Determinação da Duração da Fase S Usando a Incorporação de 5-Etil-2'-desoxiuridina em Saccharomyces cerevisiae

Resumo

Descrevemos dois protocolos complementares para determinar com precisão a duração da fase S em S. cerevisiae usando EdU, um análogo da timidina, que é incorporado in vivo e detectado usando a química Click por microscopia e citometria de fluxo. Ele permite a fácil caracterização da duração da replicação do DNA e defeitos de replicação negligenciados em mutantes.

Resumo

A replicação do DNA eucariótico é um processo altamente regulado que garante que o modelo genético de uma célula seja corretamente duplicado antes da segregação cromossômica. Como os defeitos de síntese de DNA estão subjacentes aos rearranjos cromossômicos, o monitoramento da replicação do DNA tornou-se essencial para entender a base da instabilidade do genoma. Saccharomyces cerevisiae é um modelo clássico para estudar a regulação do ciclo celular, mas os principais parâmetros de replicação do DNA, como a fração de células na fase S ou a duração da fase S, ainda são difíceis de determinar. Este protocolo utiliza pulsos curtos e não tóxicos de 5-etil-2'-desoxiuridina (EdU), um análogo da timidina, em células de levedura TK-hENT1 modificadas, seguidas de sua detecção por reação Click para permitir a visualização e quantificação da replicação do DNA com alta resolução espacial e temporal nos níveis de célula única e populacional por microscopia e citometria de fluxo. Este método pode identificar defeitos anteriormente negligenciados na fase S e na progressão do ciclo celular de mutantes de levedura, permitindo assim a caracterização de novos players essenciais para garantir a estabilidade do genoma.

Introdução

A estabilidade do genoma através da divisão mitótica é assegurada pela transmissão de um conjunto completo e igual de cromossomos para as duas progênies celulares produzidas. Isso depende da conclusão precisa de uma série de eventos que ocorrem em um determinado tempo em cada fase do ciclo celular. No G 1, as origens de replicação são licenciadas mediante o recrutamento de vários fatores de licenciamento, incluindo o Cdc6₁. Na fase S, a duplicação do genoma inteiro é iniciada a partir de múltiplas origens de replicação ativas e executada por máquinas de replicação que se reúnem em focos microscopicamente visíveis chamados fábricas de replicação². Na fase M, cromátides irmãs duplicadas são anexadas e biorientadas no fuso mitótico para permitir sua segregação para os polos opostos da célula mitótica³. A regulação, a conclusão adequada e a duração de cada fase são fundamentais para garantir a estabilidade do genoma. De fato, a saída prematura de qualquer uma dessas fases leva à instabilidade do genoma. Por exemplo, um G1 mais curto induzido pela deleção do inibidor de CDK de levedura em brotamento_Sic1 ou pela superexpressão de ciclinas G₁ alterará a fase S^{subsequente 4,5,6}. Consequentemente, essas desregulamentações, associadas ou não à tensão de replicação, resultam em quebras cromossômicas, rearranjos e má segregação ^4,5,6. Portanto, monitorar a duração da fase S e, de forma mais ampla, a duração das outras fases do ciclo celular pode ser crucial para identificar os defeitos que ocorrem em diferentes mutantes e em diferentes condições estressantes.

Um método tradicional para medir a duração da fase do ciclo celular inclui citometria de fluxo de conteúdo de DNA simples (Figura 1A) e depende de um algoritmo de ajuste (disponível na maioria dos softwares de citometria) usado para separar a população em frações de fase G₁, S e G₂ + M dos picos 1C e 2C. As frações são então multiplicadas pelo tempo de duplicação da população⁷. No entanto, este método fornece apenas valores estimados, requer uma distribuição homogênea do tamanho da célula dentro de uma determinada fração e não é aplicável a culturas sincronizadas. Para estudar a duração da fase S em células de mamíferos, vários análogos da timidina foram desenvolvidos e amplamente utilizados, incluindo o EdU. Sua absorção do meio extracelular e fosforilação pela timidina quinase (doravante referida como TK) os tornam disponíveis para DNA polimerases para incorporá-los em locais de síntese de DNA (replicação, recombinação, reparo). Para contornar a ausência do gene TK nas células de Saccharomyces cerevisiae , cepas de levedura foram modificadas para permitir a expressão estável e constitutiva do vírus herpes simplex TK⁸ e do transportador de nucleosídeos equilibrados humanos (hENT1)⁹. Uma vez incorporado ao DNA, o EdU é detectado através da reação seletiva de Click, que acopla quimicamente sua porção alquina a fluorocromos modificados com azida¹⁰.

Este artigo fornece dois protocolos abrangentes otimizados para células de engenharia assíncronas e síncronas de TK-hENT1 com EdU, a fim de visualizar e medir com precisão a duração e a dinâmica da replicação do DNA, bem como a duração das outras fases do ciclo celular, com alta resolução espacial e temporal nos níveis de célula única e populacional por microscopia e citometria de fluxo.

Protocolo

1. Cultura de células de S. cerevisiae

NOTA: As estirpes de levedura utilizadas estão listadas no quadro 1

NOTA: A duração da fase S pode ser monitorada de diferentes maneiras. Dependendo da questão a ser abordada, as células podem ser cultivadas de forma assíncrona ou síncrona após a parada do G₁ .

1. De células de S. cerevisiae de crescimento assíncrono
   NOTA: Este método permite a determinação da percentagem de células na fase S numa população de células em crescimento assíncrono. Ao determinar o tempo de duplicação, a duração da fase S (e das outras fases) pode ser extrapolada.
   1. Inocular células de S. cerevisiae em 10 mL de meio sintético completo (SC) a uma baixa concentração celular (5 × 10⁴ células/mL) para uma cultura noturna a 30 °C com agitação orbital a 130 rpm.
      NOTA: A concentração é medida com um contador de células. Para calcular eficientemente os tempos de duplicação, recomenda-se inocular a cultura de uma cultura noturna que ainda esteja na fase exponencial (ou seja, idealmente abaixo de 2 × 10⁷ células/mL). O crescimento de células em meio rico (YPD) não é recomendado, pois a detecção de EdU não é eficiente.
   2. No dia seguinte, diluir as células em 20 mL de meio SC fresco na concentração final de 5 × 10⁵ células/mL.
   3. Culturar as células a 30 °C em banho-maria agitado com agitação horizontal a 120 rpm.
   4. Meça a concentração celular a cada hora até atingir 1 × 10⁷ células/mL.
      NOTA: Esta etapa permite fazer uma representação gráfica do aumento da concentração de células ao longo do tempo. A fórmula utilizada para calcular os tempos de duplicação é explicada na legenda da Tabela 2.
   5. Prossiga em paralelo com a etapa 2 para a marcação de EdU quando a concentração celular for de cerca de 2 × 10 6-5 × 10⁶ células/mL.
2. De células de S. cerevisiae sincronizadas com G₁
   NOTA: Este método permite determinar quando a fase S começa e termina por meio de citometria de fluxo e/ou análises microscópicas.
   1. Inocular células de S. cerevisiae em 10 mL de meio SC a uma baixa concentração celular (5 × 10⁴ células/mL) para uma cultura noturna a 30 °C com agitação orbital a 130 rpm.
      Observação : consulte as observações após a etapa 1.1.1.
   2. No dia seguinte, diluir as células em 20 mL de meio SC fresco a uma concentração final de 2 × 10 6-3 × 10⁶ células/mL.
   3. Adicionar 40 μL de 1 mg/mL de fator α diluído em água.
   4. Cultivar as células a 30 °C com agitação orbital a 130 rpm durante 1 h.
   5. Adicionar novamente 40 μL de 1 mg/mL de fator α diluído em água.
   6. Cultivar as células a 30 °C com agitação orbital a 130 rpm durante 1 h.
   7. Visualize as células sob um microscópio de luz para monitorar a parada G₁ . Prossiga se mais de 90% das células exibirem um shmoo e as outras forem células arredondadas e não brotadas.
      NOTA: Dependendo do plano de fundo usado, recomenda-se sonicar as células antes da visualização shmoo. Para o fundo W303, sonicate 2x, para 2 s de cada vez, a uma amplitude de 40-50.
   8. Centrífuga por 3 min a 1.500 × g. Rejeitar o sobrenadante com uma pipeta de vácuo.
   9. Ressuspender as células em 20 mL de meio SC.
   10. Repita as etapas 1.2.8-1.2.9 uma vez.
       NOTA: O fator de α é lavado com essas etapas e as células são liberadas no ciclo celular. Em alternativa, o factor de α pode ser lavado filtrando as células de levedura com um filtro de nitrocelulose de 1,2 μm utilizando um funil ajustado num balão de braço lateral ligado a uma bomba de vácuo.
   11. Recolha 1 ml de células 2x a cada 5 minutos e prossiga para o passo 2 para a rotulagem EdU.
       NOTA: Rotule as células de pulso de apenas um dos dois tubos com EdU. As células não marcadas com pulso são usadas para distinguir células EdU-positivas de EdU-negativas em um gráfico bivariado de iodeto de propídio (PI)-EdU.
   12. Adicionar 400 μL de 1 mg/mL de fator α diluído em água 30 min após a liberação.
       NOTA: Esta alta dose de fator de α é necessária para deter as células na fase G₁ do próximo ciclo celular e para evitar que as células voltem a entrar na fase S subsequente.

2. Rotulagem EdU

1. Transfira 1 mL de cultura celular para um tubo de microfuga de 2,0 mL contendo 1 μL de EdU de 10 mM. Misture bem por inversão.
   NOTA: Para discriminar as células EdU-positivas das células EdU-negativas em um FACS bivariado PI-EdU, transfira mais 1 mL de cultura celular para um tubo de microfujo de 2,0 mL contendo 1 μL de DMSO.
2. Incubar durante 3-5 min a 30 °C sob agitação em banho-maria agitado.
   NOTA: Três minutos são suficientes para a detecção de EdU com um microscópio; São necessários 5 minutos para a detecção ideal de EdU em um citômetro de fluxo.
3. Pare a reação com a adição de 100 μL de etanol a 100%.
   1. Pare a reação com a adição de 100 μL de paraformaldeído a 20% se for necessária a medição do tamanho da célula.
      NOTA: Se a arquitetura nuclear das células mitóticas deve ser mantida intacta para análises posteriores após a reação de Click, recomendamos a fixação de células com paraformaldeído a 2% à temperatura ambiente (RT) em vez de colocar as células no gelo, uma vez que esta última causa despolimerização de microtúbulos.
   2. Deixar as células por 20 min no RT sob agitação suave em um balancim de velocidade variável a 20 inclinações/min para fixar as células antes da adição de 100 μL de etanol a 100%.

3. Fixação celular e permeabilização

1. Pellet as células por 2 min a 10.000 × g em um microfugo. Remova o sobrenadante usando uma pipeta a vácuo.
2. Ressuscite o pellet celular em 500 μL de etanol a 70%. Misture bem por vórtice.
3. Deixe por ≥1 h a RT a 20 inclinações/min em um balancim de velocidade variável para permeabilizar as células.
   NOTA: As células cultivadas em meio SC não pellets bem como eles tendem a aderir às paredes de microfuga. A adição de etanol melhora a peletização e reduz a perda celular. As células podem ser armazenadas a 4 °C durante a noite ou por períodos mais longos a -20 °C.
4. Pellet as células por 2 min a 10.000 × g em uma microcentrífuga. Rejeitar o sobrenadante com uma pipeta de vácuo.
5. Lave as células 2x com 500 μL de etanol a 10% em PBS.
   NOTA: As lavagens são cruciais para remover o EdU não incorporado das células.

4. Reação de clique-it

1. Para análise de citometria
   1. Pellet as células por 2 min a 10.000 × g em um microfugo. Rejeitar o sobrenadante com uma pipeta de vácuo.
   2. Ressuspender o pellet em 200 μL de PBS contendo 0,1 mg/mL de RNase A e 0,2 mg/mL de proteinase K.
   3. Incubar durante 1-2 h a 50 °C com agitação ocasional (ou durante a noite a 37 °C).
   4. Pellet as células por 2 min a 10.000 × g em uma microcentrífuga. Rejeitar o sobrenadante com uma pipeta de vácuo.
   5. Lave as células com 500 μL de PBS.
   6. Pellet as células por 2 min a 10.000 × g em um microfugo. Rejeitar o sobrenadante com uma pipeta de vácuo.
   7. Ressuspender o pellet celular em 200 μL de PBS + 1% de albumina sérica bovina (BSA). Incubar por 30 min no RT.
      NOTA: Tempos mais longos não são necessários e são até prejudiciais para a eficiência das reações de clique.
   8. Pellet as células por 2 min a 10.000 × g em uma microcentrífuga. Rejeitar o sobrenadante com uma pipeta de vácuo.
   9. Ressuspender o pellet em 300 μL de PBS + 1% BSA.
   10. Distribuir as células entre dois tubos: 200 μL em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para a reação Click e 100 μL em outro tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para coloração Sytox Green.
   11. Pellet as células por 2 min a 10.000 × g em uma microcentrífuga. Rejeitar o sobrenadante com uma pipeta de vácuo.
   12. Para coloração Sytox Green
       NOTA: É altamente recomendável tomar uma alíquota para a coloração Sytox Green (sem Click) para obter perfis de referência de conteúdo de DNA de alta qualidade. De fato, a reação Click extingue fortemente a fluorescência intercalante, incluindo a fluorescência Sytox Green e PI. Consequentemente, a reação Click pode distorcer a leitura do conteúdo de DNA.
       1. Ressuscite o pellet celular em 100 μL de PBS.
       2. Transfira 10-30 μL (dependendo da concentração celular) para um tubo de citômetro de fluxo contendo 300 μL de Tris-HCl de 50 mM, pH 7,5 e 0,5 μM Sytox Green.
       3. Sonicate 2x, por 2 s de cada vez, a uma amplitude de 40-50.
       4. Deixar no escuro até processar as amostras num citómetro de fluxo.
          NOTA: As células podem ser mantidas nesta fase a 4 °C durante alguns dias.
   13. Para a reação Click
       1. Preparar o tampão Azide Dye fresco misturando os reagentes na seguinte ordem (quantidade para um tubo): 36 μL de PBS, 2 μL de 0,2 M CuSO₄, 0,2 μL de 2 mM Cy5 Azida e 2 μL de 1 M de ácido ascórbico.
          NOTA: É possível preparar uma mistura master do buffer Azide Dye. Os reagentes devem ser misturados na mesma ordem que a mencionada acima.
       2. Ressuscite o pellet celular com 40 μL de mistura de Azide Dye feita na hora. Incubar em RT no escuro por 60 min.
       3. Pellet as células por 2 min a 10.000 × g em uma microcentrífuga. Rejeitar o sobrenadante com uma pipeta de vácuo.
       4. Lave as células 3x com 300 μL de etanol a 10% em PBS.
          NOTA: As lavagens são cruciais para eliminar toda a azida solúvel de EdU-Cy5.
       5. Ressuspender as células em 100 μL de 50 μg/mL PI em PBS. Deixe por 10 min no escuro.
       6. Transferir 10-30 μL da suspensão celular (dependendo da concentração celular) para um tubo de citômetro de fluxo contendo 300 μL de 50 mM Tris-HCl, pH 7,5.
       7. Sonicate 2x, por 2 s de cada vez, a uma amplitude de 40-50.
       8. Deixar no escuro até processar as amostras num citómetro.
          NOTA: As células podem ser mantidas nesta fase a 4 °C durante alguns dias.
   14. Leia as amostras do Sytox Green usando um laser azul de excitação a 488 nm e um filtro de 530/30 BP. Consulte a Figura 1A para obter resultados típicos. Leia as amostras bivariadas de PI-EdU em um gráfico de pontos usando um laser azul de excitação a 488 nm e um filtro de 615/20 BP para o PI (eixo x) e um laser vermelho de excitação a 640 nm e um filtro de 660/20 BP (eixo y). Consulte a Figura 1B para obter resultados típicos.
       NOTA: A Figura 1C representa o resultado típico do FACS bivariado PI-EdU para células EdU-negativas. Permite a discriminação das células EdU-negativas das células EdU-positivas.
2. Para análise microscópica
   1. Pellet as células por 2 min a 10.000 × g em uma microcentrífuga. Rejeitar o sobrenadante com uma pipeta de vácuo.
   2. Ressuspender o pellet em 200 μL de PBS + 1% BSA. Incubar por 30 min no RT.
   3. Pellet as células por 2 min a 10.000 × g em um microfuge. Rejeitar o sobrenadante com uma pipeta de vácuo.
   4. Preparar o tampão Azide Dye fresco misturando os reagentes na seguinte ordem (quantidade para um tubo): 36 μL de PBS, 2 μL de 0,2 M CuSO₄, 0,2 μL de 2 mM de azida Dy-530, 2 μL de ácido ascórbico 1 M.
      NOTA: Uma mistura mestra do tampão Azide Dye pode ser preparada fresca misturando os reagentes na ordem acima mencionada.
   5. Ressuscite o pellet com 40 μL de tampão Azide Dye acabado de fazer. Incubar em RT no escuro por 60 min.
   6. Pellet as células por 2 min a 10.000 × g em um microfugo. Rejeitar o sobrenadante com uma pipeta de vácuo.
   7. Lave as células 2x com 300 μL de etanol a 10% em PBS.
      NOTA: As lavagens são cruciais para eliminar toda a azida solúvel de Dy-530.
   8. Pellet as células por 2 min a 10.000 × g em uma microcentrífuga. Rejeitar o sobrenadante com uma pipeta de vácuo.
   9. Ressuspender as células em 100 μL de 0,5 μg/mL 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) em PBS. Deixe por 30 min no escuro à temperatura ambiente.
   10. Pellet as células por 2 min a 10.000 × g em uma microcentrífuga. Rejeitar o sobrenadante com uma pipeta de vácuo.
   11. Lave com 300 μL de PBS para remover o excesso de DAPI.
   12. Pellet as células por 2 min a 10.000 × g em um microfugo. Rejeitar o sobrenadante com uma pipeta de vácuo.
   13. Ressuscite o pellet com 10-50 μL de PBS, dependendo da concentração celular.
   14. Sonicate 2x, por 2 s de cada vez, a uma amplitude de 40-50.
       NOTA: As células podem ser mantidas nesta fase a 4 °C durante alguns dias.
   15. Pipetar 1,7 μL das células para uma lâmina de microscópio de vidro e cobrir com uma tampa limpa.
   16. Observe imediatamente sob um microscópio de fluorescência com filtros DAPI e TexasRed ou Cy3.

Resultados

Para determinar a duração da fase S e, de forma mais ampla, a duração de G 1 e G₂ + M (etapa do protocolo 1.1), células selvagens do tipo S. cerevisiae W303 (WT, Tabela 1) foram cultivadas de forma assíncrona em meio SC por 7 h. A cada hora, a concentração celular foi monitorada para determinar o tempo de duplicação (Figura 2B). Nessas condições de crescimento, o tempo de duplicação calculado foi de 120 min ± 13 min a 25 °C (

Discussão

A levedura é um organismo modelo primordial para estudos do ciclo celular, mas a caracterização de sua fase S tem sido dificultada por sua incapacidade de incorporar nucleosídeos exógenos, como o BrdU, que são usados como traçadores da replicação do DNA. Equipar leveduras com alta expressão de herpes simplex timidina quinase (TK) e a adição de um transportador de nucleosídeos humanos (hENT) resolveram em grande parte esse problema^15,16. O EdU é mais...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
α-factor	Genescript	RP01002
Bovine Serum Albumin (BSA)	Euromedex	04-100--812-E
Copper sulfate	Sigma	C1297
DAPI	Sigma	D9542
Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide)	Interchim	FP-JV6320	Alternative to Alexa647-Azide
Dy-530 azide	Dyomics	530-10
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine)	Carbosynth	NE08701
Ethanol absolute	Carlo Erba reagents	P013A10D16	or equivalent
L- ascorbic acid	Sigma	A4544
Propidium iodide	Sigma	P4864
Proteinase K	Euromedex	EU0090
Rnase	SIGMA	R5000
Sytox Green	Invitrogen	S-7020
Equipment
Cell counter	OLS	CASY
Flow cytometer	Agilent	NovoSampler Pro
Shaking incubator	Infors	444-4230	or equivalent
Shaking water bath	Julabo	SW22	or equivalent
Sonicator	Sonics	Vibra cell
Wide-field microscopy	Leica	THUNDER Imager	or equivalent