使用酿酒酵母中的5-乙炔基-2'-脱氧尿苷掺入测定S相持续时间

摘要

我们描述了两种互补的方案，以使用EdU（一种胸苷类似物）准确确定 酿酒酵母 的S期持续时间，该EdU在 体内 掺入并通过显微镜和流式细胞术使用Click化学进行检测。它可以轻松表征突变体中DNA复制的持续时间和被忽视的复制缺陷。

摘要

真核DNA复制是一个高度调控的过程，可确保在染色体分离之前正确复制细胞的遗传蓝图。由于DNA合成缺陷是染色体重排的基础，因此监测DNA复制已成为了解基因组不稳定基础的关键。 酿酒酵母 是研究细胞周期调控的经典模型，但关键的DNA复制参数，如S期或S期持续时间的细胞比例，仍然难以确定。该协议在工程TK-hENT1酵母细胞中使用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）（胸苷类似物）的短且无毒脉冲，然后通过Click反应进行检测，以允许通过显微镜和流式细胞术在单细胞和群体水平上以高空间和时间分辨率可视化和定量DNA复制。该方法可以识别酵母突变体的S期和细胞周期进程中以前被忽视的缺陷，从而允许表征对确保基因组稳定性至关重要的新参与者。

引言

通过有丝分裂的基因组稳定性是通过将一组完整且相等的染色体传递给两个产生的细胞后代来确保的。这依赖于在细胞周期的每个阶段的给定时间内发生的一系列事件的准确完成。在 G 1 中，复制来源是在招募几个许可因素（包括 Cdc6¹）后获得许可的。在S阶段，全基因组复制从多个活跃的复制起源开始，并由复制机器执行，这些机器聚集在显微镜下可见的灶中，称为复制工厂²。在M期，重复的姐妹染色单体附着并双向定向在有丝分裂纺锤体上，以允许它们分离到有丝分裂细胞³的相对极点。每个阶段的调控、正确完成和持续时间是确保基因组稳定性的关键。事实上，过早退出这些阶段中的任何一个都会导致基因组不稳定。例如，由出芽酵母CDK抑制剂Sic1缺失或G 1细胞周期蛋白过表达诱导的较短的G₁将改变随后的S期⁴，^5，6。因此，这些失调，无论是否与复制应激相关，都会导致染色体断裂、重排和错误分离⁴，^5，6。因此，监测S期的持续时间以及更广泛地说，监测细胞周期其他阶段的持续时间对于识别不同突变体和不同应激条件下发生的缺陷可能至关重要。

测量细胞周期阶段持续时间的传统方法包括简单的DNA含量流式细胞术（图1A），并依赖于拟合算法（大多数细胞术软件中可用），用于将群体从1C和2C峰分离为G₁，S和G₂ + M相级分。然后将分数乘以总体倍增时间⁷。然而，该方法仅给出估计值，需要在给定级分内均匀的细胞大小分布，并且不适用于同步培养。为了研究哺乳动物细胞中的S期持续时间，已经开发并广泛使用了几种胸苷类似物，包括EdU。它们从细胞外培养基中摄取并被胸苷激酶（以下简称TK）磷酸化，使它们可用于DNA聚合酶，以将它们掺入DNA合成位点（复制，重组，修复）。为了绕过 酿酒 酵母细胞中TK基因的缺失，酵母菌株已被设计为允许单纯疱疹病毒TK⁸ 和人平衡核苷转运蛋白（hENT1）⁹的稳定和组成性表达。一旦掺入 DNA 中，EdU 就会通过 选择性 Click 反应进行检测，该反应将其炔烃部分化学偶联到叠氮化物修饰的荧光染料¹⁰。

本文提供了两种优化的综合协议，用于使用 EdU 对异步和同步 TK-hENT1 工程细胞进行脉冲标记，以便通过显微镜和流式细胞术精确可视化和测量 DNA 复制持续时间和动态，以及细胞周期其他阶段的持续时间，在单细胞和群体水平上具有高空间和时间分辨率。

研究方案

1. 酿酒酵母 细胞培养

注意:使用的酵母菌株列于表1中

注意:可以通过不同的方式监控 S 阶段持续时间。根据要解决的问题，细胞可以在G₁ 停滞后异步或同步生长。

1. 来自异步生长的 酿酒酵母 细胞
   注意:该方法允许确定异步生长的细胞群中S期细胞的百分比。通过确定倍增时间，可以推断S期（和其他相）的持续时间。
   1. 将 酿酒酵母细胞 接种在10mL合成完全（SC）培养基中，以低细胞浓度（5×10⁴ 细胞/ mL）在30°C下以130rpm的轨道搅拌进行过夜培养。
      注意:浓度是用细胞计数器测量的。为了有效地计算倍增时间，建议从仍处于指数期（即理想情况下低于2×10⁷ 个细胞/mL）的过夜培养物中接种培养物。不建议在富培养基（YPD）中生长细胞，因为EdU检测效率不高。
   2. 第二天，将细胞稀释在 20 mL 新鲜 SC 培养基中，终浓度为 5 ×^{10 5} 个细胞/mL。
   3. 在30°C的振荡水浴中培养细胞，以120rpm的水平振荡。
   4. 每小时测量一次细胞浓度，直到达到 1 × 10⁷ 个细胞/mL。
      注意:此步骤允许使细胞浓度随时间增加的图形表示。用于计算倍增时间的公式在 表2的图例中进行了解释。
   5. 当细胞浓度约为 2 × 10^6-5 × 10^{6 细胞} /mL 时，并行进行 EdU 标记的步骤 2。
2. 来自G₁同步酿 酒酵母 细胞
   注意:该方法允许通过流式细胞术和/或显微镜分析确定S期何时开始和结束。
   1. 以低细胞浓度（5×10⁴细胞/ mL）接种酿酒酵母细胞在10mLSC培养基中，在30°C下以130rpm的轨道搅拌进行过夜培养。
      注意:请参阅步骤 1.1.1 之后的注释。
   2. 第二天，将细胞稀释在 20 mL 新鲜 SC 培养基中，终浓度为 2 × 10 6-3 ×^{10 6} 个细胞/mL。
   3. 加入 40 μL 在水中稀释的 1 mg/mL α因子。
   4. 在30°C下以130rpm的轨道搅拌培养细胞1小时。
   5. 再次加入 40 μL 在水中稀释的 1 mg/mL α因子。
   6. 在30°C下以130rpm的轨道搅拌培养细胞1小时。
   7. 在光学显微镜下可视化细胞以监测G₁ 停滞。如果超过 90% 的单元格显示 shmoo，而其他单元格是圆形的、未发芽的单元格，则继续。
      注意:根据使用的背景，建议在shmoo可视化之前对细胞进行超声处理。对于 W303 背景，超声处理 2 倍，每次 2 秒，振幅为 40-50。
   8. 以1，500× g离心3分钟。用真空移液管弃去上清液。
   9. 将细胞重悬于 20 mL SC 培养基中。
   10. 重复步骤 1.2.8-1.2.9 一次。
       注意:α因子通过这些步骤被冲走，细胞在细胞周期中释放。或者，可以通过使用1.2μm硝酸纤维素过滤器过滤酵母细胞来冲洗α因子，该滤斗设置在连接到真空泵的侧臂烧瓶上。
   11. 每 5 分钟收集 1 mL 细胞 2 次，然后继续执行步骤 2 进行 EdU 标记。
       注意:仅用EdU对两个管中的一个的细胞进行脉冲标记。非脉冲标记的细胞用于区分双变量碘化丙啶（PI）-EdU图上的EdU阳性和EdU阴性细胞。
   12. 释放 30 分钟后加入 400 μL 1 mg/mL 用水稀释的 α 因子。
       注意:需要这种高剂量的α因子来阻止下一个细胞周期的G₁ 期的细胞，并防止细胞重新进入随后的S期。

2. 教育标签

1. 将 1 mL 细胞培养物转移到含有 1 μL 10 mM EdU 的 2.0 mL 微量离心管中。通过倒置混合均匀。
   注意:为了区分 PI-EdU 双变量 FACS 上的 EdU 阳性细胞和 EdU 阴性细胞，请将另外 1 mL 细胞培养物转移到含有 1 μL DMSO 的 2.0 mL 微量离心管中。
2. 在振荡水浴中搅拌下在30°C孵育3-5分钟。
   注意:三分钟足以用显微镜进行EdU检测;在流式细胞仪上获得最佳EdU检测需要5分钟。
3. 加入 100 μL 100% 乙醇停止反应。
   1. 如果需要测量细胞大小，则加入 100 μL 20% 多聚甲醛停止反应。
      注意:如果要保持有丝分裂细胞的核结构完整，以便在Click反应后进行进一步分析，我们建议在室温（RT）下用2%多聚甲醛固定细胞，而不是将细胞放在冰上，因为后者会导致微管解聚。
   2. 在加入 100 μL 100% 乙醇之前，在变速摇杆上以 20 次倾斜/分钟的速度在变速摇杆上温和搅拌下将细胞在室温下放置 20 分钟，以固定细胞。

3. 细胞固定和透化

1. 在微量离心机中以10，000× g 沉淀细胞2分钟。使用真空移液器除去上清液。
2. 将细胞沉淀重悬于 500 μL 70% 乙醇中。通过涡旋充分混合。
3. 在变速摇臂上以 20 次倾斜/分钟在室温下放置 ≥ 小时以透化细胞。
   注意:在SC培养基中生长的细胞不能很好地沉淀，因为它们倾向于粘附在微量离心机壁上。添加乙醇可改善造粒并减少细胞损失。细胞可以在4°C下储存过夜或在-20°C下储存更长时间。
4. 在微量离心机中以10，000× g 沉淀细胞2分钟。用真空移液管弃去上清液。
5. 用 500 μL 10% 乙醇在 PBS 中洗涤细胞 2 倍。
   注意:洗涤对于从细胞中去除未掺入的EdU至关重要。

4. 点击反应

1. 用于细胞术分析
   1. 在微量离心机中以10，000× g 沉淀细胞2分钟。用真空移液管弃去上清液。
   2. 将沉淀重悬于含有 0.1 mg/mL RNase A 和 0.2 mg/mL 蛋白酶 K 的 200 μL PBS 中。
   3. 在50°C下孵育1-2小时，偶尔摇动（或在37°C下过夜）。
   4. 在微量离心机中以10，000× g 沉淀细胞2分钟。用真空移液管弃去上清液。
   5. 用 500 μL PBS 洗涤细胞。
   6. 在微量离心机中以10，000× g 沉淀细胞2分钟。用真空移液管弃去上清液。
   7. 将细胞沉淀重悬于 200 μL PBS + 1% 牛血清白蛋白 （BSA） 中。在室温下孵育30分钟。
      注意:更长的时间是不必要的，甚至不利于点击反应的效率。
   8. 在微量离心机中以10，000× g 沉淀细胞2分钟。用真空移液管弃去上清液。
   9. 将沉淀重悬于 300 μL PBS + 1% BSA 中。
   10. 将细胞分布在两个管之间:200 μL 在 1.5 mL 微量离心管中用于 Click 反应，100 μL 在另一个 1.5 mL 微量离心管中用于 Sytox Green 染色。
   11. 在微量离心机中以10，000× g 沉淀细胞2分钟。用真空移液管弃去上清液。
   12. 用于赛托克斯绿染色
       注意:我们强烈建议等分试样进行Sytox Green染色（无Click），以获得高质量的DNA含量参考谱。事实上，Click反应强烈淬灭插层荧光，包括Sytox Green和PI荧光。因此，咔嗒反应会扭曲DNA含量的读取。
       1. 将细胞沉淀重悬于 100 μL PBS 中。
       2. 将 10-30 μL（取决于细胞浓度）转移到含有 300 μL 50 mM Tris-HCl、pH 7.5 和 0.5 μM Sytox Green 的流式细胞仪管中。
       3. 超声处理2x，每次2秒，振幅为40-50。
       4. 在黑暗中放置，直到在流式细胞仪上处理样品。
          注意:细胞可以在此阶段在4°C下保存几天。
   13. 对于点击反应
       1. 通过按以下顺序混合试剂（一管的数量）制备新鲜叠氮化物染料缓冲液:36 μL PBS、2 μL 0.2 M CuSO₄、0.2 μL 2 mM Cy5 叠氮化物和 2 μL 1 M 抗坏血酸。
          注意:可以制备叠氮化物染料缓冲液的预混液。试剂必须按照与上述相同的顺序混合。
       2. 用 40 μL 新鲜制作的叠氮化物染料混合物重悬细胞沉淀。在室温下在黑暗中孵育60分钟。
       3. 在微量离心机中以10，000× g 沉淀细胞2分钟。用真空移液管弃去上清液。
       4. 用 300 μL 10% 乙醇在 PBS 中洗涤细胞 3 倍。
          注意:洗涤液对于消除所有可溶性EdU-Cy5叠氮化物至关重要。
       5. 将细胞重悬于 PBS 中的 100 μL 50 μg/mL PI 中。在黑暗中放置10分钟。
       6. 将 10-30 μL 细胞悬液（取决于细胞浓度）转移到含有 300 μL 50 mM Tris-HCl（pH 7.5）的流式细胞仪管中。
       7. 超声处理2x，每次2秒，振幅为40-50。
       8. 在黑暗中放置，直到在细胞仪上处理样品。
          注意:细胞可以在此阶段在4°C下保存几天。
   14. 使用 488 nm 的激发蓝色激光和 530/30 BP 滤光片读取 Sytox Green 样品。典型结果见 图1A 。使用 488 nm 的激发蓝色激光和 PI（x 轴）的 615/20 BP 滤光片和 640 nm 的激发红色激光和 660/20 BP 滤光片（y 轴）在点图上读取双变量 PI-EdU 样品。典型结果见 图1B 。
       注意: 图1C 表示EdU阴性细胞的典型PI-EdU双变量FACS结果。它允许区分EdU阴性细胞和EdU阳性细胞。
2. 用于显微镜分析
   1. 在微量离心机中以10，000× g 沉淀细胞2分钟。用真空移液管弃去上清液。
   2. 将沉淀重悬于 200 μL PBS + 1% BSA 中。在室温下孵育30分钟。
   3. 在微量离心机中以10，000× g 沉淀细胞2分钟。用真空移液管弃去上清液。
   4. 通过按以下顺序混合试剂（一管的数量）制备新鲜叠氮化物染料缓冲液:36 μL PBS、2 μL 0.2 M CuSO₄、0.2 μL 2 mM Dy-530 叠氮化物、2 μL 1 M 抗坏血酸。
      注意:叠氮化物染料缓冲液的预混液可以通过按上述顺序混合试剂来新鲜制备。
   5. 用 40 μL 新鲜制作的叠氮化物染料缓冲液重悬沉淀。在室温下在黑暗中孵育60分钟。
   6. 在微量离心机中以10，000 ×g 沉淀细胞2分钟。用真空移液管弃去上清液。
   7. 用 300 μL 10% 乙醇在 PBS 中洗涤细胞 2 倍。
      注意:洗涤对于消除所有可溶性Dy-530叠氮化物至关重要。
   8. 在微量离心机中以10，000× g 沉淀细胞2分钟。用真空移液管弃去上清液。
   9. 将细胞重悬于 PBS 中的 100 μL 0.5 μg/mL 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 中。在室温下在黑暗中放置30分钟。
   10. 在微量离心机中以10，000× g 沉淀细胞2分钟。用真空移液管弃去上清液。
   11. 用 300 μL PBS 洗涤以去除多余的 DAPI。
   12. 在微量离心机中以10，000 ×g 沉淀细胞2分钟。用真空移液管弃去上清液。
   13. 根据细胞浓度，用 10-50 μL PBS 重悬沉淀。
   14. 超声处理2x，每次2秒，振幅为40-50。
       注意:细胞可以在此阶段在4°C下保存几天。
   15. 将 1.7 μL 细胞移液到玻璃显微镜载玻片上，并用干净的盖玻片盖住。
   16. 立即在带有DAPI和TexasRed或Cy3滤光片的荧光显微镜下观察。

结果

为了确定S期持续时间，更广泛地说，G 1和G₂ + M的持续时间（方案步骤1.1），酿酒酵母W303野生型细胞（WT，表1）在SC培养基中异步生长7小时。每小时监测一次细胞浓度以确定倍增时间（图2B）。在这些生长条件下，计算的倍增时间为25°C下的120分钟±13分钟（表2）。当细胞处于指数期（2× 10^6-5×10⁶细胞/ mL）时，?...

讨论

酵母是细胞周期研究的主要模式生物，但其S期的表征长期以来一直受到阻碍，因为它无法结合外源性核苷，如BrdU，其用作DNA复制的示踪剂。为酵母配备高表达的单纯疱疹胸苷激酶（TK）并添加人核苷转运蛋白（hENT）在很大程度上解决了这个问题^15，16。与抗BrdU抗体不同，EdU比BrdU更通用，因为它使用小荧光叠氮化物和Click化学进行检测，适用于透化的酵?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
α-factor	Genescript	RP01002
Bovine Serum Albumin (BSA)	Euromedex	04-100--812-E
Copper sulfate	Sigma	C1297
DAPI	Sigma	D9542
Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide)	Interchim	FP-JV6320	Alternative to Alexa647-Azide
Dy-530 azide	Dyomics	530-10
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine)	Carbosynth	NE08701
Ethanol absolute	Carlo Erba reagents	P013A10D16	or equivalent
L- ascorbic acid	Sigma	A4544
Propidium iodide	Sigma	P4864
Proteinase K	Euromedex	EU0090
Rnase	SIGMA	R5000
Sytox Green	Invitrogen	S-7020
Equipment
Cell counter	OLS	CASY
Flow cytometer	Agilent	NovoSampler Pro
Shaking incubator	Infors	444-4230	or equivalent
Shaking water bath	Julabo	SW22	or equivalent
Sonicator	Sonics	Vibra cell
Wide-field microscopy	Leica	THUNDER Imager	or equivalent