (2-metoksi-4-nitro-5-sülfofenil)-5-karboksanil-2H-tetrazolyum (XTT) indirgeme testi kullanan 96 kuyucuklu mikrotitrek plaka bazlı bir protokol burada açıklanmıştır. Bu in vitro protokol, potansiyel yeni antifungal bileşiklerin biyofilmlerdeki Candida türü hücrelerinin metabolik aktivitesi üzerindeki etkisini kontrol etmek için kullanılabilir.

Özet

Candida türleri sistemik hastane enfeksiyonlarının dördüncü en yaygın nedenidir. Sistemik veya invaziv kandidiyazis sıklıkla implante edilen cihazlarda veya kateterlerde biyofilm oluşumunu içerir ve bu da artmış virülans ve mortalite ile ilişkilidir. Farklı Candida türleri tarafından üretilen biyofilmler, çeşitli antifungal ilaçlara karşı gelişmiş direnç gösterir. Bu nedenle, Candida biyofilmlerine karşı etkili immünoterapiler veya yardımcı tedaviler geliştirmeye ihtiyaç vardır. Hücresel bağışıklığın rolü anti-Candida korumasında iyi kurulmuş olsa da, humoral bağışıklığın rolü daha az çalışılmıştır.

Biyofilm oluşumunun ve olgunlaşmasının inhibisyonunun koruyucu antikorların ana işlevlerinden biri olduğu ve Candida albicans germ tüpü antikorlarının (CAGTA) daha önce C. albicans'ın in vitro büyümesini ve biyofilm oluşumunu baskıladığı gösterilmiştir. Bu yazıda, antikorların C. tropicalis tarafından oluşturulan biyofilmler üzerindeki rolünü değerlendirmek için ayrıntılı bir protokol özetlenmiştir. Bu protokolün metodolojisi, 96 kuyucuklu mikrotitre plakalarında C. tropicalis biyofilm oluşumunu içerir, bunlar daha sonra antijene özgü antikorların varlığında veya yokluğunda inkübe edilir, ardından biyofilmdeki mantar hücrelerinin metabolik aktivitesini ölçmek için 2,3-bis (2-metoksi-4-nitro-5-sülfofenil)-5-karboksanilid-2H-tetrazolyum (XTT) testi yapılır.

Özgüllük, Sap2'ye özgü antikor tükenmiş serum da dahil olmak üzere uygun serum kontrolleri kullanılarak doğrulandı. Sonuçlar, bağışıklanmış hayvanların serumunda bulunan antikorların in vitro Candida biyofilm olgunlaşmasını inhibe edebileceğini göstermektedir. Özetle, bu yazıda invaziv kandidiyazis sırasında biyofilmlere karşı yeni immünoterapiler ve sinerjik veya yardımcı tedaviler geliştirmede antikorların potansiyeli hakkında önemli bilgiler verilmektedir. Bu in vitro protokol, potansiyel yeni antifungal bileşiklerin biyofilmlerdeki Candida türü hücrelerinin metabolik aktivitesi üzerindeki etkisini kontrol etmek için kullanılabilir.

Giriş

Sistemik kandidiyazis, tüm dünyada yüksek morbidite ve mortalite oranları ile ilişkili olan hastane enfeksiyonlarının dördüncü majör nedenidir. Küresel olarak, sistemik kandidiyaz yaklaşık 700.000 kişiyi etkilemektedir1. Candida türleri, yani C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata ve C. auris, invaziv Candida enfeksiyonlarının en yaygın nedenidir2. Candida türleri, biyofilm üreten fırsatçı patojenlerdir3. Biyofilmler ağırlıklı olarak Candida virülansı ile ilişkilidir ve Candida, biyofilm oluşumunu indükleyerek oksidatif ve ozmotik stres koşullarına dayanabilir4. Biyofilmler ayrıca virülans faktörlerinin ve hücre duvarı bileşenlerinin ekspresyonunu modüle eder ve Candida'nın farklı konakçı nişlerine uyum sağlamasına yardımcı olan ekzopolimerik koruyucu bir matris oluşturur4. Biyofilmler konakçı dokularda ve tıbbi aletlerde maya yapışmasına katkıda bulunur5. Bu nedenle, biyofilm oluşumu mayalara bir avantaj ile ilişkilidir, çünkü biyofilmlerdeki maya hücreleri konakçı bağışıklık tepkisinden kaçabilir6. Biyofilm oluşumu ayrıca patojenik mayaları antifungal ilaçların etkisinden korur5. C. albicans biyofilmlerinin amfoterisin B'ye duyarlılığının azalması Pierce ve ark.7,8 tarafından gösterilmiştir. Ayrıca, biyofilmler flukonazole karşı antifungal ilaç direnci gösterir ve bu da sistemik kandidiyazisin etkin yönetimini bozar 9,10.

Mikroplar, çeşitli biyotik ve abiyotik yüzeylere yapışma konusunda içsel bir eğilime sahiptir ve bu da biyofilm oluşumuna neden olur. Dimorfik bir mantar olan Candida albicans, maya ve hifal formlarında bulunur ve biyofilm oluşumu çeşitli in vitro ve in vivo model sistemlerde karakterize edilmiştir11. Biyofilm oluşumunun aşamaları, Candida hücrelerinin substrata yapışmasını, filamentasyonu, proliferasyonu ve biyofilm olgunlaşmasını içerir11. Başlangıçta, C. albicans'ın maya formu, tıbbi cihazlar ve insan dokusu da dahil olmak üzere substratlara yapışır, bunu C. albicans'ın hifal ve psödohifal formlara filamentasyonu ve çoğalması ve son olarak hücre dışı matris11'e gömülü biyofilmlerin olgunlaşması izler. Biyofilm oluşumu C. albicans patogenez mekanizmalarına büyük ölçüde katkıda bulunur12. Candida türleri ilaca dirençli biyofilmler oluşturur ve bu da eradikasyonlarını zorlaştırır13. C. albicans biyofilm üreten popülasyonun küçük bir alt kümesi, antifungal ilaçlar amfoterisin B ve klorheksidin14'e karşı oldukça dirençli olarak tanımlanmıştır. Biyofilmlerdeki maya hücreleri, planktonik faz ve proliferasyon fazı14'teki maya hücrelerine kıyasla çoklu ilaç tedavisine karşı yüksek direnç gösterir. Biyofilmlerde bulunan maya hücrelerinin, biyofilmlerde C. albicans'ın hayatta kalmasına katkıda bulunan antifungal ilaçlara karşı oldukça toleranslı olduğu öne sürülmüştür14. Bu mevcut hücrelerin mutantlar değil C. albicans'ın fenotipik varyantları olduğu bildirilmiştir14. Ayrıca, "kalıcı hücreler" olarak bilinen Candida biyofilmlerinin hücreleri, yüksek dozlarda amfoterisin-B tedavisine toleranslıdır ve Candida'nın hayatta kalmasına katkıda bulunur, böylece yüksek riskli bireylerde tekrarlayan sistemik Candida enfeksiyonlarının büyük bir yükünü oluşturur15.

Candida suşlarında antifungal ilaç direncindeki artış, yeni antifungal ajanlar ve immünoterapiler için araştırma yapılmasını gerektirmektedir. Yukarıda belirtilen çalışmalardan da anlaşılacağı gibi, Candida biyofilmleri antifungal ilaçlara duyarlılığın azaldığını göstermektedir. Bu nedenle, Candida biyofilm oluşumunu kontrol etmek için geliştirilmiş immünoterapilere ihtiyaç vardır. Daha önceki çalışmalar, CAGTA'nın in vitro16 C. albicans biyofilm oluşumunu inhibe ederek sistemik Candida enfeksiyonlarına karşı etkili koruma sağlayabileceğini göstermiştir. Başka bir çalışma, farelerin C. albicans rAls3-N proteini ile bağışıklanmasının, in vitro17 C. albicans biyofilm oluşumuna müdahale eden yüksek antikor titrelerini indüklediğini bildirmiştir. Anti-Als3-N antikorları ayrıca biyofilmlerden C. albicans dispersiyonu üzerinde inhibitör bir etki göstermiştir17. C. albicans'a dayanan NDV-3A aşısı şu anda klinik deneme aşamasındadır ve anti-NDV-3A serumlarının da C. auris biyofilm oluşumunu azalttığı bulunmuştur18. Yakın zamanda yapılan bir çalışmada, sistemik kandidiyazis19'un murin modelinde bir koruma mekanizması olarak Sap2-antikorları tarafından biyofilm oluşumunun inhibisyonu tanımlanmıştır.

Bu yazıda, farklı Sap2 aşılı fare gruplarından elde edilen poliklonal serumda bulunan antijene özgü antikorların önceden oluşturulmuş Candida tropicalis biyofilmleri üzerindeki etkisini değerlendirmek için ayrıntılı bir in vitro protokol özetlenmiştir. Bunu başarmak için, laboratuvarda, antikorların varlığında veya yokluğunda biyofilm canlılığını hızlı, hassas ve yüksek verimli bir şekilde ölçebilen bir XTT indirgeme testine dayanan bir yöntem optimize edilmiş ve geliştirilmiştir.

XTT testi, hücre canlılığının, hücresel proliferasyonun ve sitotoksisitenin bir göstergesi olarak hücresel metabolik aktiviteyi ölçmek için kullanılır20. Bu kolorimetrik tahlil, sarı bir tetrazolyum tuzunun, sodyum 3'-[1-(fenilaminokarbonil)-3,4-tetrazolium]-bis (4-metoksi-6-nitro) benzen sülfonik asit hidratının (XTT) metabolik olarak aktif hücreler tarafından turuncu bir formazan boyasına indirgenmesine dayanmaktadır. Sadece canlı hücreler XTT'yi azaltabildiğinden, indirgenmiş XTT formazan miktarı, rengin yoğunluğu ve hücre canlılığı ile orantılıdır. Oluşan formazan boya suda çözünür ve bir plaka okuyucu kullanılarak doğrudan ölçülür. Suda çözünür doğası nedeniyle, XTT testi, biyofilm yapısının bozulmasından bozulmamış biyofilmlerin incelenmesine ve biyofilm ilaç duyarlılığının incelenmesine izin verir21. Ek olarak, bu yöntem kullanım kolaylığı, hızı, doğruluğu, yüksek verimi ve yüksek derecede tekrarlanabilirliği nedeniyle Candida mantar canlılığı değerlendirmelerinde uygulanır 7,22.

XTT indirgeme testine ek olarak, biyofilm miktarının ölçümü için çok sayıda alternatif teknik de tanımlanmıştır. Bunlardan bazıları MTT indirgeme testi, kristal menekşe boyama, DNA nicelleştirme, kantitatif PCR, protein miktarı, kuru hücre ağırlığı ölçümü ve canlı koloni sayımının kullanımını içerir. Bu prosedürler zaman ve maliyet gereksinimleri açısından büyük farklılıklar gösterir. Taff ve ark. yedi farklı Candida biyofilm kantitasyon testinin karşılaştırmalı bir analizini gerçekleştirdiler ve XTT testinin C. albicans biyofilmleri23'ün nicel tahmini için en tekrarlanabilir, doğru ve verimli yöntemi sağladığını buldular. Kristal menekşe gibi boyama tekniklerinin belirli sınırlamaları vardır; kristal menekşe testi, kristal menekşe boyalı biyofilm matrisinin ve hücrelerinin optik yoğunluğunu ölçerek dolaylı olarak biyofilm miktarını belirler. Kristal menekşe tahlili iyi bir biyofilm kütlesi ölçüsü sağlasa da, hem mikrobiyal hücreleri hem de hücre dışı matris24'ü boyadığı için biyofilm canlılığının bir ölçüsünü vermez. Dhale ve ark. ayrıca, XTT indirgeme testinin, kristal menekşe testi25'e kıyasla biyofilm üretimini tespit etmek için en hassas, tekrarlanabilir, doğru, verimli ve spesifik yöntem olduğunu bildirmiştir. Literatür raporları, XTT testinin CFU sayma yöntemindeki CFU / mL parametresi ile iyi ilişkili olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, XTT testi ile karşılaştırıldığında, CFU yöntemi emek yoğun ve yavaş26'dır. Ayrıca, ayrılmış canlı hücrelerin fraksiyonu, başlangıçtaki biyofilm popülasyonu27'yi temsil etmeyebilir. XTT indirgeme testi, uygulanabilirliği ölçmek için mevcut en iyi seçenek gibi görünse de, bu tekniğin birkaç sınırlaması vardır. XTT yöntemi, bir mantar suşunu içeren karşılaştırmalar için yararlı olsa da, farklı mantar suşlarını ve türlerini karşılaştırırken kullanımı sınırlı olabilir. Ayrıntılı standardizasyonun yokluğunda interstrain karşılaştırmaları zor olabilir, çünkü farklı suşlar farklı yeteneklere sahip substratları metabolize eder21.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

BALB / c fareleri, IIT Roorkee'deki Küçük Hayvan Tesisi'nde barındırıldı. Tüm hayvanlar 25 ° C'de 12 saat: 12 saat aydınlık: karanlık döngüde tutuldu ve bir pelet diyeti ve su ad libitum ile sağlandı. Tüm hayvan prosedürleri, IIT Roorkee'nin Kurumsal Hayvan Etiği Komitesi (IAEC) tarafından onaylanmıştır.

1. C. tropicalis'in hazırlanması

NOT: Candida tropicalis mantarı Risk Grubu 2 patojenlerine aittir ve BSL2 mikroorganizması olarak sınıflandırılır. Candida türleriyle çalışırken her zaman sertifikalı Sınıf II Biyolojik Güvenlik Kabinleri kullanın. C. tropicalis ile çalışma sırasında aseptik ve steril teknikler uygulayın ve bu patojenin uygun şekilde bertaraf edilmesi için önerilen biyogüvenlik prosedürlerini izleyin.

  1. Streak C. tropicalis (ATCC 750 suşu) bir Sabouraud dekstroz (SAB) agar plakası üzerine.
  2. SAB agar plakasından tek bir koloniyi, 10 mL SAB et suyu ortamı içeren steril 50 mL konik bir tüpe aşılayarak bir gecede yetiştirilen C. tropicalis kültürünü hazırlayın. Alternatif olarak, dondurulmuş bir C. tropicalis gliserol stoğu kullanın ve gliserol stoğunun 100 μL'sini, 50 mL SAB et suyu ortamı içeren steril bir 250 mL konik şişeye aşılayın.
  3. C. tropicalis kültürünü 24-48 saat boyunca 30 ° C'de 180 rpm'de yörüngesel bir çalkalayıcıda inkübe edin.
  4. Mantar kültürünü (logaritmik fazdaki hücreler) 21 ° C'de 15 dakika boyunca 2.150 × g'de santrifüj yapın.
  5. Süpernatantı atın ve pelete 50 mL steril 1x PBS ekleyin. Peleti steril 1x PBS'de nazik girdapla yıkayın ve tekrar askıya alın.
  6. 21 ° C'de 15 dakika boyunca 2.150 × g'da tekrar santrifüj. Süpernatantı atın ve mantar peletini 10 mL steril 1x PBS içinde yeniden askıya alın.
  7. Bir hemositometre ile sayarak hücrelerin konsantrasyonunu hesaplayın.
  8. RPMI 1640 morfolinpropansülfonik asit (MOPS) ortamında 1.0 × 106 hücre/ mL son yoğunlukta mantar stokları hazırlayın. Adım 1.6'daki hücre süspansiyonunu hemen kullanın.
    NOT: 96 delikli bir plaka kurmak için, gereken toplam mantar stok hacmi 10 mL'dir (100 μL/kuyu). Gerektiği gibi ölçeklendirin.

2. C. tropicalis biyofilm oluşumu

  1. Candida biyofilmlerini daha önce açıklandığı gibi 96 kuyucuklu düz tabanlı polistiren mikrotitre plakasında hazırlayın (Şekil 1)28,29.
  2. Çok kanallı pipet kullanarak96 delikli bir mikrotitre plakasına 100 μL C. tropicalis kültürü (yukarıda olduğu gibi hazırlanmış 10 6 hücre/mL stoktan) ekleyin (Şekil 2A). Son iki sütunu (11 ve 12) mantar hücreleri eklemeyerek 'mantar artı serum' ve 'mantar yok ve serum yok' negatif kontrolleri olarak tutun. 11 ve 12 numaralı sütunları yalnızca 100 μL RPMI 1640 MOPS ortamıyla doldurun.
  3. Mikrotitre plakasını bir kapak ve alüminyum folyo ile örtün. Sabit koşullar altında plakayı 37 °C'de 24 saat boyunca inkübe edin.
  4. Ertesi gün, çok kanallı bir pipet kullanarak ortamı dikkatlice aspire edin (biyofilmlere dokunmadan veya bozmadan). Artık ortamları çıkarmak için plakaya leke tabakaları üzerinde ters konumda hafifçe dokunun.
  5. Plakayı çok kanallı pipet kullanarak 200 μL 1x PBS (kuyucuk başına) ile yıkayın. Biyofilmleri bozmamak için kuyunun yan duvarları boyunca PBS'yi çok nazikçe ekleyin. PBS'yi çok kanallı pipet kullanarak dikkatlice aspire edin. PBS yıkamasını 2 kat tekrarlayın (toplam üç yıkama).
  6. Fazla PBS'yi çıkarmak için, plakayı (kapaksız) oda sıcaklığında, biyolojik bir güvenlik dolabı içinde 30 dakika boyunca havayla kurulayın.

3. Biyofilmin antikorlarla tedavisi

NOT: Biyofilmler artık antikorlar tarafından biyofilm olgunlaşmasının inhibisyonunu değerlendirmek için işlenebilir. Murin serumu poliklonal antikorların kaynağı olarak kullanıldı. Farklı Sap2-bağışıklanmış gruplar (Sap2-albicans, Sap2-tropicalis ve Sap2-parapsilaz), sahte bağışıklanmış farelerle birlikte retro-orbital olarak kanadı ve serum daha önce tarif edildiği gibi izole edildi19. Anti-Sap2 antikorlarının varlığı, daha önce tarif edildiği gibi Sap2-spesifik ELISA kullanılarak doğrulandı19.

  1. İnhibitör aktivitede komplemanın rolünü dışlamak için kullanmadan önce 30 dakika boyunca 56 ° C'de serumun (poliklonal antikorların kaynağı) ısı inaktivasyonunu gerçekleştirin. Serum seyreltme yapmadan önce serumu ısıl olarak inaktive edin.
    NOT: Ek kontroller olarak sahte bağışıklanmış farelerden, preimmün farelerden ve Sap2'ye özgü antikor tükenmiş serumdan serum kullanın19. Antikor tükenmiş serum önceki bir çalışmaya göre hazırlandı19. Bu protokolde test edilen serum için seri seyreltmeler arasında (1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1,600, 1:3,200, 1:6,400 ve 1:12,800) biyofilm olgunlaşmasının inhibisyonu 1:25, 1:50 ve 1:100'de gözlenmiştir; Bu nedenle, inhibisyon ve serum tüketimi arasında bir denge kurmak için 1:50 seçildi.
  2. Isı ile inaktive edilmiş serum örneklerinin seri seyreltilerini steril RPMI 1640 MOPS ortamında hazırlayın (1:50). Biyofilm olgunlaşmasının inhibisyonu için test edilecek tüm serum örnekleri için ortak bir serum seyreltmesi (1:50) kullanın 30.
  3. Seçilen serum seyreltmesinin 100 μL'sini 96 delikli mikrotitre plakasının her bir oluğuna ekleyin. Her numune için, ekli düzene göre serum seyreltilerini çift olarak ekleyin (Şekil 2B).
    1. 10. sütunda, serum seyreltmesi eklemeyin; sadece mantar pozitif kontrolü için sadece RPMI 1640 MOPS ortamı ekleyin.
      NOT: Sütun 10, G1-G8 ve H1-H8 satırları başlangıçta RPMI-MOPS'ta mantar hücrelerine sahipti. Bununla birlikte, RPMI-MOPS, 24 saat sonra bile sütun 10'a eklenirken, G1-G8 sıraları PBS kontrolü ve H1-H8 sıraları 24 saat sonra serumsuz kontrol olarak görev yaptı.
    2. 11. sütunda, mantarsız artı serum negatif kontrolü olarak hizmet etmek için tüm kuyucuklara 1:50 serum seyreltmesi ekleyin.
    3. Sütun 12'de, herhangi bir kuyucuğa serum seyreltmesi eklemeyin; bunu mantar yok serum negatif kontrolü yok olarak tutun.
  4. Plakayı bir kapak ve alüminyum folyo ile örtün. Plakayı 37 °C'de 24 saat boyunca inkübe edin.

4. Biyofilm metabolik aktivite tahmini

  1. Ertesi gün, çok kanallı bir pipet kullanarak serumu dikkatlice aspire edin (biyofilmlere dokunmadan veya bozmadan). Artık serumu çıkarmak için plakaya leke tabakaları üzerinde ters yönde hafifçe dokunun.
  2. Çok kanallı pipet kullanarak plakayı 200 μL 1x PBS (kuyu başına) ile yıkayın ve biyofilmlerin bozulmasını önlemek için PBS'yi kuyunun yan duvarları boyunca ekleyin. Çok kanallı bir pipet kullanarak PBS'yi dikkatlice aspire edin ve PBS yıkamayı 2 kat tekrarlayın (toplam üç yıkama). Fazla PBS'yi kurutmak için plakayı (kapaksız) oda sıcaklığında 30 dakika boyunca, biyolojik bir güvenlik kabini içinde hava ile kurulayın.
  3. XTT/menadionun hazırlanması:
    1. XTT'yi steril Ringers Laktat'ta 0,5 g/L çözelti olarak hazırlayın. 25 mg XTT'yi 50 mL filtre sterilize edilmiş Ringers Laktat içinde çözün. Aliquot 10 mL, alüminyum folyo ile kaplı ayrı tüplerde ve -80 ° C'de saklayın.
    2. Menadion'u 10 mM'lik bir stok olarak hazırlayın. 8.6 mg menadionu 5 mL aseton içinde çözün ve 100 ayrı mikrotüp içinde 50 μL dağıtın. Alikotları -80 °C'de saklayın.
    3. 10 mL XTT alarak ve 1 μM çalışma çözeltisi elde etmek için 1 μL menadion ekleyerek kullanımdan hemen önce XTT/menadion çözeltisi hazırlayın.
  4. 96 delikli mikrotitre plakasının kuyucuğu başına 100 μL XTT/menadion çözeltisi ekleyin. Plakayı bir kapak ve alüminyum folyo ile örtün. Plakayı karanlıkta 37 ° C'de 2 saat boyunca inkübe edin.
  5. Her bir kuyucuktan 80 μL renkli süpernatantı taze bir 96 kuyucuklu plakaya aktarın. Plakayı 490 nm'de okuyun.
  6. Sütun 10'daki kuyucukların absorbans değerlerinin ortalamasını hesaplayın (yalnızca mantar pozitif kontrolü), bu da denklem (1) kullanarak her serum numunesi tarafından biyofilm inhibisyon yüzdesini hesaplamak için bir referans değeri görevi görecektir.
    % Biyofilm inhibisyonu = 100 - figure-protocol-8656× 100 (1)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Candida tropicalis biyofilmleri 96 kuyucuklu mikrotiter plakalarda yetiştirildi ve ters çevrilmiş bir mikroskop kullanılarak 40x'te görüntülendi (Şekil 1A). Biyofilm kristal menekşe kullanılarak daha da boyandı ve ters çevrilmiş bir mikroskop kullanılarak 40x'te gözlendi (Şekil 1B). Taramalı elektron mikroskobu, C. tropicalis biyofilminin temsili bir görüntüsünü göstermektedir (Şekil 1C). Bi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Candida türlerinin neden olduğu mantar enfeksiyonları tüm dünyada yüksek morbidite ve mortalite oranları ile ilişkilidir. İnvaziv mantar enfeksiyonunun artan tehdidi, hayatı tehdit eden bu tür hastalıkların erken yönetimini gerektirir. Çoğu Candida enfeksiyonu, çeşitli tıbbi cihazlara yapışan ve hastane ortamlarında mantar enfeksiyonlarının kalıcılığından ve nüksünden sorumlu olan biyofilmlerin oluşumunu içerir31. Biyofilmler maya veya hifal hücr...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ramalingaswami hibesi DBT-843-BIO (Hindistan Hükümeti Biyoteknoloji Bölümü) ve Erken Kariyer Araştırma Ödülü SER-1058-BIO (Bilim ve Mühendislik Araştırma Kurulu, Hindistan Hükümeti) tarafından S.R.'ye desteklenmiştir. Yazarlar, PS'ye ICMR-JRF hibesini ve PS'ye DBT-JRF hibesini kabul etmektedir. Yazarlar, Dr. Ravikant Ranjan'a, SEM sırasında Pradeep Singh Thakur'un el yazması ve teknik yardımı hakkındaki önerileri için teşekkür eder.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL conical centrifuge tubesBD Falcon546021
1x PBS-Prepared in labNaCl : 4 g
KCl : 0.1 g
Na2HPO4:  0.72 g
KH2PO4 : 0.12 g
Water 500 mL. Adjust pH to 7.4
50 mL conical centrifuge tubesBD Falcon546041
96-well microtiter platesNunc442404
IncubatorGeneric
MenadioneSigmaM5625
Microtiter Plate ReaderGeneric
Multichannel pipette and tipsGeneric
Petri dishesTarson460090
Ringers Lactate-Prepared in labsodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0 
RPMI 1640 MOPSHimediaAT180
Sabouraud dextrose AgarSRL24613
Sabouraud dextrose BrothSRL24835
XTT InvitrogenX6493

Referanslar

  1. Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R. O., Denning, D. W. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57(2017).
  2. Pappas, P., Lionakis, M., Arendrup, M., Ostrosky-Zeichner, L., Kullberg, B. J. Invasive candidiasis. Nature Reviews Disease Primers. 4, 18026(2018).
  3. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
  4. Pemmaraju, S. C., Padmapriya, K., Pruthi, P. A., Prasad, R., Pruthi, V. Impact of oxidative and osmotic stresses on Candida albicans biofilm formation. Biofouling. 32 (8), 897-909 (2016).
  5. Cavalheiro, M., Teixeira, M. C. Candida biofilms: threats, challenges, and promising strategies. Frontiers in Medicine. 5, 28(2018).
  6. Roilides, E., Simitsopoulou, M., Katragkou, A., Walsh, T. J. How biofilms evade host defenses. Microbiology Spectrum. 3 (3), 3(2015).
  7. Pierce, C. G., et al. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nature Protocols. 3 (9), 1494-1500 (2008).
  8. Pierce, C. G., Uppuluri, P., Tummala, S., Lopez-Ribot, J. L. A 96 well microtiter plate-based method for monitoring formation and antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Journal of Visualized Experiments. (44), e2287(2010).
  9. Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 49 (6), 973-980 (2002).
  10. Quindós, G. Epidemiology of candidaemia and invasive candidiasis. A changing face. Revista Iberoamericana de Micología. 31 (1), 42-48 (2014).
  11. Tournu, H., Van Dijck, P. Candida biofilms and the host: models and new concepts for eradication. International Journal of Microbiology. 2012, 845352(2012).
  12. Wall, G., Montelongo-Jauregui, D., Vidal Bonifacio, B., Lopez-Ribot, J., Uppuluri, P. Candida albicans biofilm growth and dispersal: contributions to pathogenesis. Current Opinion in Microbiology. 52, 1-6 (2019).
  13. Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, M. J. S. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62, 10-24 (2013).
  14. LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).
  15. Galdiero, E., et al. Eradication of Candida albicans persister cell biofilm by the membranotropic peptide gH625. Scientific Reports. 10 (1), 5780(2020).
  16. Carrano, G., et al. Anti-Candida albicans germ tube antibodies reduce in vitro growth and biofilm formation of C. albicans. Revista Iberoamericana de Micología. 36 (1), 9-16 (2019).
  17. Alqarihi, A., Singh, S., Edwards, J. E., Ibrahim, A. S., Uppuluri, P. NDV-3A vaccination prevents C. albicans colonization of jugular vein catheters in mice. Scientific Reports. 9 (1), 6194(2019).
  18. Singh, S., et al. The NDV-3A vaccine protects mice from multidrug resistant Candida auris infection. PLoS Pathogens. 15 (8), 1007460(2019).
  19. Shukla, M., Rohatgi, S. Vaccination with secreted aspartyl proteinase 2 protein from Candida parapsilosis can enhance survival of mice during C. tropicalis-mediated systemic candidiasis. Infection and Immunity. 88 (10), 00312-00320 (2020).
  20. Roehm, N. W., Rodgers, G. H., Hatfield, S. M., Glasebrook, A. L. An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT. Journal of Immunological Methods. 142 (2), 257-265 (1991).
  21. Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism. Journal of Clinical Microbiology. 41 (1), 506-508 (2003).
  22. Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay. Journal of Clinical Microbiology. 49 (4), 1426-1433 (2011).
  23. Taff, H. T., Nett, J. E., Andes, D. R. Comparative analysis of Candida biofilm quantitation assays. Medical Mycology. 50 (2), 214-218 (2012).
  24. Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
  25. Dhale, R. P., Ghorpade, M. V., Dharmadhikari, C. A. Comparison of various methods used to detect biofilm production of Candida species. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 8 (11), 18-20 (2014).
  26. Moffa, E. B., et al. Interaction between XTT assay and candida albicans or streptococcus mutans viability. Journal of International Oral Health. 8 (1), 12(2016).
  27. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
  28. Harriott, M. M., Noverr, M. C. Ability of Candida albicans mutants to induce Staphylococcus aureus vancomycin resistance during polymicrobial biofilm formation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54 (9), 3746-3755 (2010).
  29. Pierce, C. G., et al. A novel small molecule inhibitor of Candida albicans biofilm formation, filamentation and virulence with low potential for the development of resistance. NPJ Biofilms and Microbiomes. 1, 15012(2015).
  30. Dekkerová, J., Lopez-Ribot, J. L., Bujdáková, H. Activity of anti-CR3-RP polyclonal antibody against biofilms formed by Candida auris, a multidrug-resistant emerging fungal pathogen. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 101-108 (2019).
  31. Muzny, C. A., Schwebke, J. R. Biofilms: an underappreciated mechanism of treatment failure and recurrence in vaginal infections. Clinical Infectious Diseases. 61 (4), 601-606 (2015).
  32. Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 14-19 (2004).
  33. Taff, H. T., Mitchell, K. F., Edward, J. A., Andes, D. R. Mechanisms of Candida biofilm drug resistance. Future Microbiology. 8 (10), 1325-1337 (2013).
  34. Singh, R., Kumari, A., Kaur, K., Sethi, P., Chakrabarti, A. Relevance of antifungal penetration in biofilm-associated resistance of Candida albicans and non-albicans Candida species. Journal of Medical Microbiology. 67 (7), 922-926 (2018).
  35. Gulati, M., Ennis, C. L., Rodriguez, D. L., Nobile, C. J. Visualization of biofilm formation in Candida albicans using an automated microfluidic device. Journal of Visualized Experiments. (130), e56743(2017).
  36. Krom, B. P., Willems, H. M. In vitro models for Candida biofilm development. Candida Species. , Humana Press. New York, NY. 95-105 (2016).
  37. Gu, W., Xu, D., Guo, D., Zhang, L., Sun, S. In vivo models for Candida albicans biofilms study, research & reviews. Journal of Microbiology and Biotechnology. 5 (1), 26-31 (2016).
  38. Shukla, M., Chandley, P., Rohatgi, S. The role of B-cells and antibodies against Candida vaccine antigens in invasive candidiasis. Vaccines. 9 (10), 1159(2021).
  39. Bujdáková, H., et al. Antibody response to the 45 kDa Candida albicans antigen in an animal model and potential role of the antigen in adherence. Journal of Medical Microbiology. 57 (12), 1466-1472 (2008).
  40. Bujdáková, H., Paulovicová, E., Paulovicová, L., Simová, Z. Participation of the Candida albicans surface antigen in adhesion, the first phase of biofilm development. FEMS Immunology & Medical Microbiology. 59 (3), 485-492 (2010).
  41. Chupácová, J., Borghi, E., Morace, G., Los, A., Bujdáková, H. Anti-biofilm activity of antibody directed against surface antigen complement receptor 3-related protein-comparison of Candida albicans and Candida dubliniensis. Pathogens and Disease. 76 (1), 127(2018).
  42. Gulati, M., et al. In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms. Current Protocols in Microbiology. 50 (1), 60(2018).
  43. Ramage, G. Comparing apples and oranges: considerations for quantifying candidal biofilms with XTT [2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfo-phenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide] and the need for standardized testing. Journal of Medical Microbiology. 65 (4), 259-260 (2016).
  44. Kovács, R., et al. Synergistic effect of nikkomycin Z with caspofungin and micafungin against Candida albicans and Candida parapsilosis biofilms. Letters in Applied Microbiology. 69 (4), 271-278 (2019).
  45. Fernández-Calderón, M. C., et al. Antifungal and anti-biofilm activity of a new Spanish extract of propolis against Candida glabrata. BMC Complementary Medicine and Therapies. 21 (1), 1-10 (2021).
  46. Li, Z., et al. Synergistic effect of pseudolaric acid B with fluconazole against resistant isolates and biofilm of Candida tropicalis. Infection and Drug Resistance. 13, 2733-2743 (2020).
  47. Chatzimoschou, A., Giampani, A., Meis, J. F., Roilides, E. Activities of nine antifungal agents against Candida auris biofilms. Mycoses. 64 (4), 381-384 (2021).
  48. Haney, E. F., Trimble, M. J., Cheng, J. T., Vallé, Q., Hancock, R. Critical assessment of methods to quantify biofilm growth and evaluate antibiofilm activity of host defence peptides. Biomolecules. 8 (2), 29(2018).
  49. Puri, S., et al. Secreted aspartic protease cleavage of Candida albicans Msb2 activates Cek1 MAPK signaling affecting biofilm formation and oropharyngeal candidiasis. PLoS One. 7, 46020(2012).
  50. Staib, P., et al. Tetracycline-inducible expression of individual secreted aspartic proteases in Candida albicans allows isoenzyme-specific inhibitor screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (1), 146-156 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve EnfeksiyonSay 187

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır