Determinazione della durata della fase S mediante incorporazione di 5-etinil-2'-deossiuridina in Saccharomyces cerevisiae

Riepilogo

Descriviamo due protocolli complementari per determinare con precisione la durata della fase S in S. cerevisiae utilizzando EdU, un analogo della timidina, che viene incorporato in vivo e rilevato utilizzando la chimica Click mediante microscopia e citometria a flusso. Permette una facile caratterizzazione della durata della replicazione del DNA e dei difetti di replicazione trascurati nei mutanti.

Abstract

La replicazione del DNA eucariotico è un processo altamente regolato che assicura che il progetto genetico di una cellula sia correttamente duplicato prima della segregazione cromosomica. Poiché i difetti di sintesi del DNA sono alla base dei riarrangiamenti cromosomici, il monitoraggio della replicazione del DNA è diventato essenziale per comprendere le basi dell'instabilità del genoma. Saccharomyces cerevisiae è un modello classico per studiare la regolazione del ciclo cellulare, ma i parametri chiave di replicazione del DNA, come la frazione di cellule nella fase S o la durata della fase S, sono ancora difficili da determinare. Questo protocollo utilizza impulsi brevi e non tossici di 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU), un analogo della timidina, in cellule di lievito TK-hENT1 ingegnerizzate, seguite dalla sua rilevazione mediante reazione Click per consentire la visualizzazione e la quantificazione della replicazione del DNA con elevata risoluzione spaziale e temporale sia a livello di singola cellula che di popolazione mediante microscopia e citometria a flusso. Questo metodo può identificare difetti precedentemente trascurati nella fase S e nella progressione del ciclo cellulare dei mutanti del lievito, consentendo così la caratterizzazione di nuovi attori essenziali per garantire la stabilità del genoma.

Introduzione

La stabilità del genoma attraverso la divisione mitotica è assicurata dalla trasmissione di un insieme completo ed equo di cromosomi alle due progenie cellulari prodotte. Ciò si basa sul completamento accurato di una serie di eventi che si verificano in un dato momento in ogni fase del ciclo cellulare. In G 1, le origini della replica sono concesse in licenza dopo il reclutamento di diversi fattori di licenza, tra cui Cdc6₁. Nella fase S, la duplicazione dell'intero genoma viene avviata da più origini di replicazione attive ed eseguita da macchinari di replicazione che si riuniscono in fuochi microscopicamente visibili denominati fabbriche di replica². Nella fase M, i cromatidi fratelli duplicati sono attaccati e biorientati sul fuso mitotico per consentire la loro segregazione ai poli opposti della cellula mitotica³. La regolazione, il corretto completamento e la durata di ogni fase sono fondamentali per garantire la stabilità del genoma. In effetti, l'uscita prematura da una qualsiasi di queste fasi porta all'instabilità del genoma. Ad esempio, un G 1 più corto indotto dalla delezione dell'inibitore CDK del lievito in erba Sic1 o dalla sovraespressione delle cicline G₁ altererà la successiva fase S 4,5,6. Di conseguenza, queste deregolazioni, associate o meno allo stress di replicazione, provocano rotture cromosomiche, riarrangiamenti e cattiva segregazione ^4,5,6. Pertanto, il monitoraggio della durata della fase S e, più in generale, la durata delle altre fasi del ciclo cellulare può essere cruciale per identificare i difetti che si verificano in diversi mutanti e in diverse condizioni di stress.

Un metodo tradizionale per misurare la durata della fase del ciclo cellulare include una semplice citometria a flusso del contenuto di DNA (Figura 1A) e si basa su un algoritmo di adattamento (disponibile nella maggior parte dei software di citometria) utilizzato per separare la popolazione in frazioni di fase G₁, S e G₂ + M dai picchi 1C e 2C. Le frazioni vengono quindi moltiplicate per il tempo di raddoppio della popolazione⁷. Tuttavia, questo metodo fornisce solo valori stimati, richiede una distribuzione omogenea delle dimensioni delle celle all'interno di una data frazione e non è applicabile alle colture sincronizzate. Per studiare la durata della fase S nelle cellule di mammifero, sono stati sviluppati e ampiamente utilizzati diversi analoghi della timidina, tra cui EdU. Il loro assorbimento dal mezzo extracellulare e la fosforilazione da parte della timidina chinasi (di seguito denominata TK) li rendono disponibili per le DNA polimerasi per incorporarli nei siti di sintesi del DNA (replicazione, ricombinazione, riparazione). Per bypassare l'assenza del gene TK nelle cellule di Saccharomyces cerevisiae , sono stati ingegnerizzati ceppi di lievito per consentire l'espressione stabile e costitutiva del virus dell'herpes simplex TK⁸ e del trasportatore nucleosidico equilibrativo umano (hENT1)⁹. Una volta incorporato nel DNA, l'EdU viene rilevato tramite la reazione selettiva di Click, che accoppia chimicamente la sua porzione alchina ai fluorocromi¹⁰ modificati con azouro.

Questo articolo fornisce due protocolli completi ottimizzati per l'etichettatura a impulsi asincroni e sincroni di cellule ingegnerizzate TK-hENT1 con EdU al fine di visualizzare e misurare con precisione la durata e la dinamica della replicazione del DNA, nonché la durata delle altre fasi del ciclo cellulare, con un'elevata risoluzione spaziale e temporale sia a livello di singola cellula che di popolazione mediante microscopia e citometria a flusso.

Protocollo

1. Coltura cellulare di S. cerevisiae

NOTA: I ceppi di lievito utilizzati sono elencati nella Tabella 1

NOTA: la durata della fase S può essere monitorata in diversi modi. A seconda della domanda da affrontare, le cellule possono essere coltivate in modo asincrono o sincrono dopo l'arresto di G₁ .

1. Da cellule di S. cerevisiae in crescita asincrona
   NOTA: Questo metodo consente di determinare la percentuale di cellule nella fase S in una popolazione cellulare a crescita asincrona. Determinando il tempo di raddoppio, è possibile estrapolare la durata della fase S (e delle altre fasi).
   1. Inoculare cellule di S. cerevisiae in 10 mL di terreno sintetico completo (SC) a bassa concentrazione cellulare (5 × 10⁴ cellule/ml) per una coltura notturna a 30 °C con agitazione orbitale a 130 rpm.
      NOTA: La concentrazione viene misurata con un contatore di cellule. Per calcolare in modo efficiente i tempi di raddoppio, si raccomanda di inoculare la coltura da una coltura notturna che è ancora in fase esponenziale (cioè, idealmente al di sotto di 2 × 10⁷ cellule / ml). La crescita di cellule in mezzo ricco (YPD) non è raccomandata, poiché il rilevamento di EdU non è efficiente.
   2. Il giorno seguente, diluire le cellule in 20 ml di terreno SC fresco alla concentrazione finale di 5 × 10⁵ cellule/ml.
   3. Coltura delle cellule a 30 °C in bagnomaria agitante con agitazione orizzontale a 120 giri/min.
   4. Misurare la concentrazione cellulare ogni ora fino a raggiungere 1 × 10⁷ cellule / ml.
      NOTA: questo passaggio consente di effettuare una rappresentazione grafica dell'aumento della concentrazione cellulare nel tempo. La formula utilizzata per calcolare i tempi di raddoppio è spiegata nella legenda della Tabella 2.
   5. Procedere in parallelo al passaggio 2 per l'etichettatura EdU quando la concentrazione cellulare è di circa 2 × 10 6-5 × 10⁶ cellule / ml.
2. Da cellule G 1-sincronizzate di S. cerevisiae
   NOTA: Questo metodo consente di determinare quando inizia e finisce la fase S mediante citometria a flusso e/o analisi microscopiche.
   1. Inoculare le cellule di S. cerevisiae in 10 mL di terreno SC a bassa concentrazione cellulare (5 × 10⁴ cellule/ml) per una coltura notturna a 30 °C con agitazione orbitale a 130 rpm.
      NOTA: vedere le note dopo il punto 1.1.1.
   2. Il giorno seguente, diluire le cellule in 20 ml di terreno SC fresco ad una concentrazione finale di 2 × 10 6-3 × 10⁶ cellule/ml.
   3. Aggiungere 40 μL di 1 mg/mL di fattore α diluito in acqua.
   4. Coltura delle cellule a 30 °C con agitazione orbitale a 130 giri/min per 1 ora.
   5. Aggiungere nuovamente 40 μL di 1 mg/mL di fattore α diluito in acqua.
   6. Coltura delle cellule a 30 °C con agitazione orbitale a 130 giri/min per 1 ora.
   7. Visualizza le cellule al microscopio ottico per monitorare l'arresto G₁ . Procedere se più del 90% delle celle mostra uno shmoo e le altre sono cellule arrotondate e non gemmate.
      NOTA: A seconda dello sfondo utilizzato, si consiglia di sonicare le celle prima della visualizzazione shmoo. Per lo sfondo W303, sonicare 2x, per 2 s ogni volta, con un'ampiezza di 40-50.
   8. Centrifugare per 3 min a 1.500 × g. Scartare il surnatante con una pipetta a vuoto.
   9. Risospendere le cellule in 20 mL di mezzo SC.
   10. Ripetere i passaggi 1.2.8-1.2.9 una volta.
       NOTA: il fattore α viene lavato via con questi passaggi e le cellule vengono rilasciate nel ciclo cellulare. In alternativa, il fattore α può essere lavato via filtrando le cellule di lievito con un filtro nitrocellulosa da 1,2 μm utilizzando un imbuto posto su un pallone a braccio laterale collegato a una pompa per vuoto.
   11. Raccogliere 1 ml di celle 2 volte ogni 5 minuti e procedere al passaggio 2 per l'etichettatura EdU.
       NOTA: Etichettare a impulsi le celle di uno solo dei due tubi con EdU. Le cellule non marcate con impulso sono utilizzate per distinguere le cellule EdU-positive da quelle EdU-negative su un grafico bivariato di ioduro di propidio (PI)-EdU.
   12. Aggiungere 400 μL di 1 mg/mL di fattore α diluito in acqua 30 minuti dopo il rilascio.
       NOTA: Questa alta dose di fattore α è necessaria per arrestare le cellule nella fase G₁ del ciclo cellulare successivo e per impedire alle cellule di rientrare nella successiva fase S.

2. Etichettatura EdU

1. Trasferire 1 mL di coltura cellulare in una provetta microfuge da 2,0 mL contenente 1 μL di 10 mM EdU. Mescolare bene per inversione.
   NOTA: Per discriminare le cellule EdU-positive dalle cellule EdU-negative su un FACS bivariato PI-EdU, trasferire un altro 1 mL di coltura cellulare in una provetta microfughe da 2,0 mL contenente 1 μL di DMSO.
2. Incubare per 3-5 minuti a 30 °C agitando a bagnomaria.
   NOTA: Tre minuti sono sufficienti per il rilevamento EdU con un microscopio; Sono necessari 5 minuti per il rilevamento ottimale di EdU su un citometro a flusso.
3. Interrompere la reazione con l'aggiunta di 100 μL di etanolo al 100%.
   1. Interrompere la reazione con l'aggiunta di 100 μL di paraformaldeide al 20% se è richiesta la misurazione delle dimensioni delle cellule.
      NOTA: Se l'architettura nucleare delle cellule mitotiche deve essere mantenuta intatta per ulteriori analisi a seguito della reazione di Click, si consiglia di fissare le celle con paraformaldeide al 2% a temperatura ambiente (RT) piuttosto che mettere le cellule sul ghiaccio, poiché quest'ultima causa la depolimerizzazione dei microtubuli.
   2. Lasciare le celle per 20 minuti a RT sotto lieve agitazione su un bilanciere a velocità variabile a 20 inclinazioni / min per fissare le celle prima dell'aggiunta di 100 μL di etanolo al 100%.

3. Fissazione e permeabilizzazione cellulare

1. Pellettare le cellule per 2 minuti a 10.000 × g in un microfugo. Rimuovere il surnatante utilizzando una pipetta a vuoto.
2. Risospendere il pellet cellulare in 500 μL di etanolo al 70%. Mescolare bene vortexing.
3. Lasciare agire per ≥1 h a RT a 20 inclinazioni/min su un bilanciere a velocità variabile per permeabilizzare le celle.
   NOTA: Le cellule coltivate in mezzo SC non pellettano bene in quanto tendono ad aderire alle pareti dei microfuge. L'aggiunta di etanolo migliora la pellettizzazione e riduce la perdita di cellule. Le cellule possono essere conservate a 4 °C durante la notte o per periodi più lunghi a -20 °C.
4. Pellettare le cellule per 2 minuti a 10.000 × g in una microcentrifuga. Scartare il surnatante con una pipetta a vuoto.
5. Lavare le celle 2x con 500 μL di etanolo al 10% in PBS.
   NOTA: I lavaggi sono fondamentali per rimuovere l'EdU non incorporato dalle celle.

4. Reazione click-it

1. Per l'analisi citometrica
   1. Pellettare le cellule per 2 minuti a 10.000 × g in un microfugo. Scartare il surnatante con una pipetta a vuoto.
   2. Risospendere il pellet in 200 μL di PBS contenente 0,1 mg/mL di RNasi A e 0,2 mg/mL di proteinasi K.
   3. Incubare per 1-2 ore a 50 °C con agitazione occasionale (o per una notte a 37 °C).
   4. Pellettare le cellule per 2 minuti a 10.000 × g in una microcentrifuga. Scartare il surnatante con una pipetta a vuoto.
   5. Lavare le cellule con 500 μL di PBS.
   6. Pellettare le cellule per 2 minuti a 10.000 × g in un microfugo. Scartare il surnatante con una pipetta a vuoto.
   7. Risospendere il pellet cellulare in 200 μL di PBS + 1% di sieroalbumina bovina (BSA). Incubare per 30 minuti a RT.
      NOTA: tempi più lunghi non sono necessari e sono persino dannosi per l'efficienza delle reazioni di clic.
   8. Pellettare le cellule per 2 minuti a 10.000 × g in una microcentrifuga. Scartare il surnatante con una pipetta a vuoto.
   9. Risospendere il pellet in 300 μL di PBS + 1% BSA.
   10. Distribuire le celle tra due provette: 200 μL in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL per la reazione Click e 100 μL in un'altra provetta da microcentrifuga da 1,5 mL per la colorazione Sytox Green.
   11. Pellettare le cellule per 2 minuti a 10.000 × g in una microcentrifuga. Scartare il surnatante con una pipetta a vuoto.
   12. Per la colorazione Sytox Green
       NOTA: Si consiglia vivamente di prendere un'aliquota per la colorazione Sytox Green (senza clic) al fine di ottenere profili di riferimento del contenuto di DNA di alta qualità. Infatti, la reazione Click spegne fortemente la fluorescenza intercalante, compresa la fluorescenza Sytox Green e PI. Di conseguenza, la reazione Click può distorcere la lettura del contenuto di DNA.
       1. Risospendere il pellet cellulare in 100 μL di PBS.
       2. Trasferire 10-30 μL (a seconda della concentrazione cellulare) in un tubo citometrico a flusso contenente 300 μL di 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 e 0,5 μM Sytox Green.
       3. Sonicate 2x, per 2 s ogni volta, ad un'ampiezza di 40-50.
       4. Lasciare al buio fino all'elaborazione dei campioni su un citometro a flusso.
          NOTA: Le celle possono essere mantenute in questa fase a 4 °C per alcuni giorni.
   13. Per la reazione Click
       1. Preparare il tampone Azide Dye fresco mescolando i reagenti nel seguente ordine (quantità per un tubo): 36 μL di PBS, 2 μL di 0,2 M CuSO₄, 0,2 μL di 2 mM di Cy5 Azide e 2 μL di acido ascorbico 1 M.
          NOTA: È possibile preparare un master mix del tampone Azide Dye. I reagenti devono essere miscelati nello stesso ordine di quello sopra menzionato.
       2. Risospendere il pellet cellulare con 40 μL di miscela Azide Dye appena fatta. Incubare a RT al buio per 60 min.
       3. Pellettare le cellule per 2 minuti a 10.000 × g in una microcentrifuga. Scartare il surnatante con una pipetta a vuoto.
       4. Lavare le celle 3x con 300 μL di etanolo al 10% in PBS.
          NOTA: I lavaggi sono fondamentali per eliminare tutto l'azoturo solubile EdU-Cy5.
       5. Risospendere le cellule in 100 μL di 50 μg/mL PI in PBS. Lasciare agire per 10 minuti al buio.
       6. Trasferire 10-30 μL della sospensione cellulare (a seconda della concentrazione cellulare) in un tubo citometrico a flusso contenente 300 μL di 50 mM Tris-HCl, pH 7,5.
       7. Sonicate 2x, per 2 s ogni volta, ad un'ampiezza di 40-50.
       8. Lasciare al buio fino a quando non si elaborano i campioni su un citometro.
          NOTA: Le celle possono essere mantenute in questa fase a 4 °C per alcuni giorni.
   14. Leggere i campioni di Sytox Green utilizzando un laser blu di eccitazione a 488 nm e un filtro 530/30 BP. Vedere la Figura 1A per i risultati tipici. Leggere i campioni bivariati PI-EdU su un dot plot utilizzando un laser blu di eccitazione a 488 nm e un filtro 615/20 BP per il PI (asse x) e un laser rosso di eccitazione a 640 nm e un filtro 660/20 BP (asse y). Vedere la Figura 1B per i risultati tipici.
       NOTA: La Figura 1C rappresenta il tipico risultato FACS bivariato PI-EdU per le cellule EdU-negative. Permette la discriminazione delle cellule EdU-negative dalle cellule EdU-positive.
2. Per l'analisi al microscopio
   1. Pellettare le cellule per 2 minuti a 10.000 × g in una microcentrifuga. Scartare il surnatante con una pipetta a vuoto.
   2. Risospendere il pellet in 200 μL di PBS + 1% BSA. Incubare per 30 minuti a RT.
   3. Pellettare le cellule per 2 minuti a 10.000 × g in un microfugo. Scartare il surnatante con una pipetta a vuoto.
   4. Preparare il tampone Azide Dye fresco mescolando i reagenti nel seguente ordine (quantità per una provetta): 36 μL di PBS, 2 μL di 0,2 M CuSO₄, 0,2 μL di 2 mM di Dy-530 azide, 2 μL di acido ascorbico 1 M.
      NOTA: Una miscela master del tampone Azide Dye può essere preparata fresca mescolando i reagenti nell'ordine sopra indicato.
   5. Risospendere il pellet con 40 μL di tampone Azide Dye appena fatto. Incubare a RT al buio per 60 min.
   6. Pellettare le cellule per 2 minuti a 10.000 × g in un microfugo. Scartare il surnatante con una pipetta a vuoto.
   7. Lavare le celle 2x con 300 μL di etanolo al 10% in PBS.
      NOTA: I lavaggi sono fondamentali per eliminare tutto l'azide solubile Dy-530.
   8. Pellettare le cellule per 2 minuti a 10.000 × g in una microcentrifuga. Scartare il surnatante con una pipetta a vuoto.
   9. Risospendere le cellule in 100 μL di 0,5 μg/mL 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) in PBS. Lasciare agire per 30 minuti al buio a temperatura ambiente.
   10. Pellettare le celle per 2 minuti a 10.000 × g in una microcentrifuga. Scartare il surnatante con una pipetta a vuoto.
   11. Lavare con 300 μL di PBS per rimuovere l'eccesso di DAPI.
   12. Pellettare le celle per 2 minuti a 10.000 × g in un microfugo. Scartare il surnatante con una pipetta a vuoto.
   13. Risospendere il pellet con 10-50 μL di PBS a seconda della concentrazione cellulare.
   14. Sonicate 2x, per 2 s ogni volta, ad un'ampiezza di 40-50.
       NOTA: Le celle possono essere mantenute in questa fase a 4 °C per alcuni giorni.
   15. Pipettare 1,7 μL delle cellule su un vetrino da microscopio di vetro e coprire con un vetrino pulito.
   16. Osservare immediatamente al microscopio a fluorescenza con filtri DAPI e TexasRed o Cy3.

Risultati

Per determinare la durata della fase S e, più in generale, la durata di G 1 e G₂ + M (fase del protocollo 1.1), le cellule wild-type di S. cerevisiae W303 (WT, Tabella 1) sono state coltivate in modo asincrono in mezzo SC per 7 ore. Ogni ora, la concentrazione cellulare è stata monitorata per determinare il tempo di raddoppio (Figura 2B). In queste condizioni di crescita, il tempo di raddoppio calcolato è stato di 120 minuti ± 13 minuti a 2...

Discussione

Il lievito è un organismo modello primario per gli studi del ciclo cellulare, ma la caratterizzazione della sua fase S è stata a lungo ostacolata dalla sua incapacità di incorporare nucleosidi esogeni, come BrdU, che sono usati come traccianti della replicazione del DNA. Dotare il lievito di un'alta espressione di herpes simplex timidina chinasi (TK) e l'aggiunta di un trasportatore nucleosidico umano (hENT) ha ampiamente risolto questo problema^15,16. EdU è p...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
α-factor	Genescript	RP01002
Bovine Serum Albumin (BSA)	Euromedex	04-100--812-E
Copper sulfate	Sigma	C1297
DAPI	Sigma	D9542
Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide)	Interchim	FP-JV6320	Alternative to Alexa647-Azide
Dy-530 azide	Dyomics	530-10
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine)	Carbosynth	NE08701
Ethanol absolute	Carlo Erba reagents	P013A10D16	or equivalent
L- ascorbic acid	Sigma	A4544
Propidium iodide	Sigma	P4864
Proteinase K	Euromedex	EU0090
Rnase	SIGMA	R5000
Sytox Green	Invitrogen	S-7020
Equipment
Cell counter	OLS	CASY
Flow cytometer	Agilent	NovoSampler Pro
Shaking incubator	Infors	444-4230	or equivalent
Shaking water bath	Julabo	SW22	or equivalent
Sonicator	Sonics	Vibra cell
Wide-field microscopy	Leica	THUNDER Imager	or equivalent