出芽酵母における5-エチニル-2'-デオキシウリジンの取り込みを用いたS期持続時間の決定

要約

我々は、in vivoに組み込まれ、顕微鏡およびフローサイトメトリーによってクリックケミストリーを使用して検出されるチミジン類似体であるEdUを使用して、S.cerevisiaeのS期持続時間を正確に決定するための2つの補完的なプロトコルについて説明します。これにより、DNA複製の持続時間や変異体の見落とされた複製欠陥を簡単に特徴付けることができます。

要約

真核生物のDNA複製は、染色体分離の前に細胞の遺伝的青写真が正しく複製されることを保証する高度に制御されたプロセスです。DNA合成の欠陥は染色体再配列の根底にあるため、DNA複製のモニタリングは、ゲノム不安定性の基礎を理解するために不可欠になっています。 Saccharomyces cerevisiae は、細胞周期調節を研究するための古典的なモデルですが、S期の細胞の割合やS期の持続時間などの重要なDNA複製パラメータを決定することは依然として困難です。このプロトコルは、チミジン類似体である5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)の短い非毒性パルスを改変されたTK-hENT1酵母細胞で使用し、続いてクリック反応で検出することで、顕微鏡およびフローサイトメトリーによる単一細胞レベルと集団レベルの両方で高い空間的および時間的分解能でDNA複製の視覚化と定量を可能にします。この方法は、酵母変異体のS期および細胞周期進行におけるこれまで見過ごされてきた欠陥を特定し、それによってゲノム安定性を確保するために不可欠な新しいプレーヤーの特性評価を可能にする可能性があります。

概要

有糸分裂によるゲノム安定性は、2つの産生された細胞子孫への完全かつ等しい染色体のセットの伝達によって保証される。これは、細胞周期の各段階において所与の時間に起こる一連の事象の正確な完了に依存する。G 1では、複製元は、Cdc6¹を含むいくつかのライセンス要素の採用時にライセンスされます。S期では、全ゲノム複製は複数のアクティブな複製起点から開始され、複製^{ファクトリー2}と呼ばれる顕微鏡的に見える焦点に集まる複製機械によって実行されます。M期では、複製された姉妹染色分体が有糸分裂紡錘体上に付着し、双配向して、有糸分裂細胞³の反対側の極に分離することを可能にする。各フェーズの調節、適切な完了、および期間は、ゲノムの安定性を確保するための鍵です。実際、これらの段階のいずれかからの時期尚早の終了は、ゲノムの不安定性につながります。例えば、出芽酵母CDK阻害剤Sic1の欠失またはG1サイクリンの過剰発現によって誘導されるより短い_G1は、その後のS期4,5,6を変化させるであろう。その結果、複製ストレスに関連するかどうかにかかわらず、これらの規制緩和は、染色体の切断、再配列、および誤分離をもたらします^4,5,6。したがって、S期の持続時間、より広義には細胞周期の他の段階の持続時間を監視することは、異なる変異体および異なるストレスの多い条件で発生する欠陥を特定するために重要であり得る。

細胞周期の持続時間を測定する従来の方法には、単純なDNA含有フローサイトメトリー(図1A)が含まれ、1Cおよび2Cピークから集団をG₁、S、およびG₂ + Mフェーズフラクションに分離するために使用されるフィッティングアルゴリズム(ほとんどのサイトメトリーソフトウェアで利用可能)に依存します。次に、分数に母集団倍増時間⁷を掛けます。ただし、この方法は推定値のみを提供し、特定のフラクション内で均一な細胞サイズ分布を必要とし、同期培養には適用できません。哺乳類細胞におけるS期持続時間を研究するために、EdUを含むいくつかのチミジン類似体が開発され、広く使用されている。細胞外培地からの取り込みとチミジンキナーゼ(以下TK)によるリン酸化により、DNAポリメラーゼがDNA合成(複製、組換え、修復)の部位に取り込むことができます。 サッカロミセス・セレビシエ 細胞におけるTK遺伝子の不在を回避するために、酵母株は、単純ヘルペスウイルスTK⁸ およびヒト平衡ヌクレオシドトランスポーター(hENT1)⁹の安定かつ構成的発現を可能にするように操作されている。DNAに取り込まれると、EdUは選択的クリック反応 を介して 検出され、そのアルキン部分をアジド修飾蛍光色素¹⁰に化学的に結合します。

この論文は、顕微鏡とフローサイトメトリーによって単一細胞レベルと集団レベルの両方で高い空間的および時間的分解能で、DNA複製期間とダイナミクス、および細胞周期の他のフェーズの持続時間を正確に視覚化および測定するために、EdUで非同期および同期TK-hENT1操作細胞をパルス標識するための2つの最適化された包括的なプロトコルを提供します。

プロトコル

1. S. セレビシエ 細胞培養

注:使用した酵母株は表1に記載されています

注意: Sフェーズの持続時間は、さまざまな方法で監視できます。対処すべき問題に応じて、細胞は、G₁ 停止後に非同期または同期的に増殖させることができる。

1. 非同期に増殖 するS.セレビシエ 細胞から
   注:この方法では、非同期的に成長する細胞集団におけるS期の細胞の割合を決定できます。倍増時間を決定することにより、Sフェーズ(および他のフェーズ)の持続時間を外挿できます。
   1. 10 mLの合成完全(SC)培地に S. cerevisiae 細胞を低細胞濃度(5 ×^{10 4} 細胞/mL)で接種し、130 rpmで軌道攪拌しながら30°Cで一晩培養します。
      注:濃度はセルカウンターで測定されます。倍加時間を効率的に計算するには、まだ指数関数的段階にある(理想的には2 ×^{10 7} cells/mL未満)の一晩培養から培養物を接種することをお勧めします。リッチ培地(YPD)で細胞を増殖させることは、EdU検出が効率的ではないため推奨されません。
   2. 翌日、細胞を20 mLの新鮮なSC培地で最終濃度5×10⁵ 細胞/mLで希釈します。
   3. 細胞を120rpmで横振とうしながら振とう水浴中で30°Cで培養した。
   4. 細胞濃度は、1 ×^{10 7} cells/mLに達するまで1時間ごとに測定します。
      注:この手順により、時間の経過に伴う細胞濃度の増加をグラフィカルに表示できます。倍増時間の計算に使用される式は、 表2の凡例で説明されています。
   5. 細胞濃度が約2 ×^{10 6-5}×^{10 6} 細胞/mLの場合、EdU標識のステップ2と並行して進めます。
2. G₁- 同期したS.セレビシエ 細胞から
   注:この方法では、フローサイトメトリーおよび/または顕微鏡分析によってS期の開始時期と終了時期を決定できます。
   1. S. cerevisiae細胞を10 mLのSC培地に低細胞濃度(5 ×^{10 4} cells/mL)で接種し、130 rpmで軌道攪拌しながら30°Cで一晩培養します。
      メモ: 手順 1.1.1 以降の注を参照してください。
   2. 翌日、細胞を20 mLの新鮮なSC培地で最終濃度2 ×^{10 6-3}×10⁶ 細胞/mLで希釈します。
   3. 水で希釈した1 mg/mLのα因子を40 μL加えます。
   4. 細胞を30°Cで130rpmで1時間軌道撹拌しながら培養する。
   5. 水で希釈した1 mg/mLのα因子を40 μL再度加えます。
   6. 細胞を30°Cで130rpmで1時間軌道撹拌しながら培養する。
   7. 光学顕微鏡下で細胞を可視化し、G₁ 停止をモニターする。セルの90%以上がshmooを表示し、他のセルが丸みを帯びた芽のないセルである場合に進みます。
      注:使用する背景に応じて、shmoo視覚化の前に細胞を超音波処理することをお勧めします。W303の背景のために、40-50の振幅で、毎回2秒間、2x超音波処理します。
   8. 1,500 × gで3分間遠心分離します。上清を真空ピペットで捨てる。
   9. 細胞を20 mLのSC培地に再懸濁します。
   10. 手順1.2.8〜1.2.9を1回繰り返します。
       注:これらのステップでα因子が洗い流され、細胞が細胞周期で放出されます。あるいは、真空ポンプに接続されたサイドアームフラスコにセットされた漏斗を使用して、1.2μmのニトロセルロースフィルターで酵母細胞をろ過することにより、α因子を洗い流すことができます。
   11. 5分ごとに1 mLの細胞を2回収集し、EdU標識のステップ2に進みます。
       注:2本のチューブのうち1本のみの細胞にEdUをパルスラベル付けします。非パルス標識細胞は、二変量ヨウ化プロピジウム(PI)-EdUグラフ上でEdU陽性細胞とEdU陰性細胞を区別するために使用されます。
   12. 放出後30分で水で希釈した1 mg/mL α因子400 μLを加えます。.
       注:この高用量のα因子は、次の細胞周期のG₁ 期で細胞を阻止し、細胞が次のS期に再入するのを防ぐために必要です。

2. EdUラベリング

1. 1 mLの細胞培養液を、1 μLの10 mM EdUを含む2.0 mLの微量遠心チューブに移します。反転でよく混ぜます。
   注:PI-EdU二変量FACSでEdU陽性細胞とEdU陰性細胞を区別するには、さらに1 mLの細胞培養液を、1 μLのDMSOを含む2.0 mLのマイクロフュージチューブに移します。
2. 振とう水浴中で攪拌しながら30°Cで3〜5分間インキュベートします。
   注:顕微鏡でのEdU検出には3分で十分です。フローサイトメーターで最適なEdUを検出するには5分かかります。
3. 100 μLの100%エタノールを加えて反応を停止します。
   1. 細胞サイズの測定が必要な場合は、100 μLの20%パラホルムアルデヒドを添加して反応を停止します。
      注:Click反応後のさらなる分析のために有糸分裂細胞の核構造をそのまま維持する場合は、細胞を氷上に置くのではなく、室温(RT)で2%パラホルムアルデヒドで細胞を固定することをお勧めします。
   2. 100 μLの100%エタノールを添加する前に、可変速ロッカーで20チルト/分で穏やかに攪拌しながら、細胞をRTで20分間放置します。

3. 細胞の固定と透過処理

1. 細胞をマイクロフュージで10,000 × g で2分間ペレット化します。真空ピペットを使用して上清を除去します。
2. 細胞ペレットを500 μLの70%エタノールに再懸濁します。ボルテックスでよく混ぜます。
3. 可変速ロッカーでRTで20チルト/分で≥1時間放置し、細胞を透過させます。
   注:SC培地で増殖した細胞は、マイクロフュージ壁に付着する傾向があるため、うまくペレット化されません。エタノールの添加はペレット化を改善し、細胞損失を減少させる。細胞は4°Cで一晩保存することも、-20°Cで長期間保存することもできます。
4. 細胞をマイクロ遠心分離機で10,000 × g で2分間ペレット化します。上清を真空ピペットで捨てる。
5. 細胞をPBS中の500 μLの10%エタノールで2回洗浄します。
   注:洗浄は、細胞から取り込まれていないEdUを除去するために重要です。

4.クリック反応

1. サイトメトリー分析用
   1. 細胞をマイクロフュージで10,000 × g で2分間ペレット化します。上清を真空ピペットで捨てる。
   2. 0.1 mg/mL RNase Aおよび0.2 mg/mLプロテイナーゼKを含む200 μLのPBSにペレットを再懸濁します。
   3. 時々振とうしながら50°Cで1〜2時間インキュベートします(または37°Cで一晩)。
   4. 細胞をマイクロ遠心分離機で10,000 × g で2分間ペレット化します。上清を真空ピペットで捨てる。
   5. 細胞を500 μLのPBSで洗浄します。
   6. 細胞をマイクロフュージで10,000 × g で2分間ペレット化します。上清を真空ピペットで捨てる。
   7. 細胞ペレットを200 μLのPBS + 1%ウシ血清アルブミン(BSA)に再懸濁します。RTで30分間インキュベートします。
      注:より長い時間は必要ではなく、クリック反応の効率にさえ悪影響を及ぼします。
   8. 細胞をマイクロ遠心分離機で10,000 × g で2分間ペレット化します。上清を真空ピペットで捨てる。
   9. ペレットを300 μLのPBS + 1%BSAに再懸濁します。
   10. 細胞を2本のチューブに分配します:クリック反応用の1.5 mLマイクロ遠心チューブに200 μL、Sytox Green染色用に別の1.5 mLマイクロ遠心チューブに100 μL。
   11. 細胞をマイクロ遠心分離機で10,000 × g で2分間ペレット化します。上清を真空ピペットで捨てる。
   12. シトックスグリーン染色用
       注:高品質のDNA含有量参照プロファイルを取得するために、Sytox Green染色(クリックなし)のアリコートを採取することを強くお勧めします。実際、クリック反応は、Sytox GreenおよびPI蛍光を含むインターカラント蛍光を強く消光します。その結果、クリック反応はDNA含有量の読み取りを歪める可能性があります。
       1. 細胞ペレットを100 μLのPBSに再懸濁します。
       2. 10-30 μL(細胞濃度に応じて)を、300 μLの50 mM Tris-HCl、pH 7.5、および0.5 μMのSytox Greenを含むフローサイトメーターチューブに移します。
       3. 40-50の振幅で、毎回2秒間、2倍超音波処理します。
       4. フローサイトメーターでサンプルを処理するまで、暗所に置いてください。
          注:細胞はこの段階で4°Cで数日間保持できます。
   13. クリック反応の場合
       1. 36 μLのPBS、2 μLの0.2 M CuSO₄、0.2 μLの2 mM Cy5アジド、および2 μLの1 Mアスコルビン酸の順(1本のチューブの量)で試薬を混合して、新しいアジ化物色素バッファーを調製します。
          注:アジド色素バッファーのマスターミックスを調製することが可能です。試薬は、上記と同じ順序で混合する必要があります。
       2. 細胞ペレットを40 μLの新しく作られたアジド染料ミックスで再懸濁します。暗闇の中でRTで60分間インキュベートします。
       3. 細胞をマイクロ遠心分離機で10,000 × g で2分間ペレット化します。上清を真空ピペットで捨てる。
       4. PBS中の300 μLの10%エタノールで細胞を3回洗浄します。
          注:洗浄は、すべての可溶性EdU-Cy5アジドを除去するために重要です。
       5. 細胞を 100 μL の 50 μg/mL PI の PBS に再懸濁します。暗闇の中で10分間放置してください。
       6. 10〜30 μLの細胞懸濁液(細胞濃度に応じて)を、300 μLの50 mM Tris-HCl、pH 7.5を含むフローサイトメーターチューブに移します。
       7. 40-50の振幅で、毎回2秒間、2倍超音波処理します。
       8. サイトメーターでサンプルを処理するまで暗所に置いてください。
          注:細胞はこの段階で4°Cで数日間保持できます。
   14. 488 nmの励起青色レーザーと530/30 BPフィルターを使用して、Sytox Greenサンプルを読み取ります。典型的な結果については 、図1A を参照してください。PI(x軸)には488nmの励起青色レーザーと615/20 BPフィルター、640 nmの励起赤色レーザーと660/20 BPフィルター(y軸)を使用して、ドットプロット上の二変量PI-EdUサンプルを読み取ります。典型的な結果については 、図1B を参照してください。
       注: 図1C は、EdU陰性細胞の典型的なPI-EdU二変量FACS結果を表しています。これにより、EdU陰性細胞とEdU陽性細胞との識別が可能になります。
2. 顕微鏡分析用
   1. 細胞をマイクロ遠心分離機で10,000 × g で2分間ペレット化します。上清を真空ピペットで捨てる。
   2. ペレットを200 μLのPBS + 1%BSAに再懸濁します。RTで30分間インキュベートします。
   3. 細胞をマイクロフュージで10,000 × g で2分間ペレット化します。上清を真空ピペットで捨てる。
   4. 試薬を次の順序(1本のチューブに対する量)で混合して、新鮮なアジ化物色素バッファーを調製します:36 μLのPBS、2 μLの0.2 M CuSO₄、0.2 μLの2 mM Dy-530アジ化物、2 μLの1 Mアスコルビン酸。
      注:アジド色素バッファーのマスターミックスは、前述の順序で試薬を混合することにより、新鮮に調製できます。
   5. ペレットを40 μLの新しく作られたアジド染料バッファーで再懸濁します。暗闇の中でRTで60分間インキュベートします。
   6. 細胞をマイクロフュージで10,000 × g で2分間ペレット化します。上清を真空ピペットで捨てる。
   7. 細胞をPBS中の300 μLの10%エタノールで2回洗浄します。
      注意: 洗浄は、すべての可溶性Dy-530アジドを除去するために重要です。
   8. 細胞をマイクロ遠心分離機で10,000 × g で2分間ペレット化します。上清を真空ピペットで捨てる。
   9. 細胞を0.5 μg/mL 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)の 100 μL に PBS で再懸濁します。室温で暗所に30分間放置します。
   10. 細胞をマイクロ遠心分離機で10,000 × g で2分間ペレット化します。上清を真空ピペットで捨てる。
   11. 300 μLのPBSで洗浄し、余分なDAPIを除去します。
   12. 細胞をマイクロフュージで10,000 × g で2分間ペレット化します。上清を真空ピペットで捨てる。
   13. 細胞濃度に応じて、ペレットを10〜50 μLのPBSで再懸濁します。
   14. 40-50の振幅で、毎回2秒間、2倍超音波処理します。
       注:細胞はこの段階で4°Cで数日間保持できます。
   15. 1.7 μLの細胞を顕微鏡スライドガラス上にピペットで移し、清潔なカバーガラスで覆います。
   16. DAPIおよびTexasRedまたはCy3フィルターを備えた蛍光顕微鏡で直ちに観察してください。

結果

S期持続時間および、より広義には、_G1 および_G2 +Mの持続時間を決定するために(プロトコルステップ1.1)、 S. cerevisiae W303野生型細胞(WT、 表1)をSC培地中で7時間非同期に増殖させた。1時間毎に、細胞濃度をモニターし、倍加時間を決定した(図2B)。これらの増殖条件において、計算された倍加時間は、25°Cで120分±13分であった(表2

ディスカッション

酵母は細胞周期研究の主要なモデル生物ですが、そのS期の特徴付けは、DNA複製のトレーサーとして使用されるBrdUなどの外因性ヌクレオシドを組み込むことができないために長い間妨げられてきました。酵母に単純ヘルペスチミジンキナーゼ(TK)の高発現を装備し、ヒトヌクレオシドトランスポーター(hENT)を添加することで、この問題は大部分が解決されました^15,16

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
α-factor	Genescript	RP01002
Bovine Serum Albumin (BSA)	Euromedex	04-100--812-E
Copper sulfate	Sigma	C1297
DAPI	Sigma	D9542
Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide)	Interchim	FP-JV6320	Alternative to Alexa647-Azide
Dy-530 azide	Dyomics	530-10
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine)	Carbosynth	NE08701
Ethanol absolute	Carlo Erba reagents	P013A10D16	or equivalent
L- ascorbic acid	Sigma	A4544
Propidium iodide	Sigma	P4864
Proteinase K	Euromedex	EU0090
Rnase	SIGMA	R5000
Sytox Green	Invitrogen	S-7020
Equipment
Cell counter	OLS	CASY
Flow cytometer	Agilent	NovoSampler Pro
Shaking incubator	Infors	444-4230	or equivalent
Shaking water bath	Julabo	SW22	or equivalent
Sonicator	Sonics	Vibra cell
Wide-field microscopy	Leica	THUNDER Imager	or equivalent