Un ensayo de reducción soluble a base de tetrazolio para evaluar el efecto de los anticuerpos en las biopelículas de Candida tropicalis

Resumen

En el presente documento se describe un protocolo basado en placas de microtitulación de 96 pocillos que utiliza un ensayo de reducción de 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-carboxanilida-2H-tetrazolio (XTT), para estudiar los efectos de los anticuerpos en las biopelículas formadas por C. tropicalis. Este protocolo in vitro se puede utilizar para comprobar el efecto de posibles nuevos compuestos antifúngicos sobre la actividad metabólica de las células de especies de Candida en biopelículas.

Resumen

Las especies de Candida son la cuarta causa más común de infecciones nosocomiales sistémicas. La candidiasis sistémica o invasiva con frecuencia implica la formación de biopelículas en dispositivos implantados o catéteres, lo que se asocia con un aumento de la virulencia y la mortalidad. Las biopelículas producidas por diferentes especies de Candida exhiben una mayor resistencia contra varios medicamentos antifúngicos. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar inmunoterapias efectivas o tratamientos adyuvantes contra las biopelículas de Candida . Si bien el papel de la inmunidad celular está bien establecido en la protección contra Candida , el papel de la inmunidad humoral se ha estudiado menos.

Se ha planteado la hipótesis de que la inhibición de la formación y maduración de biopelículas es una de las principales funciones de los anticuerpos protectores, y se ha demostrado que los anticuerpos del tubo germinal de Candida albicans (CAGTA) suprimen el crecimiento in vitro y la formación de biopelículas de C. albicans antes. Este documento describe un protocolo detallado para evaluar el papel de los anticuerpos en las biopelículas formadas por C. tropicalis. La metodología para este protocolo implica la formación de biopelículas de C. tropicalis en placas de microtitulación de 96 pocillos, que luego se incubaron en presencia o ausencia de anticuerpos específicos de antígeno, seguido de un ensayo de 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-carboxanilida-2H-tetrazolio (XTT) para medir la actividad metabólica de las células fúngicas en la biopelícula.

La especificidad se confirmó mediante el uso de controles séricos apropiados, incluido el suero con depleción de anticuerpos específicos de Sap2. Los resultados demuestran que los anticuerpos presentes en el suero de animales inmunizados pueden inhibir la maduración del biofilm de Candida in vitro. En resumen, este documento proporciona información importante sobre el potencial de los anticuerpos en el desarrollo de nuevas inmunoterapias y tratamientos sinérgicos o adyuvantes contra las biopelículas durante la candidiasis invasiva. Este protocolo in vitro se puede utilizar para comprobar el efecto de posibles nuevos compuestos antifúngicos sobre la actividad metabólica de las células de especies de Candida en biopelículas.

Introducción

La candidiasis sistémica es la cuarta causa principal de infecciones nosocomiales, que se asocian con altas tasas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. A nivel mundial, la candidiasis sistémica afecta a aproximadamente 700.000 individuos¹. Las especies de Candida, a saber, C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata y C. auris, son la causa más común de infecciones invasivas por Candida ². Las especies de Candida son patógenos oportunistas que producen biopelículas³. Las biopelículas se asocian predominantemente con la virulencia de Candida, y Candida puede soportar condiciones de estrés oxidativo y osmótico al inducir la formación de biopelículas⁴. Los biofilms modulan aún más la expresión de factores de virulencia y componentes de la pared celular y forman una matriz protectora exopolimérica, ayudando a Candida a adaptarse a diferentes nichos de huésped⁴. Las biopelículas contribuyen a la adherencia de la levadura en los tejidos del huésped y los instrumentos médicos⁵. Como tal, la formación de biopelículas se asocia con una ventaja para las levaduras, ya que las células de levadura dentro de las biopelículas pueden evadir la respuesta inmune del huésped⁶. La formación de biopelículas también protege a las levaduras patógenas de la acción de los fármacos antifúngicos⁵. La disminución de la susceptibilidad de los biofilms de C. albicans a la anfotericina B ha sido demostrada por Pierce et al.7,8. Además, los biofilms demuestran resistencia a los fármacos antifúngicos al fluconazol, lo que perjudica el manejo eficaz de la candidiasis sistémica ^9,10.

Los microbios tienen una tendencia intrínseca a adherirse a diversas superficies bióticas y abióticas, lo que resulta en la formación de biopelículas. Candida albicans, que es un hongo dimórfico, existe en formas de levadura e hifales, y su formación de biofilm ha sido caracterizada en varios sistemas modelo in vitro e in vivo ¹¹. Los pasos de la formación del biofilm incluyen la adhesión de las células de Candida al sustrato, la filamentación, la proliferación y la maduración del biofilm¹¹. Inicialmente, la forma de levadura de C. albicans se adhiere a sustratos, incluidos dispositivos médicos y tejido humano, seguida de filamentación y proliferación de C. albicans en formas hifales y pseudohifales, y finalmente la maduración de biopelículas incrustadas en la matriz extracelular¹¹. La formación de biopelículas contribuye en gran medida a los mecanismos de patogénesis de C. albicans ¹². Las especies de Candida forman biopelículas resistentes a los medicamentos, lo que hace que su erradicación sea un desafío¹³. Un pequeño subconjunto de la población productora de biopelícula de C. albicans ha sido descrito como altamente resistente a los fármacos antifúngicos anfotericina B y clorhexidina¹⁴. Cabe destacar que las células de levadura en biopelículas exhiben una alta resistencia a la terapia multifármaco en comparación con las células de levadura en la fase planctónica y la fase^{de proliferación 14}. Se ha sugerido que las células de levadura existentes en las biopelículas son altamente tolerantes a los fármacos antifúngicos, lo que contribuye a la supervivencia de C. albicans en biopelículas¹⁴. Estas células existentes fueron reportadas como variantes fenotípicas de C. albicans y no mutantes¹⁴. Además, las células de biofilms de Candida conocidas como "células persistentes" son tolerantes a altas dosis de tratamiento con anfotericina-B y contribuyen a la supervivencia de Candida, lo que representa una gran carga de infecciones sistémicas recurrentes por Candida en individuos de alto riesgo¹⁵.

El aumento de la resistencia a los medicamentos antifúngicos en las cepas de Candida requiere la investigación de nuevos agentes antifúngicos e inmunoterapias. Como se desprende de los estudios mencionados anteriormente, las biopelículas de Candida muestran una menor susceptibilidad a los medicamentos antimicóticos. Por lo tanto, existe la necesidad de inmunoterapias mejoradas para controlar la formación de biopelículas de Candida. Estudios anteriores han demostrado que CAGTA puede proporcionar una protección eficaz contra las infecciones sistémicas por Candida mediante la inhibición de la formación de biopelículas de C. albicans in vitro¹⁶. Otro estudio informó que la inmunización de ratones con la proteína C. albicans rAls3-N induce altos títulos de anticuerpos que interfieren con la formación de biopelículas de C. albicans in vitro¹⁷. Los anticuerpos anti-Als3-N también ejercieron un efecto inhibitorio sobre la dispersión de C. albicans de biofilms¹⁷. La vacuna NDV-3A basada en C. albicans se encuentra actualmente en ensayo clínico y también se encontró que los sueros anti-NDV-3A reducen la formación de biopelículas de C. auris ¹⁸. Un estudio reciente identificó la inhibición de la formación de biopelículas por anticuerpos Sap2 como un mecanismo de protección en un modelo murino de candidiasis sistémica¹⁹.

Este documento describe un protocolo in vitro detallado para evaluar el efecto de los anticuerpos antígeno-específicos presentes en el suero policlonal obtenido de diferentes grupos de ratones vacunados con Sap2 en biopelículas preformadas de Candida tropicalis . Para lograr esto, se optimizó y desarrolló en el laboratorio un método basado en un ensayo de reducción XTT, que puede medir la viabilidad del biofilm de manera rápida, sensible y de alto rendimiento, en presencia o ausencia de anticuerpos.

El ensayo XTT se utiliza para medir la actividad metabólica celular como un indicador de viabilidad celular, proliferación celular y citotoxicidad²⁰. Este ensayo colorimétrico se basa en la reducción de una sal amarilla de tetrazolio, 3'-[1-(fenililaminocarbonil)-3,4-tetrazolio]-bis (4-metoxi-6-nitro) benceno sulfónico hidrato de ácido sulfónico (XTT) a un colorante formazán naranja por células metabólicamente activas. Dado que solo las células viables pueden reducir XTT, la cantidad de formazan XTT reducida es proporcional a la intensidad del color y la viabilidad celular. El colorante formazán formado es soluble en agua y se cuantifica directamente utilizando un lector de placas. Debido a su naturaleza soluble en agua, el ensayo XTT permite el estudio de biofilms intactos, así como el examen de la susceptibilidad a los medicamentos biofilm, sin interrupción de la estructura del biofilm²¹. Además, este método se implementa en las evaluaciones de viabilidad fúngica de Candida debido a su facilidad de uso, velocidad, precisión, alto rendimiento y alto grado de reproducibilidad ^7,22.

Además del ensayo de reducción XTT, también se han identificado numerosas técnicas alternativas para la medición de la cantidad de biofilm. Algunos de estos incluyen el uso del ensayo de reducción de MTT, tinción de violeta cristalina, cuantificación de ADN, PCR cuantitativa, cuantificación de proteínas, medición del peso de células secas y conteo de colonias viables. Estos procedimientos varían ampliamente en términos de sus requisitos de tiempo y costo. Taff et al. realizaron un análisis comparativo de siete ensayos diferentes de cuantificación de biopelículas de Candida y encontraron que el ensayo XTT proporcionó el método más reproducible, preciso y eficiente para la estimación cuantitativa de biopelículas de C. albicans ²³. Las técnicas de tinción como el cristal violeta tienen ciertas limitaciones; La prueba de violeta de cristal determina indirectamente la cantidad de biopelícula midiendo la densidad óptica de la matriz y las células de la biopelícula teñida de violeta de cristal. Aunque el ensayo de violeta cristalina proporciona una buena medida de la masa del biofilm, no da una medida de viabilidad del biofilm, ya que tiñe tanto las células microbianas como la matriz extracelular²⁴. Dhale et al. informaron además que el ensayo de reducción XTT fue el método más sensible, reproducible, preciso, eficiente y específico para detectar la producción de biopelícula en comparación con el ensayo de violeta cristal²⁵. Los informes de la literatura han demostrado que el ensayo XTT se correlaciona bien con el parámetro UFC/ml en el método de conteo de UFC. Sin embargo, en comparación con el ensayo XTT, el método CFU es laborioso y lento²⁶. Además, la fracción de células vivas separadas puede no ser representativa de la población inicial de biofilm²⁷. Aunque el ensayo de reducción XTT parece la mejor opción disponible para cuantificar la viabilidad, existen algunas limitaciones de esta técnica. Si bien el método XTT es útil para comparaciones que involucran una cepa de hongos, su uso puede ser limitado cuando se comparan diferentes cepas y especies de hongos. Las comparaciones entre cepas pueden ser difíciles en ausencia de una estandarización detallada, ya que diferentes cepas metabolizan sustratos con diferentes capacidades²¹.

Protocolo

Los ratones BALB/c fueron alojados en la Instalación de Pequeños Animales en IIT Roorkee. Todos los animales se mantuvieron en un ciclo de luz:oscuridad de 12 h:12 h a 25 °C y se les proporcionó una dieta de pellets y agua ad libitum. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Ética Animal (IAEC) del IIT Roorkee.

1. Preparación de C. tropicalis

NOTA: El hongo Candida tropicalis pertenece a patógenos del Grupo de Riesgo 2 y está clasificado como un microorganismo BSL2. Siempre use gabinetes de seguridad biológica certificados de Clase II cuando trabaje con especies de Candida . Practique técnicas asépticas y estériles durante el trabajo con C. tropicalis y siga los procedimientos de bioseguridad recomendados para la eliminación adecuada de este patógeno.

1. Raya C. tropicalis (cepa ATCC 750) en una placa de agar dextrosa Sabouraud (SAB).
2. Prepare un cultivo de C. tropicalis cultivado durante la noche inoculando una sola colonia de la placa de agar SAB en un tubo cónico estéril de 50 ml que contenga 10 ml de medio de caldo SAB. Alternativamente, utilizar un caldo de glicerol congelado de C. tropicalis e inocular 100 μL del caldo de glicerol en un matraz cónico estéril de 250 ml que contenga 50 ml de medio de caldo SAB.
3. Incubar el cultivo de C. tropicalis en un agitador orbital a 180 rpm a 30 °C durante 24-48 h.
4. Centrifugar el cultivo fúngico (células en fase logarítmica) a 2.150 × g durante 15 min a 21 °C.
5. Deseche el sobrenadante y agregue 50 ml de PBS estéril 1x al pellet. Lave y resuspenda el pellet en 1x PBS estéril con un vórtice suave.
6. Centrifugar de nuevo a 2.150 × g durante 15 min a 21 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet fúngico en 10 ml de PBS estéril 1x.
7. Calcular la concentración de células contando con un hemocitómetro.
8. Preparar cepos fúngicos a una densidad final de 1,0 × 10⁶ células/ml en medio RPMI 1640 de ácido morfolinapropanosulfónico (MOPS). Utilice inmediatamente la suspensión celular del paso 1.6.
   NOTA: Para configurar una placa de 96 pocillos, el volumen total de material fúngico necesario es de 10 ml (100 μL/pocillo). Escale según sea necesario.

2. Formación de biofilm de C. tropicalis

1. Preparar biofilms de Candida en una placa de microtitulación de poliestireno de fondo plano de 96 pocillos como se describió anteriormente (Figura 1)^28,29.
2. Añadir 100 μL de cultivo de C. tropicalis (a partir de 10^{6 células} /ml, preparado como el anterior) a una placa de microtitulación de 96 pocillos utilizando una pipeta multicanal (figura 2A). Mantenga las dos últimas columnas (11 y 12) como controles negativos 'sin hongos más suero' y 'sin hongos y sin suero' al no agregar células fúngicas. Llene las columnas 11 y 12 con 100 μL de medio RPMI 1640 MOPS solo.
3. Cubra la placa de microtitulación con una tapa y papel de aluminio. Incubar la placa durante 24 h a 37 °C en condiciones estacionarias.
4. Al día siguiente, aspirar el medio cuidadosamente con una pipeta multicanal (sin tocar ni interrumpir las biopelículas). Golpee suavemente la placa en posición invertida sobre las hojas secantes para eliminar cualquier medio residual.
5. Lavar la placa con 200 μL de 1x PBS (por pocillo) con una pipeta multicanal. Agregue PBS muy suavemente a lo largo de las paredes laterales del pozo para evitar interrumpir las biopelículas. Aspirar el PBS cuidadosamente con una pipeta multicanal. Repita el lavado PBS 2 veces (un total de tres lavados).
6. Para eliminar el exceso de PBS, seque al aire la placa (sin tapa) durante 30 minutos a temperatura ambiente, dentro de un gabinete de seguridad biológica.

3. Tratamiento del biofilm con anticuerpos

NOTA: Las biopelículas ahora se pueden procesar para evaluar la inhibición de la maduración de la biopelícula por anticuerpos. Se utilizó suero murino como fuente de anticuerpos policlonales. Diferentes grupos de ratones inmunizados con Sap2 (Sap2-albicans, Sap2-tropicalis y Sap2-parapsilosis) junto con ratones inmunizados simuladamente fueron sangrados retroorbitalmente y el suero se aisló como se describió anteriormente¹⁹. La presencia de anticuerpos anti-Sap2 se confirmó utilizando ELISA específico de Sap2 como se describió anteriormente¹⁹.

1. Realizar la inactivación térmica del suero (fuente de anticuerpos policlonales) a 56 °C durante 30 min antes de su uso para descartar el papel del complemento en la actividad inhibitoria. Inactive el suero con calor antes de hacer la dilución del suero.
   NOTA: Use suero de ratones inmunizados simulados, ratones preinmunes y suero con anticuerpos agotados específicos de Sap2 como controles adicionales¹⁹. El suero agotado de anticuerpos fue preparado según un estudio previo¹⁹. Entre las diluciones seriadas (1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1.600, 1:3.200, 1:6.400 y 1:12.800) para el suero probado en este protocolo, se observó inhibición de la maduración del biofilm a las 1:25, 1:50 y 1:100; Por lo tanto, se seleccionó 1:50 para lograr un equilibrio entre la inhibición y el consumo de suero.
2. Preparar diluciones seriadas de muestras de suero inactivado por calor en medio estéril RPMI 1640 MOPS (1:50). Utilice una dilución sérica común (1:50) para todas las muestras de suero que se van a analizar para la inhibición de la maduración del biofilm³⁰.
3. Agregue 100 μL de la dilución sérica seleccionada a cada pocillo de la placa de microtitulación de 96 pocillos. Para cada muestra, agregue diluciones de suero por duplicado, según el diseño adjunto (Figura 2B).
   1. En la columna 10, no añadir dilución de suero; agregue solo RPMI 1640 MOPS medio para el control positivo solo de hongos .
      NOTA: La columna 10, filas G1-G8 y H1-H8 inicialmente tenían células fúngicas en RPMI-MOPS. Sin embargo, mientras que RPMI-MOPS se agregó a la columna 10 incluso después de 24 h, las filas G1-G8 sirvieron como control PBS y las filas H1-H8 como control sin suero después de 24 h.
   2. En la columna 11, agregue una dilución 1:50 de suero a todos los pocillos para que sirva como control negativo sin hongos más suero.
   3. En la columna 12, no agregue dilución de suero a ningún pocillo; Mantenga esto como el control negativo sin hongos sin suero.
4. Cubra la placa con una tapa y papel de aluminio. Incubar la placa durante 24 h a 37 °C.

4. Estimación de la actividad metabólica del biofilm

1. Al día siguiente, aspire el suero cuidadosamente con una pipeta multicanal (sin tocar ni interrumpir las biopelículas). Golpee suavemente el plato en posición invertida sobre las hojas secantes para eliminar cualquier suero residual.
2. Lave la placa con 200 μL de 1x PBS (por pocillo) usando una pipeta multicanal, agregando el PBS a lo largo de las paredes laterales del pozo para evitar interrumpir las biopelículas. Aspirar el PBS cuidadosamente con una pipeta multicanal y repetir el lavado PBS 2x (un total de tres lavados). Seque al aire la placa (sin la tapa) durante 30 minutos a temperatura ambiente, dentro de un gabinete de seguridad biológica para secar cualquier exceso de PBS.
3. Preparación de XTT/menadiona:
   1. Preparar XTT en lactato de Ringers estéril como una solución de 0,5 g/L. Disuelva 25 mg de XTT en 50 ml de lactato Ringers esterilizado por filtro. Alícuota 10 ml en tubos separados cubiertos con papel de aluminio y conservar a -80 °C.
   2. Prepare la menadiona como un stock de 10 mM. Disolver 8,6 mg de menadiona en 5 ml de acetona y distribuir 50 μL en 100 microtubos separados. Conservar las alícuotas a -80 °C.
   3. Prepare la solución XTT/menadiona justo antes de usar tomando 10 ml de XTT y agregando 1 μL de menadiona para obtener una solución de trabajo de 1 μM.
4. Añadir 100 μL de la solución XTT/menadiona por pocillo de la placa de microtitulación de 96 pocillos. Cubra la placa con una tapa y papel de aluminio. Incubar la placa durante 2 h a 37 °C en la oscuridad.
5. Transfiera 80 μL del sobrenadante coloreado de cada pocillo a una placa fresca de 96 pocillos. Lea la placa a 490 nm.
6. Calcular la media de los valores de absorbancia de los pocillos en la columna 10 (control positivo solo de hongos), que servirá como valor de referencia para calcular el porcentaje de inhibición de biopelícula por cada muestra de suero utilizando la ecuación (1).
   % de inhibición del biofilm = 100 - × 100 (1)

Resultados

Las biopelículas de Candida tropicalis se cultivaron en placas de microtitulación de 96 pocillos y se obtuvieron imágenes a 40x utilizando un microscopio invertido (Figura 1A). La biopelícula se tiñó aún más con cristal violeta y se observó a 40x utilizando un microscopio invertido (Figura 1B). La microscopía electrónica de barrido muestra una imagen representativa de la biopelícula de C. tropicalis (Figura 1C

Discusión

Las infecciones fúngicas causadas por especies de Candida se asocian con altas tasas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. La creciente amenaza de infección fúngica invasiva requiere el manejo temprano de tales enfermedades potencialmente mortales. La mayoría de las infecciones por Candida involucran la formación de biofilms, que se adhieren a una variedad de dispositivos médicos y son responsables de la persistencia y recurrencia de infecciones fúngicas en entornos hospitalarios

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical centrifuge tubes	BD Falcon	546021
1x PBS	-	Prepared in lab	NaCl : 4 g KCl : 0.1 g Na2HPO4:  0.72 g KH2PO4 : 0.12 g Water 500 mL. Adjust pH to 7.4
50 mL conical centrifuge tubes	BD Falcon	546041
96-well microtiter plates	Nunc	442404
Incubator	Generic
Menadione	Sigma	M5625
Microtiter Plate Reader	Generic
Multichannel pipette and tips	Generic
Petri dishes	Tarson	460090
Ringers Lactate	-	Prepared in lab	sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0
RPMI 1640 MOPS	Himedia	AT180
Sabouraud dextrose Agar	SRL	24613
Sabouraud dextrose Broth	SRL	24835
XTT	Invitrogen	X6493