JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В настоящем документе описан протокол на основе пластин на основе 96-луночных микротитров с использованием редукционного анализа 2,3-бис(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-5-карбоксанилида-2H-тетразолия (XTT) для изучения влияния антител на биопленки, образованные C. tropicalis. Этот протокол in vitro может быть использован для проверки влияния потенциальных новых противогрибковых соединений на метаболическую активность клеток вида Candida в биопленках.

Аннотация

Виды Candida являются четвертой наиболее распространенной причиной системных внутрибольничных инфекций. Системный или инвазивный кандидоз часто включает образование биопленки на имплантированных устройствах или катетерах, что связано с повышенной вирулентностью и смертностью. Биопленки, производимые различными видами Candida , проявляют повышенную устойчивость к различным противогрибковым препаратам. Поэтому существует необходимость в разработке эффективных иммунотерапий или дополнительных методов лечения против биопленок Candida . В то время как роль клеточного иммунитета хорошо известна в антикандидозной защите, роль гуморального иммунитета изучена меньше.

Было выдвинуто предположение, что ингибирование образования и созревания биопленки является одной из основных функций защитных антител, а антитела зародышевой трубки Candida albicans (CAGTA), как было показано, подавляют рост in vitro и образование биопленки C. albicans ранее. В этой статье излагается подробный протокол оценки роли антител на биопленках, образованных C. tropicalis. Методология для этого протокола включает образование биопленки C. tropicalis в 96-луночных микротитрных пластинах, которые затем инкубировали в присутствии или отсутствии антиген-специфических антител с последующим анализом 2,3-бис(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-5-карбоксанилид-2H-тетразолий (XTT) для измерения метаболической активности грибковых клеток в биопленке.

Специфичность была подтверждена с использованием соответствующих сывороточных контролей, включая Sap2-специфическую сыворотку, обедненную антителами. Результаты показывают, что антитела, присутствующие в сыворотке иммунизированных животных, могут ингибировать созревание биопленки Candida in vitro. Таким образом, эта статья дает важную информацию о потенциале антител в разработке новых иммунотерапий и синергетических или дополнительных методов лечения против биопленок во время инвазивного кандидоза. Этот протокол in vitro может быть использован для проверки влияния потенциальных новых противогрибковых соединений на метаболическую активность клеток вида Candida в биопленках.

Введение

Системный кандидоз является четвертой основной причиной внутрибольничных инфекций, которые связаны с высокими показателями заболеваемости и смертности во всем мире. В глобальном масштабе системный кандидоз поражает примерно 700 000 человек1. Виды Candida, а именно C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata и C. auris, являются наиболее распространенной причиной инвазивных инфекций Candida 2. Виды Candida являются условно-патогенными микроорганизмами, которые производят биопленки3. Биопленки преимущественно связаны с вирулентностью Candida, и Candida может противостоять окислительным и осмотическим стрессовым условиям, индуцируя образование биопленки4. Биопленки дополнительно модулируют экспрессию факторов вирулентности и компонентов клеточной стенки и образуют экзополимерную защитную матрицу, помогая Candida адаптироваться к различным нишам хозяина 4. Биопленки способствуют адгезии дрожжей на тканях хозяина и медицинских инструментах5. Таким образом, образование биопленки связано с преимуществом дрожжей, поскольку дрожжевые клетки в биопленках могут уклоняться от иммунного ответа хозяина6. Образование биопленки также защищает патогенные дрожжи от действия противогрибковых препаратов5. Снижение восприимчивости биопленок C. albicans к амфотерицину B было продемонстрировано Pierce et al.7,8. Кроме того, биопленки демонстрируют устойчивость к флуконазолу к противогрибковым препаратам, что ухудшает эффективное ведение системного кандидоза 9,10.

Микробы имеют внутреннюю тенденцию прилипать к различным биотическим и абиотическим поверхностям, что приводит к образованию биопленки. Candida albicans, которая является диморфным грибом, существует в дрожжевой и гифальной формах, и ее образование биопленки было охарактеризовано в различных модельных системах in vitro и in vivo 11. Этапы образования биопленки включают адгезию клеток Candida к субстрату, нить, пролиферацию и созревание биопленки11. Первоначально дрожжевая форма C. albicans прилипает к субстратам, включая медицинские устройства и ткани человека, за которыми следует нить и пролиферация C. albicans в гифальные и псевдогифальные формы и, наконец, созревание биопленок, встроенных во внеклеточный матрикс11. Образованию биопленки в значительной степени способствует механизмы патогенеза C. albicans 12. Виды Candida образуют устойчивые к лекарствам биопленки, что затрудняет их искоренение13. Небольшое подмножество популяции, продуцирующей биопленку C. albicans , было описано как обладающее высокой устойчивостью к противогрибковым препаратам амфотерицину B и хлоргексидину14. Следует отметить, что дрожжевые клетки в биопленках демонстрируют высокую устойчивость к мультилекарственной терапии по сравнению с дрожжевыми клетками в планктонной фазе и фазе пролиферации14. Было высказано предположение, что дрожжевые клетки, существующие в биопленках, обладают высокой толерантностью к противогрибковым препаратам, что способствует выживанию C. albicans в биопленках14. Сообщалось, что эти существующие клетки являются фенотипическими вариантами C. albicans , а не мутантами14. Кроме того, клетки биопленок Candida , известных как «персистентные клетки», устойчивы к высоким дозам лечения амфотерицином-B и способствуют выживанию Candida , тем самым создавая большое бремя повторяющихся системных инфекций Candida у лиц с высоким риском15.

Увеличение устойчивости к противогрибковым препаратам у штаммов Candida обусловливает необходимость проведения исследований новых противогрибковых средств и иммунотерапии. Как видно из вышеупомянутых исследований, биопленки Candida показывают снижение восприимчивости к противогрибковым препаратам. Поэтому существует необходимость в улучшенной иммунотерапии для контроля образования биопленки Candida . Более ранние исследования показали, что CAGTA может обеспечить эффективную защиту от системных инфекций Candida путем ингибирования образования биопленки C. albicans in vitro16. В другом исследовании сообщалось, что иммунизация мышей белком C. albicans rAls3-N индуцирует высокие титры антител, которые мешают образованию биопленки C. albicans in vitro17. Анти-Als3-N антитела также оказывали ингибирующее действие на рассеивание C. albicans из биопленок17. Вакцина NDV-3A на основе C. albicans в настоящее время находится в стадии клинических испытаний, и было также обнаружено, что сыворотки против NDV-3A уменьшают образование биопленки C. auris 18. Недавнее исследование выявило ингибирование образования биопленки Sap2-антителами в качестве защитного механизма в мышиной модели системного кандидоза19.

В данной работе изложен подробный протокол in vitro для оценки влияния антиген-специфических антител, присутствующих в поликлональной сыворотке, полученной от различных групп вакцинированных Мышей Sap2, на предварительно сформированные биопленки Candida tropicalis . Для достижения этой цели был оптимизирован и разработан в лаборатории метод, основанный на анализе восстановления XTT, который может измерять жизнеспособность биопленки быстрым, чувствительным и высокопроизводительным способом, в присутствии или отсутствии антител.

Анализ XTT используется для измерения клеточной метаболической активности в качестве индикатора жизнеспособности клеток, клеточной пролиферации и цитотоксичности20. Этот колориметрический анализ основан на восстановлении желтой тетразолиевой соли, натрия 3'-[1-(фениламинокарбонил)-3,4-тетразолий]-бис (4-метокси-6-нитро)гидрата бензолсульфоновой кислоты (XTT) до оранжевого формазанного красителя метаболически активными клетками. Поскольку только жизнеспособные клетки могут уменьшить XTT, количество восстановленного XTT формазана пропорционально интенсивности цвета и жизнеспособности клеток. Образующийся краситель формазана является водорастворимым и непосредственно количественно определяется с помощью пластинчатого считывателя. Благодаря своей водорастворимой природе, анализ XTT позволяет изучать интактные биопленки, а также исследовать восприимчивость биопленки к лекарственным средствам без нарушения структуры биопленки21. Кроме того, этот метод реализован в оценках грибковой жизнеспособности Candida из-за его простоты использования, скорости, точности, высокой пропускной способности и высокой степени воспроизводимости 7,22.

В дополнение к анализу восстановления XTT были также определены многочисленные альтернативные методы измерения количества биопленки. Некоторые из них включают использование анализа восстановления MTT, окрашивание кристаллической фиалкой, количественную оценку ДНК, количественную ПЦР, количественную оценку белка, измерение веса сухих клеток и подсчет жизнеспособных колоний. Эти процедуры сильно различаются с точки зрения их требований к времени и стоимости. Taff et al. провели сравнительный анализ семи различных количественных анализов биопленки Candida и обнаружили, что анализ XTT обеспечивает наиболее воспроизводимый, точный и эффективный метод количественной оценки биопленок C. albicans 23. Методы окрашивания, такие как кристаллический фиолетовый, имеют определенные ограничения; кристаллический фиолетовый тест косвенно определяет количество биопленки путем измерения оптической плотности кристаллической фиолетовой матрицы биопленки и клеток. Хотя анализ кристаллической фиалки обеспечивает хорошую меру массы биопленки, он не дает измерения жизнеспособности биопленки, поскольку он окрашивает как микробные клетки, так и внеклеточный матрикс24. Dhale et al. далее сообщили, что анализ восстановления XTT был наиболее чувствительным, воспроизводимым, точным, эффективным и специфическим методом обнаружения производства биопленки по сравнению с анализом кристаллической фиалки25. Литературные отчеты показали, что анализ XTT хорошо коррелирует с параметром CFU/mL в методе подсчета КОЕ. Однако, по сравнению с анализом XTT, метод КОЕ является трудоемким и медленным26. Кроме того, фракция отделившихся живых клеток может не быть репрезентативной для исходной популяции биопленки27. Хотя анализ восстановления XTT кажется лучшим доступным вариантом для количественной оценки жизнеспособности, есть несколько ограничений этого метода. Хотя метод XTT полезен для сравнения с участием одного грибкового штамма, его использование может быть ограничено при сравнении различных грибковых штаммов и видов. Промежуточные сравнения могут быть затруднены в отсутствие детальной стандартизации, поскольку различные штаммы метаболизируют субстраты с различными возможностями21.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Мыши BALB/c были размещены в Центре мелких животных в IIT Roorkee. Все животные содержались в цикле 12 ч: 12 ч света: темноты при 25 ° C и были обеспечены гранулированной диетой и водой ad libitum. Все процедуры для животных были одобрены Институциональным комитетом по этике животных (IAEC) IIT Roorkee.

1. Препарат C. tropicalis

ПРИМЕЧАНИЕ: ГрибОк Candida tropicalis относится к патогенам группы риска 2 и классифицируется как микроорганизм BSL2. Всегда используйте сертифицированные шкафы биологической безопасности класса II при работе с видами Candida . Практикуйте асептические и стерильные методы во время работы с C. tropicalis и следуйте рекомендуемым процедурам биобезопасности для правильной утилизации этого патогена.

  1. Полоса C. tropicalis (штамм ATCC 750) на агаровой пластине декстрозы Сабуро (SAB).
  2. Подготовьте выращенную на ночь культуру C. tropicalis , инокуя одну колонию из агаровой пластины SAB в стерильную коническую трубку объемом 50 мл, содержащую 10 мл среды отвара SAB. В качестве альтернативы используют замороженный глицериновый бульон C. tropicalis и прививают 100 мкл глицеринового бульона в стерильную коническую колбу объемом 250 мл, содержащую 50 мл среды отвара SAB.
  3. Инкубировать культуру C. tropicalis в орбитальном шейкере при 180 об/мин при 30 °C в течение 24-48 ч.
  4. Центрифугируют грибковую культуру (клетки в логарифмической фазе) при 2,150 × г в течение 15 мин при 21 °C.
  5. Откажитесь от супернатанта и добавьте 50 мл стерильного 1x PBS в гранулу. Промыть и повторно суспендировать гранулу в стерильном 1x PBS с мягким вихрем.
  6. Центрифуга снова при 2,150 × г в течение 15 мин при 21 °C. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте грибковую гранулу в 10 мл стерильного 1x PBS.
  7. Рассчитайте концентрацию клеток, подсчитывая с помощью гемоцитометра.
  8. Готовят грибковые запасы при конечной плотности 1,0 × 106 клеток/мл в среде морфолинпропансульфоновой кислоты (MOPS) RPMI 1640. Немедленно используйте клеточную суспензию из шага 1.6.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для установки одной плиты на 96 скважин общий объем накопленного грибка составляет 10 мл (100 мкл/скважина). Масштабирование по мере необходимости.

2. Образование биопленки C. tropicalis

  1. Приготовьте биопленки Candida в 96-луночной полистирольной микротитровой пластине с плоским дном, как описано ранее (Рисунок 1)28,29.
  2. Добавьте 100 мкл культуры C. tropicalis (из 106 клеток/мл, приготовленных, как указано выше) в 96-луночную микротитровую пластину с использованием многоканальной пипетки (рисунок 2А). Сохраните последние две колонки (11 и 12) как «без грибка плюс сыворотка» и «без грибка и без сыворотки» отрицательный контроль, не добавляя грибковые клетки. Заполните столбцы 11 и 12 только средой RPMI 1640 MOPS объемом 100 мкл.
  3. Накройте микротитровую пластину крышкой и алюминиевой фольгой. Инкубировать пластину в течение 24 ч при 37 °C в стационарных условиях.
  4. На следующий день тщательно аспирируйте среду с помощью многоканальной пипетки (не касаясь и не разрушая биопленки). Осторожно постучите по пластине в перевернутом положении на пятнах, чтобы удалить остаточную среду.
  5. Вымойте пластину 200 мкл 1x PBS (на лунку) с помощью многоканальной пипетки. Добавляйте PBS очень осторожно вдоль боковых стенок колодца, чтобы избежать разрушения биопленок. Тщательно аспирируйте PBS с помощью многоканальной пипетки. Повторите стирку PBS 2x (всего три стирки).
  6. Для удаления избытка ПБС высушите на воздухе пластину (без крышки) в течение 30 мин при комнатной температуре, внутри шкафа биологической безопасности.

3. Лечение биопленки антителами

ПРИМЕЧАНИЕ: Биопленки теперь могут быть обработаны для оценки ингибирования созревания биопленки антителами. Мышная сыворотка использовалась в качестве источника поликлональных антител. Различные группы Sap2-иммунизированных (Sap2-albicans, Sap2-tropicalis и Sap2-парапсилоз) вместе с фиктивно-иммунизированными мышами были обескровлены ретро-орбитально, а сыворотка была выделена, как описано ранее19. Наличие антител против Sap2 было подтверждено с помощью Sap2-специфического ИФА, как описано ранее19.

  1. Проводят теплоинактивацию сыворотки (источника поликлональных антител) при 56 °C в течение 30 мин перед применением, чтобы исключить роль комплемента в ингибирующей активности. Инактивируйте сыворотку перед тем, как сделать разведение сыворотки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте сыворотку от фиктивно-иммунизированных мышей, преиммунных мышей и Sap2-специфической сыворотки, обедненной антителами, в качестве дополнительной контрольной группы19. Сыворотка, обедненная антителами, была получена в соответствии с предыдущим исследованием19. Среди серийных разведений (1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1,600, 1:3,200, 1:6,400 и 1:12,800) для сыворотки, протестированных по этому протоколу, ингибирование созревания биопленки наблюдалось при 1:25, 1:50 и 1:100; следовательно, 1:50 было выбрано для достижения баланса между ингибированием и потреблением сыворотки.
  2. Подготовьте серийные разведения термоинактивированных образцов сыворотки в стерильной среде RPMI 1640 MOPS (1:50). Используйте общее сывороточное разведение (1:50) для всех образцов сыворотки, которые должны быть протестированы на ингибирование созревания биопленки30.
  3. Добавьте 100 мкл выбранного разведения сыворотки в каждую лунку 96-луночной микротитровой пластины. Для каждого образца добавьте разбавления сыворотки в двух экземплярах в соответствии с прилагаемой схемой (рисунок 2B).
    1. В колонку 10 не следует добавлять разведение сыворотки; добавьте только RPMI 1640 MOPS medium для положительного контроля только гриба .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Колонка 10, строки G1-G8 и H1-H8 первоначально содержали грибковые клетки в RPMI-MOPS. Однако, в то время как RPMI-MOPS был добавлен в столбец 10 даже через 24 ч, строки G1-G8 служили в качестве элемента управления PBS, а строки H1-H8 - в качестве контроля без сыворотки через 24 ч.
    2. В колонке 11 добавьте разведение сыворотки 1:50 во все колодцы, чтобы служить в качестве отрицательного контроля без грибка плюс сыворотка.
    3. В колонке 12 не добавляйте разведение сыворотки в любой колодец; держите это как отсутствие грибка нет сыворотки отрицательный контроль.
  4. Накройте пластину крышкой и алюминиевой фольгой. Инкубировать пластину в течение 24 ч при 37 °C.

4. Оценка метаболической активности биопленки

  1. На следующий день тщательно аспирируйте сыворотку с помощью многоканальной пипетки (не касаясь и не нарушая биопленки). Осторожно постучите по пластине в перевернутом положении по пятнам на листах, чтобы удалить остаточную сыворотку.
  2. Вымойте пластину 200 мкл 1x PBS (на скважину) с помощью многоканальной пипетки, добавив PBS вдоль боковых стенок скважины, чтобы избежать разрушения биопленок. Тщательно аспирируйте PBS с помощью многоканальной пипетки и повторите стирку PBS 2x (в общей сложности три стирки). Высушите пластину на воздухе (без крышки) в течение 30 мин при комнатной температуре, внутри шкафа биологической безопасности, чтобы высушить любые излишки PBS.
  3. Препарат ХТТ/менадиона:
    1. Готовят XTT в стерильном лактате Ringers в виде раствора 0,5 г/л. Растворить 25 мг XTT в 50 мл стерилизованного фильтром рингеров лактата. Aliquot 10 мл в отдельных тубах, покрытых алюминиевой фольгой и хранящихся при -80 °C.
    2. Готовят менадион в виде запаса 10 мМ. Растворите 8,6 мг менадиона в 5 мл ацетона и распределите 50 мкл в 100 отдельных микротрубках. Храните аликвоты при -80 °C.
    3. Приготовьте раствор XTT/менадиона непосредственно перед использованием, взяв 10 мл XTT и добавив 1 мкл менадиона для получения рабочего раствора 1 мкМ.
  4. Добавьте 100 мкл раствора XTT/менадиона на лунку 96-луночной микротитровой пластины. Накройте пластину крышкой и алюминиевой фольгой. Инкубировать пластину в течение 2 ч при 37 °C в темноте.
  5. Переложите 80 мкл цветного супернатанта из каждой скважины в свежую 96-луночную пластину. Считывайте пластину при 490 нм.
  6. Рассчитайте среднее значение значений поглощения скважин в колонке 10 (положительный контроль только для грибка), которое будет служить эталонным значением для расчета процентного ингибирования биопленки каждым образцом сыворотки с использованием уравнения (1).
    % ингибирования биопленки = 100 - figure-protocol-9179× 100 (1)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Биопленки Candida tropicalis выращивали в 96-луночных микротитрных пластинах и визуализировали в 40 раз с помощью инвертированного микроскопа (рисунок 1А). Биопленку дополнительно окрашивали с использованием кристаллического фиолетового цвета и наблюдали в 40 раз с помощью ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Грибковые инфекции, вызванные видами Candida, связаны с высокими показателями заболеваемости и смертности во всем мире. Растущая угроза инвазивной грибковой инфекции требует раннего лечения таких опасных для жизни заболеваний. Большинство инфекций Candida включают образование би?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом Рамалингасвами DBT-843-BIO (Департамент биотехнологии, правительство Индии) и премией за ранние карьерные исследования SER-1058-BIO (Совет по научным и инженерным исследованиям, правительство Индии) для S.R. Авторы признают грант ICMR-JRF для P.C и грант DBT-JRF для P.S. Авторы благодарят д-ра Равиканта Ранджана за предложения по рукописи и техническую помощь г-на Прадипа Сингха Тхакура во время SEM.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL conical centrifuge tubesBD Falcon546021
1x PBS-Prepared in labNaCl : 4 g
KCl : 0.1 g
Na2HPO4:  0.72 g
KH2PO4 : 0.12 g
Water 500 mL. Adjust pH to 7.4
50 mL conical centrifuge tubesBD Falcon546041
96-well microtiter platesNunc442404
IncubatorGeneric
MenadioneSigmaM5625
Microtiter Plate ReaderGeneric
Multichannel pipette and tipsGeneric
Petri dishesTarson460090
Ringers Lactate-Prepared in labsodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0 
RPMI 1640 MOPSHimediaAT180
Sabouraud dextrose AgarSRL24613
Sabouraud dextrose BrothSRL24835
XTT InvitrogenX6493

Ссылки

  1. Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R. O., Denning, D. W. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57(2017).
  2. Pappas, P., Lionakis, M., Arendrup, M., Ostrosky-Zeichner, L., Kullberg, B. J. Invasive candidiasis. Nature Reviews Disease Primers. 4, 18026(2018).
  3. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
  4. Pemmaraju, S. C., Padmapriya, K., Pruthi, P. A., Prasad, R., Pruthi, V. Impact of oxidative and osmotic stresses on Candida albicans biofilm formation. Biofouling. 32 (8), 897-909 (2016).
  5. Cavalheiro, M., Teixeira, M. C. Candida biofilms: threats, challenges, and promising strategies. Frontiers in Medicine. 5, 28(2018).
  6. Roilides, E., Simitsopoulou, M., Katragkou, A., Walsh, T. J. How biofilms evade host defenses. Microbiology Spectrum. 3 (3), 3(2015).
  7. Pierce, C. G., et al. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nature Protocols. 3 (9), 1494-1500 (2008).
  8. Pierce, C. G., Uppuluri, P., Tummala, S., Lopez-Ribot, J. L. A 96 well microtiter plate-based method for monitoring formation and antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Journal of Visualized Experiments. (44), e2287(2010).
  9. Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 49 (6), 973-980 (2002).
  10. Quindós, G. Epidemiology of candidaemia and invasive candidiasis. A changing face. Revista Iberoamericana de Micología. 31 (1), 42-48 (2014).
  11. Tournu, H., Van Dijck, P. Candida biofilms and the host: models and new concepts for eradication. International Journal of Microbiology. 2012, 845352(2012).
  12. Wall, G., Montelongo-Jauregui, D., Vidal Bonifacio, B., Lopez-Ribot, J., Uppuluri, P. Candida albicans biofilm growth and dispersal: contributions to pathogenesis. Current Opinion in Microbiology. 52, 1-6 (2019).
  13. Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, M. J. S. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62, 10-24 (2013).
  14. LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).
  15. Galdiero, E., et al. Eradication of Candida albicans persister cell biofilm by the membranotropic peptide gH625. Scientific Reports. 10 (1), 5780(2020).
  16. Carrano, G., et al. Anti-Candida albicans germ tube antibodies reduce in vitro growth and biofilm formation of C. albicans. Revista Iberoamericana de Micología. 36 (1), 9-16 (2019).
  17. Alqarihi, A., Singh, S., Edwards, J. E., Ibrahim, A. S., Uppuluri, P. NDV-3A vaccination prevents C. albicans colonization of jugular vein catheters in mice. Scientific Reports. 9 (1), 6194(2019).
  18. Singh, S., et al. The NDV-3A vaccine protects mice from multidrug resistant Candida auris infection. PLoS Pathogens. 15 (8), 1007460(2019).
  19. Shukla, M., Rohatgi, S. Vaccination with secreted aspartyl proteinase 2 protein from Candida parapsilosis can enhance survival of mice during C. tropicalis-mediated systemic candidiasis. Infection and Immunity. 88 (10), 00312-00320 (2020).
  20. Roehm, N. W., Rodgers, G. H., Hatfield, S. M., Glasebrook, A. L. An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT. Journal of Immunological Methods. 142 (2), 257-265 (1991).
  21. Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism. Journal of Clinical Microbiology. 41 (1), 506-508 (2003).
  22. Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay. Journal of Clinical Microbiology. 49 (4), 1426-1433 (2011).
  23. Taff, H. T., Nett, J. E., Andes, D. R. Comparative analysis of Candida biofilm quantitation assays. Medical Mycology. 50 (2), 214-218 (2012).
  24. Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
  25. Dhale, R. P., Ghorpade, M. V., Dharmadhikari, C. A. Comparison of various methods used to detect biofilm production of Candida species. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 8 (11), 18-20 (2014).
  26. Moffa, E. B., et al. Interaction between XTT assay and candida albicans or streptococcus mutans viability. Journal of International Oral Health. 8 (1), 12(2016).
  27. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
  28. Harriott, M. M., Noverr, M. C. Ability of Candida albicans mutants to induce Staphylococcus aureus vancomycin resistance during polymicrobial biofilm formation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54 (9), 3746-3755 (2010).
  29. Pierce, C. G., et al. A novel small molecule inhibitor of Candida albicans biofilm formation, filamentation and virulence with low potential for the development of resistance. NPJ Biofilms and Microbiomes. 1, 15012(2015).
  30. Dekkerová, J., Lopez-Ribot, J. L., Bujdáková, H. Activity of anti-CR3-RP polyclonal antibody against biofilms formed by Candida auris, a multidrug-resistant emerging fungal pathogen. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 101-108 (2019).
  31. Muzny, C. A., Schwebke, J. R. Biofilms: an underappreciated mechanism of treatment failure and recurrence in vaginal infections. Clinical Infectious Diseases. 61 (4), 601-606 (2015).
  32. Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 14-19 (2004).
  33. Taff, H. T., Mitchell, K. F., Edward, J. A., Andes, D. R. Mechanisms of Candida biofilm drug resistance. Future Microbiology. 8 (10), 1325-1337 (2013).
  34. Singh, R., Kumari, A., Kaur, K., Sethi, P., Chakrabarti, A. Relevance of antifungal penetration in biofilm-associated resistance of Candida albicans and non-albicans Candida species. Journal of Medical Microbiology. 67 (7), 922-926 (2018).
  35. Gulati, M., Ennis, C. L., Rodriguez, D. L., Nobile, C. J. Visualization of biofilm formation in Candida albicans using an automated microfluidic device. Journal of Visualized Experiments. (130), e56743(2017).
  36. Krom, B. P., Willems, H. M. In vitro models for Candida biofilm development. Candida Species. , Humana Press. New York, NY. 95-105 (2016).
  37. Gu, W., Xu, D., Guo, D., Zhang, L., Sun, S. In vivo models for Candida albicans biofilms study, research & reviews. Journal of Microbiology and Biotechnology. 5 (1), 26-31 (2016).
  38. Shukla, M., Chandley, P., Rohatgi, S. The role of B-cells and antibodies against Candida vaccine antigens in invasive candidiasis. Vaccines. 9 (10), 1159(2021).
  39. Bujdáková, H., et al. Antibody response to the 45 kDa Candida albicans antigen in an animal model and potential role of the antigen in adherence. Journal of Medical Microbiology. 57 (12), 1466-1472 (2008).
  40. Bujdáková, H., Paulovicová, E., Paulovicová, L., Simová, Z. Participation of the Candida albicans surface antigen in adhesion, the first phase of biofilm development. FEMS Immunology & Medical Microbiology. 59 (3), 485-492 (2010).
  41. Chupácová, J., Borghi, E., Morace, G., Los, A., Bujdáková, H. Anti-biofilm activity of antibody directed against surface antigen complement receptor 3-related protein-comparison of Candida albicans and Candida dubliniensis. Pathogens and Disease. 76 (1), 127(2018).
  42. Gulati, M., et al. In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms. Current Protocols in Microbiology. 50 (1), 60(2018).
  43. Ramage, G. Comparing apples and oranges: considerations for quantifying candidal biofilms with XTT [2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfo-phenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide] and the need for standardized testing. Journal of Medical Microbiology. 65 (4), 259-260 (2016).
  44. Kovács, R., et al. Synergistic effect of nikkomycin Z with caspofungin and micafungin against Candida albicans and Candida parapsilosis biofilms. Letters in Applied Microbiology. 69 (4), 271-278 (2019).
  45. Fernández-Calderón, M. C., et al. Antifungal and anti-biofilm activity of a new Spanish extract of propolis against Candida glabrata. BMC Complementary Medicine and Therapies. 21 (1), 1-10 (2021).
  46. Li, Z., et al. Synergistic effect of pseudolaric acid B with fluconazole against resistant isolates and biofilm of Candida tropicalis. Infection and Drug Resistance. 13, 2733-2743 (2020).
  47. Chatzimoschou, A., Giampani, A., Meis, J. F., Roilides, E. Activities of nine antifungal agents against Candida auris biofilms. Mycoses. 64 (4), 381-384 (2021).
  48. Haney, E. F., Trimble, M. J., Cheng, J. T., Vallé, Q., Hancock, R. Critical assessment of methods to quantify biofilm growth and evaluate antibiofilm activity of host defence peptides. Biomolecules. 8 (2), 29(2018).
  49. Puri, S., et al. Secreted aspartic protease cleavage of Candida albicans Msb2 activates Cek1 MAPK signaling affecting biofilm formation and oropharyngeal candidiasis. PLoS One. 7, 46020(2012).
  50. Staib, P., et al. Tetracycline-inducible expression of individual secreted aspartic proteases in Candida albicans allows isoenzyme-specific inhibitor screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (1), 146-156 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

187

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены