사카로마이세스 세레비시아에 5-에티닐-2'-데옥시우리딘 혼입을 사용한 S상 지속 시간 측정

요약

우리는 생체 내에 통합되고 현미경 및 유세포 분석에 의한 Click 화학을 사용하여 검출되는 티미딘 유사체인 EdU를 사용하여 S. cerevisiae에서 S상 지속 시간을 정확하게 결정하기 위한 두 가지 보완 프로토콜을 설명합니다. 이를 통해 DNA 복제 기간을 쉽게 특성화하고 돌연변이의 복제 결함을 간과할 수 있습니다.

초록

진핵생물 DNA 복제는 염색체 분리 전에 세포의 유전적 청사진이 올바르게 복제되도록 하는 고도로 조절된 과정입니다. DNA 합성 결함이 염색체 재배열의 기초가 됨에 따라 DNA 복제 모니터링은 게놈 불안정성의 기초를 이해하는 데 필수적이 되었습니다. 사카로마이세스 세레비지애 는 세포 주기 조절을 연구하는 고전적인 모델이지만 S기의 세포 분율 또는 S기 기간과 같은 주요 DNA 복제 매개변수는 여전히 결정하기 어렵습니다. 이 프로토콜은 조작된 TK-hENT1 효모 세포에서 티미딘 유사체인 5-에티닐-2'-데옥시우리딘(EdU)의 짧고 독성이 없는 펄스를 사용한 다음 클릭 반응으로 검출하여 현미경 및 유세포분석을 통해 단일 세포 및 집단 수준 모두에서 높은 공간 및 시간 분해능으로 DNA 복제를 시각화하고 정량화할 수 있습니다. 이 방법은 효모 돌연변이체의 S 단계 및 세포주기 진행에서 이전에 간과 된 결함을 식별 할 수 있으므로 게놈 안정성을 보장하는 데 필수적인 새로운 플레이어의 특성화를 허용합니다.

서문

유사분열 분열을 통한 게놈 안정성은 완전하고 동일한 염색체 세트를 생산된 두 세포 자손으로 전달함으로써 보장됩니다. 이것은 세포주기의 각 단계에서 주어진 시간에 발생하는 일련의 사건의 정확한 완료에 의존합니다. G 1에서 복제 원본은 Cdc6¹을 포함한 여러 라이센스 요소를 모집할 때 라이센스가 부여됩니다. S 단계에서 전체 게놈 복제는 여러 활성 복제 기점에서 시작되고 복제 공장²이라는 현미경으로 보이는 초점에 모이는 복제 기계에 의해 수행됩니다. M 단계에서, 복제 된 자매 염색분체는 유사 분열 방추에 부착되고 이중 배향되어 유사 분열 세포³의 반대 극으로 분리 될 수 있습니다. 각 단계의 조절, 적절한 완료 및 기간은 게놈 안정성을 보장하는 데 중요합니다. 실제로, 이러한 단계에서 조기 종료는 게놈 불안정성을 초래합니다. 예를 들어, 출아 효모 CDK 억제제 Sic1의 결실 또는 G1 사이클린의 과발현에 의해 유도된 더 짧은_G1은 후속 S상 4,5,6을 변화시킬 것이다. 결과적으로, 복제 스트레스와 관련이 있든 없든 이러한 규제 완화는 염색체 파괴, 재 배열 및 잘못된 분리 ^4,5,6을 초래합니다. 따라서 S 단계의 지속 기간 및보다 광범위하게는 세포주기의 다른 단계의 지속 시간을 모니터링하는 것은 다른 돌연변이 체 및 다른 스트레스 조건에서 발생하는 결함을 식별하는 데 중요 할 수 있습니다.

세포 주기 단계 기간을 측정하는 전통적인 방법에는 간단한 DNA 함량 유세포분석(그림 1A)이 포함되며 집단을 1C 및 2C 피크에서 G₁, S 및 G₂ + M 상 분획으로 분리하는 데 사용되는 피팅 알고리즘(대부분의 세포분석 소프트웨어에서 사용 가능)에 의존합니다. 그런 다음 분수에 인구 배가 시간⁷을 곱합니다. 그러나 이 방법은 추정된 값만 제공하고 주어진 분획 내에서 균질한 세포 크기 분포가 필요하며 동기화된 배양에는 적용할 수 없습니다. 포유류 세포에서 S- 기 지속 시간을 연구하기 위해 EdU를 포함한 여러 티미 딘 유사체가 개발되어 널리 사용되었습니다. 세포 외 배지로부터의 흡수와 티미 딘 키나아제 (이하 TK라고 함)에 의한 인산화는 DNA 중합 효소가 DNA 합성 (복제, 재조합, 복구) 부위에 이들을 통합 할 수있게한다. 사카로마이세스 세레비지애 세포에서 TK 유전자의 부재를 우회하기 위해 효모 균주는 단순 포진 바이러스 TK⁸ 및 인간 평형 뉴클레오시드 수송체(hENT1)⁹의 안정적이고 구성적인 발현을 허용하도록 설계되었습니다. 일단 DNA에 통합되면, EdU는 선택적 클릭 반응을 통해 검출되며, 이는 알킨 부분을 아지드-개질된 플루오로크롬¹⁰에 화학적으로 결합시킨다.

이 백서는 현미경 및 유세포 분석을 통해 단일 세포 및 집단 수준 모두에서 높은 공간 및 시간 분해능으로 DNA 복제 기간 및 역학뿐만 아니라 세포 주기의 다른 단계의 지속 시간을 정확하게 시각화하고 측정하기 위해 EdU를 사용하여 비동기 및 동기식 TK-hENT1 엔지니어링 세포에 대한 두 가지 최적화된 포괄적인 프로토콜을 제공합니다.

프로토콜

1. S. 세레비시아에 세포 배양

참고: 사용된 효모 균주는 표 1에 나열되어 있습니다.

알림: S상 지속 시간은 다양한 방법으로 모니터링할 수 있습니다. 다루어야 할 질문에 따라, 세포는_G1 정지 후에 비동기적으로 또는 동기적으로 성장될 수 있다.

1. 비동기적으로 성장하는 S. 세레비시아에 세포에서
   참고: 이 방법을 사용하면 비동기적으로 증가하는 세포 집단에서 S 단계의 세포 백분율을 결정할 수 있습니다. 배가 시간을 결정함으로써 S 상 (및 다른 상)의 지속 시간을 외삽 할 수 있습니다.
   1. S. cerevisiae 세포를 낮은 세포 농도(5 × 10⁴ cells/mL)의 합성 완전(SC) 배지 10mL에 접종하여 130rpm에서 궤도 교반으로 30°C에서 밤새 배양합니다.
      알림: 농도는 세포 카운터로 측정됩니다. 배가 시간을 효율적으로 계산하려면 아직 지수 단계에 있는 야간 배양(즉, 이상적으로는 2 × 10⁷ cells/mL 미만)에서 배양을 접종하는 것이 좋습니다. 풍부한 배지(YPD)에서 세포를 성장시키는 것은 EdU 검출이 효율적이지 않기 때문에 권장되지 않습니다.
   2. 다음날, 세포를 5 × 10⁵ cells/mL의 최종 농도로 20 mL의 새로운 SC 배지에 희석한다.
   3. 세포를 120 rpm에서 수평 진탕과 함께 진탕수조에서 30°C에서 배양한다.
   4. 1 × 10⁷ cells/mL에 도달할 때까지 매시간 세포 농도를 측정합니다.
      참고: 이 단계에서는 시간 경과에 따른 세포 농도 증가를 그래픽으로 표현할 수 있습니다. 배가 시간을 계산하는 데 사용되는 공식은 표 2의 범례에 설명되어 있습니다.
   5. 세포 농도가 약 2 × 10 6-5 × 10⁶ cells/mL인 경우 EdU 라벨링을 위한 2단계와 병행하여 진행합니다.
2. G₁ 동기화 된 S. 세레 비시 애 세포에서
   참고: 이 방법을 사용하면 유세포 분석 및/또는 현미경 분석을 통해 S상이 시작되고 끝나는 시기를 결정할 수 있습니다.
   1. S. cerevisiae 세포를 낮은 세포 농도(5 × 10⁴ cells/mL)의 SC 배지 10mL에 접종하여 130rpm에서 궤도 교반과 함께 30°C에서 밤새 배양합니다.
      참고: 1.1.1단계 이후의 참고를 참조하십시오.
   2. 다음날, 세포를 2 × 10^6-3 × 10⁶ cells/mL의 최종 농도로 20mL의 새로운 SC 배지에 희석한다.
   3. 물에 희석한 1mg/mL α인자 40μL를 추가합니다.
   4. 세포를 30°C에서 1시간 동안 130rpm으로 오비탈 교반하면서 배양한다.
   5. 물에 희석한 1mg/mL α인자 40μL를 다시 추가합니다.
   6. 세포를 30°C에서 1시간 동안 130rpm으로 오비탈 교반하면서 배양한다.
   7. G1 정지를 모니터링하기 위해 광학 현미경으로 세포를 시각화합니다. 세포의 90 % 이상이 shmoo를 표시하고 나머지는 둥글고 싹이 트지 않은 세포 인 경우 진행하십시오.
      참고: 사용된 배경에 따라 shmoo 시각화 전에 셀을 초음파 처리하는 것이 좋습니다. W303 배경의 경우 2-2의 진폭에서 매번 40초 동안 50x를 초음파 처리합니다.
   8. 1,500 × g에서 3 분 동안 원심 분리합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.
   9. 세포를 20mL의 SC 배지에 재현탁시킨다.
   10. 1.2.8-1.2.9단계를 한 번 반복합니다.
       참고: α 인자는 이러한 단계로 씻겨 나가고 세포는 세포 주기에서 방출됩니다. 대안적으로, α-인자는 진공 펌프에 연결된 측-암 플라스크 상의 깔때기 세트를 사용하여 1.2μm 니트로셀룰로스 필터로 효모 세포를 여과함으로써 세척될 수 있다.
   11. 5분마다 2x 세포 1mL를 수집하고 EdU 라벨링을 위해 2단계로 진행합니다.
       알림: 두 튜브 중 하나의 셀에만 EdU를 사용하여 펄스 라벨을 붙입니다. 펄스 표지되지 않은 세포는 이변량 프로피듐 요오드화물(PI)-EdU 그래프에서 EdU 양성 세포와 EdU 음성 세포를 구별하는 데 사용됩니다.
   12. 방출 후 30분 후에 물에 희석한 1mg/mL α인자 400μL를 추가합니다.
       참고: 이 고용량의 α인자는 다음 세포 주기의 G₁ 단계에서 세포를 정지시키고 세포가 후속 S 단계로 다시 들어가는 것을 방지하는 데 필요합니다.

2. EdU 라벨링

1. 1mL의 세포 배양물을 1μL의 10mM EdU가 들어 있는 2.0mL 미세원심분리 튜브로 옮깁니다. 반전으로 잘 섞는다.
   참고: PI-EdU 이변량 FACS에서 EdU 양성 세포와 EdU 양성 세포를 구별하려면 1μL의 DMSO가 포함된 2.0mL 미세원심 분리 튜브에 또 다른 1mL의 세포 배양물을 옮깁니다.
2. 진탕 수조에서 교반 하에 30°C에서 3-5분 동안 배양합니다.
   참고: 현미경으로 EdU 검출에는 3분이면 충분합니다. 유세포분석기에서 최적의 EdU 검출을 위해서는 5분이 필요합니다.
3. 100 μL의 100% 에탄올을 첨가하여 반응을 중지시킨다.
   1. 세포 크기 측정이 필요한 경우 100 μL의 20% 파라포름알데히드를 첨가하여 반응을 중지합니다.
      참고: 유사분열 세포의 핵 구조를 클릭 반응 후 추가 분석을 위해 그대로 유지해야 하는 경우, 세포를 얼음 위에 두는 것보다 실온(RT)에서 2% 파라포름알데히드로 세포를 고정하는 것이 좋습니다.
   2. 100 % 에탄올 100 μL를 첨가하기 전에 세포를 고정하기 위해 가변 속도 로커에서 20 틸트 / 분으로 가벼운 교반하에 RT에서 20 분 동안 세포를 그대로 두십시오.

3. 세포 고정 및 투과화

1. 미세원심분리기에서 10,000× g 에서 2분 동안 세포를 펠릿화합니다. 진공 피펫을 사용하여 상청액을 제거한다.
2. 세포 펠릿을 500μL의 70% 에탄올에 재현탁시킨다. 소용돌이로 잘 섞는다.
3. 세포를 투과시키기 위해 가변 속도 로커에서 RT에서 ≥1 틸트 / 분으로 20 시간 동안 그대로 두십시오.
   참고: SC 배지에서 성장한 세포는 미세 원심 분리 벽에 달라붙는 경향이 있으므로 펠릿이 잘 되지 않습니다. 에탄올을 첨가하면 펠릿이 개선되고 세포 손실이 감소합니다. 세포는 4°C에서 밤새 또는 -20°C에서 더 긴 기간 동안 저장될 수 있다.
4. 마이크로 원심분리기에서 10,000× g 에서 2분 동안 세포를 펠릿화합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.
5. 세포를 PBS 중 500 μL의 10% 에탄올로 2x 세척한다.
   알림: 세척은 세포에서 통합되지 않은 EdU를 제거하는 데 중요합니다.

4. 클릭 잇 반응

1. 세포분석용
   1. 미세원심분리기에서 10,000× g 에서 2분 동안 세포를 펠릿화합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.
   2. 0.1 mg/mL RNase A 및 0.2 mg/mL 프로테이나제 K를 함유하는 200 μL의 PBS에 펠릿을 재현탁시킨다.
   3. 가끔 흔들면서 50 ° C에서 1-2 시간 동안 배양합니다 (또는 37 ° C에서 밤새).
   4. 마이크로 원심분리기에서 10,000× g 에서 2분 동안 세포를 펠릿화합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.
   5. 세포를 500 μL의 PBS로 세척한다.
   6. 미세원심분리기에서 10,000× g 에서 2분 동안 세포를 펠릿화합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.
   7. 세포 펠릿을 200μL의 PBS + 1% 소 혈청 알부민(BSA)에 재현탁합니다. RT에서 30 분 동안 배양하십시오.
      참고: 더 긴 시간은 필요하지 않으며 클릭 반응의 효율성에도 해롭습니다.
   8. 마이크로 원심분리기에서 10,000× g 에서 2분 동안 세포를 펠릿화합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.
   9. 펠릿을 300μL의 PBS + 1% BSA에 재현탁시킨다.
   10. 클릭 반응을 위해 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 200μL, Sytox Green 염색을 위해 다른 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 100μL의 두 튜브 사이에 세포를 분배합니다.
   11. 마이크로 원심분리기에서 10,000× g 에서 2분 동안 세포를 펠릿화합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.
   12. 사이톡스 그린 염색용
       참고: 고품질 DNA 함량 참조 프로필을 얻기 위해 Sytox Green 염색(클릭 제외)에 대한 부분 표본을 복용하는 것이 좋습니다. 실제로, 클릭 반응은 사이톡스 그린 및 PI 형광을 포함한 인터칼란트 형광을 강력하게 소멸시킵니다. 결과적으로 클릭 반응은 DNA 함량의 판독을 왜곡 할 수 있습니다.
       1. 세포 펠릿을 100μL의 PBS에 재현탁시킨다.
       2. 10-30 μL (세포 농도에 따라 다름)를 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 및 0.5 μM Sytox Green의 300 μL를 포함하는 유세포 분석기 튜브로 옮깁니다.
       3. 2-2의 진폭에서 매번 2 초 동안 40x를 초음파 처리합니다.
       4. 유세포 분석기에서 샘플을 처리 할 때까지 어둠 속에 두십시오.
          참고: 셀은 이 단계에서 며칠 동안 4°C로 보관할 수 있습니다.
   13. 클릭 반응의 경우
       1. 시약을 다음 순서(튜브 1개당 수량)로 혼합하여 새로운 아지드 염료 완충액을 준비합니다: 36μL의 PBS, 2μL의 0.2M_CuSO4, 0.2μL의 2mM Cy5 아지드, 2μL의 1M 아스코르브산.
          참고: Azide Dye 버퍼의 마스터 믹스를 제조할 수 있습니다. 시약은 위에서 언급한 것과 동일한 순서로 혼합되어야 합니다.
       2. 새로 만든 Azide 염료 혼합물 40μL로 세포 펠릿을 재현탁합니다. 어둠 속에서 RT에서 60 분 동안 배양하십시오.
       3. 마이크로 원심 분리기에서 10,000×g에서 2분 동안 세포를 펠릿화합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.
       4. 세포를 PBS 중 300 μL의 10% 에탄올로 3x 세척한다.
          알림: 세척은 모든 용해성 EdU-Cy5 아지드를 제거하는 데 중요합니다.
       5. 세포를 PBS에서 50μg/mL PI의 100μL에 재현탁시킨다. 어둠 속에서 10 분 동안 그대로 두십시오.
       6. 10-30 μL의 세포 현탁액 (세포 농도에 따라 다름)을 50 mM Tris-HCl, pH 7.5의 300 μL를 함유하는 유세포 분석기 튜브로 옮깁니다.
       7. 2-2의 진폭에서 매번 2 초 동안 40x를 초음파 처리합니다.
       8. 세포 분석기에서 샘플을 처리 할 때까지 어둠 속에 두십시오.
          참고: 셀은 이 단계에서 며칠 동안 4°C로 보관할 수 있습니다.
   14. 488nm의 여기 청색 레이저와 530/30BP 필터를 사용하여 Sytox Green 샘플을 판독합니다. 일반적인 결과는 그림 1A 를 참조하십시오. 488nm의 여기 청색 레이저와 PI(x축)의 경우 615/20BP 필터, 640nm의 여기 적색 레이저 및 660/20BP 필터(y축)를 사용하여 점도표에서 이변량 PI-EdU 샘플을 읽습니다. 일반적인 결과는 그림 1B 를 참조하십시오.
       참고: 그림 1C 는 EdU 음성 셀에 대한 일반적인 PI-EdU 이변량 FACS 결과를 나타냅니다. EdU 음성 세포와 EdU 양성 세포를 구별 할 수 있습니다.
2. 현미경 분석용
   1. 마이크로 원심분리기에서 10,000× g 에서 2분 동안 세포를 펠릿화합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.
   2. 펠릿을 200 μL의 PBS + 1% BSA에 재현탁시킨다. RT에서 30 분 동안 배양하십시오.
   3. 미세원심분리기에서 10,000× g 에서 2분 동안 세포를 펠릿화합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.
   4. 36 μL의 PBS, 2 μL의 0.2 M CuSO4, 0.2 mM Dy-530 아지드의 0.2 μL, 1 M 아스코르브산의 2 μL의 순서로 시약을 혼합하여 새로운 Azide Dye 완충액을 준비합니다(한 튜브의 수량).
      참고: Azide Dye 완충액의 마스터 혼합물은 앞서 언급한 순서대로 시약을 혼합하여 신선하게 준비할 수 있습니다.
   5. 새로 만든 Azide 염료 버퍼 40μL로 펠릿을 재현탁합니다. 어둠 속에서 RT에서 60 분 동안 배양하십시오.
   6. 세포를 미세분리 기에서 10,000×g에서 2분 동안 펠릿화합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.
   7. 세포를 PBS 중 300 μL의 10% 에탄올로 2x 세척한다.
      알림: 세척은 모든 가용성 Dy-530 azide를 제거하는 데 중요합니다.
   8. 마이크로 원심분리기에서 10,000 × g 에서 2분 동안 세포를 펠릿화합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.
   9. 세포를 PBS에 0.5μg/mL 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)의 100μL에 재현탁시킨다. 실온에서 어둠 속에서 30 분 동안 그대로 두십시오.
   10. 마이크로 원심 분리기에서 10,000 ×g에서 2 분 동안 세포를 펠릿합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.
   11. 300μL의 PBS로 세척하여 과도한 DAPI를 제거합니다.
   12. 세포를 미세원심분리 기에서 10,000×g에서 2분 동안 펠릿화합니다. 상청액을 진공 피펫으로 폐기하십시오.
   13. 세포 농도에 따라 10-50 μL의 PBS로 펠릿을 재현탁합니다.
   14. 2-2의 진폭에서 매번 2 초 동안 40x를 초음파 처리합니다.
       참고: 셀은 이 단계에서 며칠 동안 4°C로 보관할 수 있습니다.
   15. 1.7 μL의 세포를 유리 현미경 슬라이드 상에 피펫팅하고 깨끗한 커버슬립으로 덮는다.
   16. DAPI 및 TexasRed 또는 Cy3 필터를 사용하여 형광 현미경으로 즉시 관찰하십시오.

결과

S기 지속기간 및, 보다 광범위하게는_G1 및_G2+M의 지속기간을 결정하기 위해(프로토콜 단계 1.1), S. 세레비지애 W303 야생형 세포(WT, 표 1)를 SC 배지에서 7시간 동안 비동기적으로 성장시켰다. 매 시간마다, 세포 농도를 모니터링하여 배가 시간을 결정하였다(도 2B). 이들 성장 조건에서, 계산된 배가 시간은 25°C에서 120분 ± 13분이었다(표 2<...

토론

효모는 세포주기 연구의 주요 모델 유기체이지만 DNA 복제의 추적자로 사용되는 BrdU와 같은 외인성 뉴 클레오 사이드를 통합 할 수 없기 때문에 S 단계의 특성화는 오랫동안 방해 받아 왔습니다. 효모에 단순 포진 티미 딘 키나아제 (TK)의 높은 발현을 장착하고 인간 뉴 클레오 시드 수송 체 (hENT)를 첨가하면이 문제가 크게 해결되었습니다^15,16. EdU는 항 BrdU...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
α-factor	Genescript	RP01002
Bovine Serum Albumin (BSA)	Euromedex	04-100--812-E
Copper sulfate	Sigma	C1297
DAPI	Sigma	D9542
Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide)	Interchim	FP-JV6320	Alternative to Alexa647-Azide
Dy-530 azide	Dyomics	530-10
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine)	Carbosynth	NE08701
Ethanol absolute	Carlo Erba reagents	P013A10D16	or equivalent
L- ascorbic acid	Sigma	A4544
Propidium iodide	Sigma	P4864
Proteinase K	Euromedex	EU0090
Rnase	SIGMA	R5000
Sytox Green	Invitrogen	S-7020
Equipment
Cell counter	OLS	CASY
Flow cytometer	Agilent	NovoSampler Pro
Shaking incubator	Infors	444-4230	or equivalent
Shaking water bath	Julabo	SW22	or equivalent
Sonicator	Sonics	Vibra cell
Wide-field microscopy	Leica	THUNDER Imager	or equivalent