Détermination de la durée de la phase S à l’aide de l’incorporation de la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine chez Saccharomyces cerevisiae

Résumé

Nous décrivons deux protocoles complémentaires pour déterminer avec précision la durée de la phase S chez S. cerevisiae à l’aide d’EdU, un analogue de la thymidine, qui est incorporé in vivo et détecté à l’aide de la chimie Click par microscopie et cytométrie en flux. Il permet de caractériser facilement la durée de la réplication de l’ADN et les défauts de réplication négligés chez les mutants.

Résumé

La réplication de l’ADN eucaryote est un processus hautement réglementé qui garantit que le plan génétique d’une cellule est correctement dupliqué avant la ségrégation chromosomique. Comme les défauts de synthèse de l’ADN sous-tendent les réarrangements chromosomiques, la surveillance de la réplication de l’ADN est devenue essentielle pour comprendre la base de l’instabilité du génome. Saccharomyces cerevisiae est un modèle classique pour étudier la régulation du cycle cellulaire, mais les paramètres clés de réplication de l’ADN, tels que la fraction de cellules dans la phase S ou la durée de la phase S, sont encore difficiles à déterminer. Ce protocole utilise des impulsions courtes et non toxiques de 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU), un analogue de la thymidine, dans des cellules de levure TK-hENT1 modifiées, suivies de sa détection par réaction Click pour permettre la visualisation et la quantification de la réplication de l’ADN avec une résolution spatiale et temporelle élevée aux niveaux de la cellule unique et de la population par microscopie et cytométrie en flux. Cette méthode peut identifier des défauts auparavant négligés dans la phase S et la progression du cycle cellulaire des mutants de levure, permettant ainsi la caractérisation de nouveaux acteurs essentiels pour assurer la stabilité du génome.

Introduction

La stabilité du génome par division mitotique est assurée par la transmission d’un ensemble complet et égal de chromosomes aux deux descendants cellulaires produits. Cela repose sur l’achèvement précis d’une série d’événements se produisant dans un temps donné dans chaque phase du cycle cellulaire. Dans G 1, les origines de réplication sont concédées sous licence lors du recrutement de plusieurs facteurs de licence, y compris Cdc6₁. Dans la phase S, la duplication du génome entier est initiée à partir de multiples origines de réplication actives et effectuée par des machines de réplication qui rassemblent des foyers microscopiquement visibles appelés usines de réplication². Dans la phase M, des chromatides sœurs dupliquées sont attachées et biorientées sur le fuseau mitotique pour permettre leur ségrégation aux pôles opposés de la cellule mitotique³. La régulation, la bonne réalisation et la durée de chaque phase sont essentielles pour assurer la stabilité du génome. En effet, la sortie prématurée de l’une de ces phases conduit à une instabilité du génome. Par exemple, un G 1 plus court induit par la délétion de l’inhibiteur de CDK de levure bourgeonnant Sic1 ou par la surexpression de cyclines G₁ modifiera la phase S 4,5,6 suivante. Par conséquent, ces dérégulations, associées ou non au stress de réplication, entraînent des cassures chromosomiques, des réarrangements et une mauvaise ségrégation ^4,5,6. Par conséquent, la surveillance de la durée de la phase S et, plus largement, de la durée des autres phases du cycle cellulaire peut être cruciale pour identifier les défauts survenant chez différents mutants et dans différentes conditions stressantes.

Une méthode traditionnelle de mesure de la durée de phase du cycle cellulaire comprend une cytométrie en flux de contenu d’ADN simple (Figure 1A) et repose sur un algorithme d’ajustement (disponible dans la plupart des logiciels de cytométrie) utilisé pour séparer la population en fractions de phase G₁, S et G₂ + M des pics 1C et 2C. Les fractions sont ensuite multipliées par la population en doublant le temps⁷. Cependant, cette méthode ne donne que des valeurs estimées, nécessite une distribution homogène de la taille des cellules dans une fraction donnée et n’est pas applicable aux cultures synchronisées. Pour étudier la durée de la phase S dans les cellules de mammifères, plusieurs analogues de la thymidine ont été développés et largement utilisés, y compris EdU. Leur absorption à partir du milieu extracellulaire et leur phosphorylation par la thymidine kinase (ci-après dénommée TK) les rendent disponibles pour les ADN polymérases afin de les incorporer sur des sites de synthèse de l’ADN (réplication, recombinaison, réparation). Pour contourner l’absence du gène TK dans les cellules de Saccharomyces cerevisiae , des souches de levure ont été conçues pour permettre une expression stable et constitutive du virus de l’herpès simplex TK⁸ et du transporteur nucléosidique équilibré humain (hENT1)⁹. Une fois incorporé dans l’ADN, l’EdU est détecté via la réaction Click sélective, qui couple chimiquement sa fraction alcyne à des fluorochromes modifiés par azoture¹⁰.

Cet article fournit deux protocoles complets optimisés pour marquer des impulsions asynchrones et synchrones TK-hENT1 modifiées avec EdU afin de visualiser et de mesurer avec précision la durée et la dynamique de la réplication de l’ADN, ainsi que la durée des autres phases du cycle cellulaire, avec une résolution spatiale et temporelle élevée aux niveaux de la cellule unique et de la population par microscopie et cytométrie en flux.

Protocole

1. Culture cellulaire de S. cerevisiae

REMARQUE : Les souches de levure utilisées sont énumérées dans le tableau 1.

REMARQUE: La durée de la phase S peut être surveillée de différentes manières. Selon la question à traiter, les cellules peuvent être cultivées de manière asynchrone ou synchrone après l’arrêt G₁ .

1. À partir de cellules de S. cerevisiae en croissance asynchrone
   REMARQUE : Cette méthode permet de déterminer le pourcentage de cellules en phase S dans une population cellulaire à croissance asynchrone. En déterminant le temps de doublement, la durée de la phase S (et des autres phases) peut être extrapolée.
   1. Inoculer des cellules de S. cerevisiae dans 10 mL de milieu synthétique complet (SC) à une faible concentration cellulaire (5 × 10⁴ cellules/mL) pour une culture nocturne à 30 °C avec agitation orbitale à 130 rpm.
      REMARQUE: La concentration est mesurée avec un compteur de cellules. Pour calculer efficacement les temps de doublement, il est recommandé d’inoculer la culture à partir d’une culture de nuit qui est encore en phase exponentielle (c.-à-d. idéalement inférieure à 2 × 10⁷ cellules/mL). La croissance de cellules en milieu riche (YPD) n’est pas recommandée, car la détection de l’EdU n’est pas efficace.
   2. Le lendemain, diluer les cellules dans 20 mL de milieu SC frais à la concentration finale de 5 × 10⁵ cellules/mL.
   3. Culture des cellules à 30 °C dans un bain-marie oscillant avec agitation horizontale à 120 tr/min.
   4. Mesurer la concentration cellulaire toutes les heures jusqu’à ce qu’elle atteigne 1 × 10⁷ cellules/mL.
      REMARQUE: Cette étape permet de faire une représentation graphique de l’augmentation de la concentration cellulaire au fil du temps. La formule utilisée pour calculer les temps de doublement est expliquée dans la légende du tableau 2.
   5. Procéder parallèlement à l’étape 2 pour le marquage EdU lorsque la concentration cellulaire est d’environ 2 × 10 6-5^× 10⁶ cellules/mL.
2. À partir de cellules de S. cerevisiae synchronisées G₁
   NOTE: Cette méthode permet de déterminer le début et la fin de la phase S au moyen d’analyses de cytométrie en flux et / ou de microscopie.
   1. Inoculer des cellules de S. cerevisiae dans 10 mL de milieu SC à une faible concentration cellulaire (5 × 10⁴ cellules/mL) pour une culture nocturne à 30 °C avec agitation orbitale à 130 rpm.
      NOTA : Voir les remarques après l’étape 1.1.1.
   2. Le lendemain, diluer les cellules dans 20 mL de milieu SC frais à une concentration finale de 2 × 10 6-3^× 10⁶ cellules/mL.
   3. Ajouter 40 μL de facteur α de 1 mg/mL dilué dans de l’eau.
   4. Culture des cellules à 30 °C avec agitation orbitale à 130 tr/min pendant 1 h.
   5. Ajouter de nouveau 40 μL de facteur α à 1 mg/mL dilué dans de l’eau.
   6. Culture des cellules à 30 °C avec agitation orbitale à 130 tr/min pendant 1 h.
   7. Visualisez les cellules au microscope optique pour surveiller l’arrêt G₁ . Procédez si plus de 90% des cellules présentent un shmoo et les autres sont des cellules arrondies et non bourgeonnées.
      REMARQUE: Selon l’arrière-plan utilisé, il est recommandé de soniciser les cellules avant la visualisation shmoo. Pour le fond W303, sonicer 2x, pendant 2 s à chaque fois, à une amplitude de 40-50.
   8. Centrifuger pendant 3 min à 1 500 × g. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette à vide.
   9. Remettez les cellules en suspension dans 20 mL de milieu SC.
   10. Répétez les étapes 1.2.8 à 1.2.9 une fois.
       REMARQUE: Le facteur α est éliminé avec ces étapes et les cellules sont libérées dans le cycle cellulaire. Alternativement, le facteur α peut être éliminé en filtrant les cellules de levure avec un filtre en nitrocellulose de 1,2 μm à l’aide d’un entonnoir placé sur un ballon à bras latéral relié à une pompe à vide.
   11. Prélever 1 mL de cellules 2x toutes les 5 minutes et passer à l’étape 2 pour l’étiquetage EdU.
       REMARQUE: Marquez les cellules d’un seul des deux tubes avec EdU. Les cellules non marquées par impulsions sont utilisées pour distinguer les cellules EdU-positives des cellules EdU-négatives sur un graphe bivarié d’iodure de propidium (PI)-EdU.
   12. Ajouter 400 μL de facteur α à 1 mg/mL dilué dans de l’eau 30 minutes après la libération.
       NOTE: Cette dose élevée de facteur α est nécessaire pour arrêter les cellules dans la phase G₁ du prochain cycle cellulaire et pour empêcher les cellules de réintégrer la phase S suivante.

2. Étiquetage EdU

1. Transférer 1 mL de culture cellulaire dans un tube à microfuge de 2,0 mL contenant 1 μL de 10 mM d’EdU. Bien mélanger par inversion.
   REMARQUE: Pour distinguer les cellules EdU-positives des cellules EdU-négatives sur un FACS bivarié PI-EdU, transférer un autre 1 mL de culture cellulaire dans un tube de microfuge de 2,0 mL contenant 1 μL de DMSO.
2. Incuber pendant 3-5 min à 30 °C sous agitation dans un bain-marie agité.
   REMARQUE: Trois minutes sont suffisantes pour la détection EdU avec un microscope; 5 min sont nécessaires pour une détection optimale de l’EdU sur un cytomètre en flux.
3. Arrêtez la réaction avec l’ajout de 100 μL d’éthanol à 100%.
   1. Arrêter la réaction avec l’ajout de 100 μL de paraformaldéhyde à 20% si une mesure de la taille des cellules est nécessaire.
      NOTE: Si l’architecture nucléaire des cellules mitotiques doit être conservée intacte pour d’autres analyses après la réaction de clic, nous recommandons de fixer les cellules avec 2% de paraformaldéhyde à température ambiante (RT) plutôt que de mettre les cellules sur de la glace, car cette dernière provoque la dépolymérisation des microtubules.
   2. Laisser les cellules pendant 20 min à TA sous agitation légère sur une bascule à vitesse variable à 20 inclinaisons/min pour fixer les cellules avant l’ajout de 100 μL d’éthanol à 100 %.

3. Fixation cellulaire et perméabilisation

1. Enduire les cellules pendant 2 min à 10 000 × g dans un microfuge. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette à vide.
2. Remettez en suspension la pastille de cellule dans 500 μL d’éthanol à 70%. Bien mélanger en tourbillonnant.
3. Laisser reposer ≥1 h à RT à 20 inclinaisons/min sur une bascule à vitesse variable pour perméabiliser les cellules.
   REMARQUE: Les cellules cultivées en milieu SC ne s’enrobent pas bien car elles ont tendance à adhérer aux parois des microfuges. L’ajout d’éthanol améliore la granulation et réduit la perte cellulaire. Les cellules peuvent être conservées à 4 °C pendant une nuit ou pendant de plus longues périodes à −20 °C.
4. Enduire les cellules pendant 2 min à 10 000 × g dans une microcentrifugeuse. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette à vide.
5. Laver les cellules 2x avec 500 μL d’éthanol à 10% dans du PBS.
   REMARQUE: Les lavages sont cruciaux pour éliminer l’EdU non incorporé des cellules.

4. Réaction au clic

1. Pour l’analyse cytométrique
   1. Enduire les cellules pendant 2 min à 10 000 × g dans un microfuge. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette à vide.
   2. Resuspendre la pastille dans 200 μL de PBS contenant 0,1 mg/mL de RNase A et 0,2 mg/mL de protéinase K.
   3. Incuber pendant 1-2 h à 50 °C avec agitation occasionnelle (ou toute la nuit à 37 °C).
   4. Enduire les cellules pendant 2 min à 10 000 × g dans une microcentrifugeuse. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette à vide.
   5. Lavez les cellules avec 500 μL de PBS.
   6. Enduire les cellules pendant 2 min à 10 000 × g dans un microfuge. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette à vide.
   7. Resuspendre la pastille cellulaire dans 200 μL de PBS + 1% d’albumine sérique bovine (BSA). Incuber pendant 30 min à RT.
      REMARQUE: Des temps plus longs ne sont pas nécessaires et nuisent même à l’efficacité des réactions de clic.
   8. Enduire les cellules pendant 2 min à 10 000 × g dans une microcentrifugeuse. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette à vide.
   9. Remettez la pastille en suspension dans 300 μL de PBS + 1% de BSA.
   10. Répartir les cellules entre deux tubes : 200 μL dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL pour la réaction Click et 100 μL dans un autre tube microcentrifuge de 1,5 mL pour la coloration Sytox Green.
   11. Enduire les cellules pendant 2 min à 10 000 × g dans une microcentrifugeuse. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette à vide.
   12. Pour la coloration verte Sytox
       REMARQUE: Nous recommandons fortement de prendre une partie aliquote pour la coloration verte Sytox (sans clic) afin d’obtenir des profils de référence de contenu ADN de haute qualité. En effet, la réaction Click éteint fortement la fluorescence intercalante, y compris la fluorescence Sytox Green et PI. Par conséquent, la réaction de clic peut fausser la lecture du contenu de l’ADN.
       1. Remettez en suspension la pastille de la cellule dans 100 μL de PBS.
       2. Transférer 10 à 30 μL (selon la concentration cellulaire) dans un tube de cytomètre en flux contenant 300 μL de Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 et 0,5 μM Sytox Green.
       3. Soniquer 2x, pendant 2 s à chaque fois, à une amplitude de 40-50.
       4. Laisser dans l’obscurité jusqu’à ce que les échantillons soient traités sur un cytomètre en flux.
          NOTE: Les cellules peuvent être conservées à ce stade à 4 ° C pendant quelques jours.
   13. Pour la réaction Click
       1. Préparer un tampon de colorant azoté frais en mélangeant les réactifs dans l’ordre suivant (quantité pour un tube) : 36 μL de PBS, 2 μL de 0,2 M CuSO4, 0,2 μL d’azoture de Cy5 2 mM et 2 μL d’acide ascorbique 1 M.
          NOTE: Il est possible de préparer un mélange maître du tampon de colorant azoté. Les réactifs doivent être mélangés dans le même ordre que celui mentionné ci-dessus.
       2. Remettez en suspension la pastille de cellule avec 40 μL de mélange de colorant azotural fraîchement préparé. Incuber à RT dans le noir pendant 60 min.
       3. Enduire les cellules pendant 2 min à 10 000 × g dans une microcentrifugeuse. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette à vide.
       4. Lavez les cellules 3x avec 300 μL d’éthanol à 10% dans du PBS.
          NOTE: Les lavages sont cruciaux pour éliminer tout l’azoture soluble d’EdU-Cy5.
       5. Resuspendre les cellules dans 100 μL de 50 μg/mL PI dans du PBS. Laisser reposer 10 min dans l’obscurité.
       6. Transférer 10 à 30 μL de la suspension cellulaire (selon la concentration cellulaire) dans un tube de cytomètre en flux contenant 300 μL de Tris-HCl 50 mM, pH 7,5.
       7. Soniquer 2x, pendant 2 s à chaque fois, à une amplitude de 40-50.
       8. Laisser dans l’obscurité jusqu’à ce que les échantillons soient traités sur un cytomètre.
          NOTE: Les cellules peuvent être conservées à ce stade à 4 ° C pendant quelques jours.
   14. Lisez les échantillons Sytox Green à l’aide d’un laser bleu d’excitation à 488 nm et d’un filtre 530/30 BP. Voir la figure 1A pour les résultats typiques. Lire les échantillons PI-EdU bivariés sur un diagramme de points à l’aide d’un laser bleu d’excitation à 488 nm et d’un filtre 615/20 BP pour le PI (axe x) et d’un laser rouge d’excitation à 640 nm et d’un filtre 660/20 BP (axe y). Voir la figure 1B pour les résultats typiques.
       REMARQUE : La figure 1C représente le résultat FACS bivarié PI-EdU typique pour les cellules EdU négatives. Il permet la discrimination des cellules EdU-négatives des cellules EdU-positives.
2. Pour l’analyse microscopique
   1. Enduire les cellules pendant 2 min à 10 000 × g dans une microcentrifugeuse. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette à vide.
   2. Remettez la pastille en suspension dans 200 μL de PBS + 1% de BSA. Incuber pendant 30 min à RT.
   3. Enduire les cellules pendant 2 min à 10 000 × g dans un microfuge. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette à vide.
   4. Préparer un tampon de colorant azoturé frais en mélangeant les réactifs dans l’ordre suivant (quantité pour un tube) : 36 μL de PBS, 2 μL de 0,2 M_CuSO4, 0,2 μL d’azoture Dy-530 2 mM, 2 μL d’acide ascorbique 1 M.
      NOTE: Un mélange maître du tampon de colorant azoté peut être préparé frais en mélangeant les réactifs dans l’ordre susmentionné.
   5. Remettez la pastille en suspension avec 40 μL de tampon de colorant azotural fraîchement préparé. Incuber à RT dans le noir pendant 60 min.
   6. Enduire les cellules pendant 2 min à 10 000 × g dans un microfuge. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette à vide.
   7. Laver les cellules 2x avec 300 μL d’éthanol à 10% dans du PBS.
      REMARQUE: Les lavages sont cruciaux pour éliminer tous les azotures solubles de Dy-530.
   8. Enduire les cellules pendant 2 min à 10 000 × g dans une microcentrifugeuse. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette à vide.
   9. Resuspendre les cellules dans 100 μL de 0,5 μg/mL de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dans du PBS. Laisser reposer 30 min dans l’obscurité à température ambiante.
   10. Enduire les cellules pendant 2 min à 10 000 × g dans une microcentrifugeuse. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette à vide.
   11. Laver avec 300 μL de PBS pour éliminer l’excès de DAPI.
   12. Enduire les cellules pendant 2 min à 10 000 × g dans un microfuge. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette à vide.
   13. Remettez la pastille en suspension avec 10-50 μL de PBS selon la concentration de la cellule.
   14. Soniquer 2x, pendant 2 s à chaque fois, à une amplitude de 40-50.
       NOTE: Les cellules peuvent être conservées à ce stade à 4 ° C pendant quelques jours.
   15. Pipeter 1,7 μL des cellules sur une lame de microscope en verre et couvrir avec une lamelle de couverture propre.
   16. Observez immédiatement au microscope à fluorescence avec DAPI et filtres TexasRed ou Cy3.

Résultats

Pour déterminer la durée de la phase S et, plus largement, la durée de G₁ et G₂ + M (étape de protocole 1.1), des cellules de type sauvage W303 de S. cerevisiae (WT, Tableau 1) ont été cultivées de manière asynchrone en milieu SC pendant 7 h. Toutes les heures, la concentration de la cellule a été surveillée pour déterminer le temps de doublement (figure 2B). Dans ces conditions de croissance, le temps de doublement calculé était ...

Discussion

La levure est un organisme modèle de premier plan pour les études du cycle cellulaire, mais la caractérisation de sa phase S a longtemps été entravée par son incapacité à incorporer des nucléosides exogènes, tels que BrdU, qui sont utilisés comme traceurs de la réplication de l’ADN. L’équipement de la levure avec une expression élevée de l’herpès simplex thymidine kinase (TK) et l’ajout d’un transporteur nucléosidique humain (hENT) a largement résolu ce problème^15,16

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
α-factor	Genescript	RP01002
Bovine Serum Albumin (BSA)	Euromedex	04-100--812-E
Copper sulfate	Sigma	C1297
DAPI	Sigma	D9542
Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide)	Interchim	FP-JV6320	Alternative to Alexa647-Azide
Dy-530 azide	Dyomics	530-10
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine)	Carbosynth	NE08701
Ethanol absolute	Carlo Erba reagents	P013A10D16	or equivalent
L- ascorbic acid	Sigma	A4544
Propidium iodide	Sigma	P4864
Proteinase K	Euromedex	EU0090
Rnase	SIGMA	R5000
Sytox Green	Invitrogen	S-7020
Equipment
Cell counter	OLS	CASY
Flow cytometer	Agilent	NovoSampler Pro
Shaking incubator	Infors	444-4230	or equivalent
Shaking water bath	Julabo	SW22	or equivalent
Sonicator	Sonics	Vibra cell
Wide-field microscopy	Leica	THUNDER Imager	or equivalent