Determinación de la duración de la fase S mediante la incorporación de 5-etinil-2'-desoxiuridina en Saccharomyces cerevisiae

Resumen

Describimos dos protocolos complementarios para determinar con precisión la duración de la fase S en S. cerevisiae utilizando EdU, un análogo de la timidina, que se incorpora in vivo y se detecta mediante química Click por microscopía y citometría de flujo. Permite la fácil caracterización de la duración de la replicación del ADN y los defectos de replicación pasados por alto en los mutantes.

Resumen

La replicación del ADN eucariota es un proceso altamente regulado que garantiza que el plano genético de una célula se duplique correctamente antes de la segregación cromosómica. A medida que los defectos de síntesis de ADN subyacen a los reordenamientos cromosómicos, el monitoreo de la replicación del ADN se ha vuelto esencial para comprender la base de la inestabilidad del genoma. Saccharomyces cerevisiae es un modelo clásico para estudiar la regulación del ciclo celular, pero los parámetros clave de replicación del ADN, como la fracción de células en la fase S o la duración de la fase S, aún son difíciles de determinar. Este protocolo utiliza pulsos cortos y no tóxicos de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU), un análogo de la timidina, en células de levadura TK-hENT1 diseñadas, seguidas de su detección por reacción Click para permitir la visualización y cuantificación de la replicación del ADN con alta resolución espacial y temporal tanto a nivel de célula única como de población mediante microscopía y citometría de flujo. Este método puede identificar defectos previamente pasados por alto en la fase S y la progresión del ciclo celular de los mutantes de levadura, lo que permite la caracterización de nuevos actores esenciales para garantizar la estabilidad del genoma.

Introducción

La estabilidad del genoma a través de la división mitótica está garantizada por la transmisión de un conjunto completo e igual de cromosomas a las dos progenies celulares producidas. Esto se basa en la finalización precisa de una serie de eventos que ocurren en un momento dado en cada fase del ciclo celular. En G 1, los orígenes de replicación se licencian tras la contratación de varios factores de licencia, incluido Cdc6¹. En la fase S, la duplicación del genoma completo se inicia a partir de múltiples orígenes de replicación activa y se realiza mediante maquinarias de replicación que se reúnen en focos microscópicamente visibles llamados fábricas de replicación². En la fase M, las cromátidas hermanas duplicadas se unen y se biorientan en el huso mitótico para permitir su segregación a los polos opuestos de la célula mitótica³. La regulación, la finalización adecuada y la duración de cada fase son clave para garantizar la estabilidad del genoma. De hecho, la salida prematura de cualquiera de estas fases conduce a la inestabilidad del genoma. Por ejemplo, un G 1 más corto inducido por la deleción del inhibidor de CDK de levadura en ciernes Sic1 o por la sobreexpresión de ciclinas G₁ alterará la fase S posterior 4,5,6. En consecuencia, estas desregulaciones, asociadas o no al estrés de replicación, resultan en roturas cromosómicas, reordenamientos y mala segregación ^4,5,6. Por lo tanto, monitorear la duración de la fase S y, más ampliamente, la duración de las otras fases del ciclo celular puede ser crucial para identificar los defectos que ocurren en diferentes mutantes y en diferentes condiciones estresantes.

Un método tradicional para medir la duración de la fase del ciclo celular incluye citometría de flujo de contenido de ADN simple (Figura 1A) y se basa en un algoritmo de ajuste (disponible en la mayoría de los programas de citometría utilizados) utilizado para separar la población en fracciones de fase G₁, S y G₂ + M de los picos 1C y 2C. Las fracciones se multiplican por la población duplicando el tiempo⁷. Sin embargo, este método solo da valores estimados, requiere una distribución homogénea del tamaño de celda dentro de una fracción dada y no es aplicable a cultivos sincronizados. Para estudiar la duración de la fase S en células de mamíferos, se han desarrollado y utilizado ampliamente varios análogos de timidina, incluido EdU. Su absorción del medio extracelular y su fosforilación por la timidina quinasa (en lo sucesivo, TK) las ponen a disposición de las ADN polimerasas para incorporarlas en los sitios de síntesis de ADN (replicación, recombinación, reparación). Para evitar la ausencia del gen TK en las células de Saccharomyces cerevisiae , se han diseñado cepas de levadura para permitir la expresión estable y constitutiva del virus del herpes simple TK⁸ y el transportador de nucleósidos de equilibrio humano (hENT1)⁹. Una vez incorporado al ADN, EdU se detecta a través de la reacción selectiva de clic, que acopla químicamente su fracción alquina a fluorocromos modificados con azida¹⁰.

Este documento proporciona dos protocolos integrales optimizados para las células diseñadas con TK-hENT1 asíncronas y sincrónicas con etiquetas de pulso con EdU para visualizar y medir con precisión la duración y la dinámica de la replicación del ADN, así como la duración de las otras fases del ciclo celular, con alta resolución espacial y temporal tanto a nivel de célula única como de población mediante microscopía y citometría de flujo.

Protocolo

1. Cultivo celular de S. cerevisiae

NOTA: Las cepas de levadura utilizadas se enumeran en la Tabla 1

NOTA: La duración de la fase S se puede monitorear de diferentes maneras. Dependiendo de la pregunta a abordar, las células se pueden cultivar de forma asíncrona o sincrónica después de la detención de G₁ .

1. De células de S. cerevisiae de crecimiento asincrónico
   NOTA: Este método permite determinar el porcentaje de células en la fase S en una población celular de crecimiento asincrónico. Al determinar el tiempo de duplicación, se puede extrapolar la duración de la fase S (y las otras fases).
   1. Inocular células de S. cerevisiae en 10 ml de medio sintético completo (SC) a una concentración celular baja (5 × 10⁴ células/ml) para un cultivo nocturno a 30 °C con agitación orbitaria a 130 rpm.
      NOTA: La concentración se mide con un contador de celdas. Para calcular eficientemente los tiempos de duplicación, se recomienda inocular el cultivo de un cultivo nocturno que todavía está en la fase exponencial (es decir, idealmente por debajo de 2 × 10⁷ células/ml). No se recomienda cultivar células en medio rico (YPD), ya que la detección de EdU no es eficiente.
   2. Al día siguiente, diluir las células en 20 ml de medio SC fresco a la concentración final de 5 × 10⁵ células/ml.
   3. Cultivar las células a 30 °C en un baño maría agitante con agitación horizontal a 120 rpm.
   4. Mida la concentración celular cada hora hasta que alcance 1 × 10⁷ células/ml.
      NOTA: Este paso permite hacer una representación gráfica del aumento de la concentración celular con el tiempo. La fórmula utilizada para calcular los tiempos de duplicación se explica en la leyenda de la Tabla 2.
   5. Proceda en paralelo al paso 2 para el etiquetado de EdU cuando la concentración celular sea de aproximadamente 2 × 10 6-5 × 10⁶ células/ml.
2. De células de S. cerevisiae sincronizadas con G₁
   NOTA: Este método permite determinar cuándo comienza y termina la fase S mediante citometría de flujo y/o análisis de microscopía.
   1. Inocular células de S. cerevisiae en 10 ml de medio SC a una concentración celular baja (5 × 10⁴ células/ml) para un cultivo nocturno a 30 °C con agitación orbitaria a 130 rpm.
      NOTA: Consulte las notas después del paso 1.1.1.
   2. Al día siguiente, diluir las células en 20 ml de medio SC fresco a una concentración final de 2 × 10 6-3 × 10⁶ células/ml.
   3. Añadir 40 μL de 1 mg/ml α factor diluido en agua.
   4. Cultivar las células a 30 °C con agitación orbital a 130 rpm durante 1 h.
   5. Añadir de nuevo 40 μL de 1 mg/ml de factor α diluido en agua.
   6. Cultivar las células a 30 °C con agitación orbital a 130 rpm durante 1 h.
   7. Visualice las células bajo un microscopio de luz para monitorear el arresto de G₁ . Proceda si más del 90% de las celdas muestran un shmoo y las otras son células redondeadas y sin brotes.
      NOTA: Dependiendo del fondo utilizado, se recomienda sonicar las celdas antes de la visualización shmoo. Para el fondo W303, sonicate 2x, durante 2 s cada vez, a una amplitud de 40-50.
   8. Centrifugar durante 3 min a 1.500 × g. Deseche el sobrenadante con una pipeta de vacío.
   9. Resuspender las células en 20 mL de medio SC.
   10. Repita los pasos 1.2.8-1.2.9 una vez.
       NOTA: El factor α se elimina con estos pasos y las células se liberan en el ciclo celular. Alternativamente, el factor α puede eliminarse filtrando las células de levadura con un filtro de nitrocelulosa de 1,2 μm utilizando un embudo colocado en un matraz de brazo lateral conectado a una bomba de vacío.
   11. Recoja 1 ml de células 2 veces cada 5 minutos y continúe con el paso 2 para el etiquetado de EdU.
       NOTA: Marque con pulsos las células de solo uno de los dos tubos con EdU. Las células no marcadas con pulsos se utilizan para distinguir las células EdU positivas de las células EdU negativas en un gráfico bivariado de yoduro de propidio (PI)-EdU.
   12. Añadir 400 μL de factor α de 1 mg/ml diluido en agua 30 min después de la liberación.
       NOTA: Esta dosis alta de factor α es necesaria para detener las células en la fase G₁ del siguiente ciclo celular y para evitar que las células vuelvan a entrar en la fase S posterior.

2. Etiquetado EdU

1. Transfiera 1 ml de cultivo celular a un tubo de microfuga de 2,0 ml que contenga 1 μL de 10 mM de EdU. Mezclar bien por inversión.
   NOTA: Para discriminar las células EdU positivas de las células EdU-negativas en un FACS bivariado PI-EdU, transfiera otro 1 ml de cultivo celular a un tubo de microfuga de 2,0 ml que contenga 1 μL de DMSO.
2. Incubar durante 3-5 min a 30 °C bajo agitación en un baño maría agitante.
   NOTA: Tres minutos son suficientes para la detección de EdU con un microscopio; Se requieren 5 min para la detección óptima de EdU en un citómetro de flujo.
3. Detenga la reacción con la adición de 100 μL de etanol al 100%.
   1. Detener la reacción con la adición de 100 μL de paraformaldehído al 20% si se requiere la medición del tamaño celular.
      NOTA: Si la arquitectura nuclear de las células mitóticas debe mantenerse intacta para análisis posteriores a la reacción Click, recomendamos fijar las células con paraformaldehído al 2% a temperatura ambiente (RT) en lugar de poner las células en hielo, ya que este último causa la despolimerización de los microtúbulos.
   2. Deje las celdas durante 20 minutos a RT bajo agitación suave en un balancín de velocidad variable a 20 inclinaciones / min para fijar las células antes de la adición de 100 μL de etanol al 100%.

3. Fijación celular y permeabilización

1. Granular las células durante 2 min a 10.000 × g en una microfuga. Retire el sobrenadante con una pipeta de vacío.
2. Resuspender el pellet celular en 500 μL de etanol al 70%. Mezclar bien por vórtice.
3. Dejar actuar durante ≥1 h a RT a 20 inclinaciones/min en un balancín de velocidad variable para permeabilizar las células.
   NOTA: Las células cultivadas en medio SC no se granulan bien, ya que tienden a adherirse a las paredes de la microfuga. La adición de etanol mejora la granulación y reduce la pérdida celular. Las células pueden almacenarse a 4 °C durante la noche o durante períodos más largos a -20 °C.
4. Granular las células durante 2 min a 10.000 × g en una microcentrífuga. Deseche el sobrenadante con una pipeta de vacío.
5. Lave las células 2 veces con 500 μL de etanol al 10% en PBS.
   NOTA: Los lavados son cruciales para eliminar la EdU no incorporada de las células.

4. Reacción de click-it

1. Para análisis citométrico
   1. Granular las células durante 2 min a 10.000 × g en una microfuga. Deseche el sobrenadante con una pipeta de vacío.
   2. Resuspender el pellet en 200 μL de PBS que contiene 0,1 mg/ml de RNasa A y 0,2 mg/ml de proteinasa K.
   3. Incubar durante 1-2 h a 50 °C con agitación ocasional (o durante la noche a 37 °C).
   4. Granular las células durante 2 min a 10.000 × g en una microcentrífuga. Deseche el sobrenadante con una pipeta de vacío.
   5. Lave las células con 500 μL de PBS.
   6. Granular las células durante 2 min a 10.000 × g en una microfuga. Deseche el sobrenadante con una pipeta de vacío.
   7. Resuspender el pellet celular en 200 μL de PBS + 1% de albúmina sérica bovina (BSA). Incubar durante 30 min en RT.
      NOTA: Los tiempos más largos no son necesarios e incluso son perjudiciales para la eficiencia de las reacciones de clic.
   8. Granular las células durante 2 min a 10.000 × g en una microcentrífuga. Deseche el sobrenadante con una pipeta de vacío.
   9. Resuspender el pellet en 300 μL de PBS + 1% BSA.
   10. Distribuir las células entre dos tubos: 200 μL en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para la reacción Click y 100 μL en otro tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para la tinción Sytox Green.
   11. Granular las células durante 2 min a 10.000 × g en una microcentrífuga. Deseche el sobrenadante con una pipeta de vacío.
   12. Para la tinción Sytox Green
       NOTA: Recomendamos encarecidamente tomar una alícuota para la tinción Sytox Green (sin Click) para obtener perfiles de referencia de contenido de ADN de alta calidad. De hecho, la reacción Click apaga fuertemente la fluorescencia intercalante, incluida la fluorescencia Sytox Green y PI. En consecuencia, la reacción Click puede distorsionar la lectura del contenido de ADN.
       1. Resuspender el pellet celular en 100 μL de PBS.
       2. Transfiera 10-30 μL (dependiendo de la concentración celular) a un tubo citómetro de flujo que contenga 300 μL de 50 mM de Tris-HCl, pH 7.5 y 0.5 μM Sytox Green.
       3. Sonicate 2x, durante 2 s cada vez, a una amplitud de 40-50.
       4. Dejar en la oscuridad hasta procesar las muestras en un citómetro de flujo.
          NOTA: Las células pueden mantenerse en esta etapa a 4 °C durante unos días.
   13. Para la reacción Click
       1. Prepare tampón de colorante azídico fresco mezclando los reactivos en el siguiente orden (cantidad para un tubo): 36 μL de PBS, 2 μL de 0,2 M CuSO₄, 0,2 μL de 2 mM de azida Cy5 y 2 μL de ácido ascórbico 1 M.
          NOTA: Es posible preparar una mezcla maestra del tampón Azide Dye. Los reactivos deben mezclarse en el mismo orden que el mencionado anteriormente.
       2. Resuspender el pellet celular con 40 μL de mezcla de colorante azida recién hecha. Incubar a RT en la oscuridad durante 60 min.
       3. Granular las células durante 2 min a 10.000 × g en una microcentrífuga. Deseche el sobrenadante con una pipeta de vacío.
       4. Lave las células 3 veces con 300 μL de etanol al 10% en PBS.
          NOTA: Los lavados son cruciales para eliminar toda la azida soluble de EdU-Cy5.
       5. Resuspender las células en 100 μL de 50 μg/mL PI en PBS. Dejar actuar durante 10 minutos en la oscuridad.
       6. Transfiera 10-30 μL de la suspensión celular (dependiendo de la concentración celular) a un tubo citómetro de flujo que contenga 300 μL de Tris-HCl de 50 mM, pH 7.5.
       7. Sonicate 2x, durante 2 s cada vez, a una amplitud de 40-50.
       8. Dejar en la oscuridad hasta procesar las muestras en un citómetro.
          NOTA: Las células pueden mantenerse en esta etapa a 4 °C durante unos días.
   14. Lea las muestras de Sytox Green usando un láser azul de excitación a 488 nm y un filtro 530/30 BP. Consulte la figura 1A para ver los resultados típicos. Lea las muestras bivariadas de PI-EdU en un diagrama de puntos utilizando un láser azul de excitación a 488 nm y un filtro 615/20 BP para el PI (eje x) y un láser rojo de excitación a 640 nm y un filtro 660/20 BP (eje y). Consulte la figura 1B para ver los resultados típicos.
       NOTA: La Figura 1C representa el resultado típico de PI-EdU bivariado FACS para células EdU-negativas. Permite la discriminación de las células EdU-negativas de las células EdU-positivas.
2. Para análisis de microscopía
   1. Granular las células durante 2 min a 10.000 × g en una microcentrífuga. Deseche el sobrenadante con una pipeta de vacío.
   2. Resuspender el pellet en 200 μL de PBS + 1% BSA. Incubar durante 30 min en RT.
   3. Granular las células durante 2 min a 10.000 × g en una microfuga. Deseche el sobrenadante con una pipeta de vacío.
   4. Preparar tampón de colorante azídico fresco mezclando los reactivos en el siguiente orden (cantidad para un tubo): 36 μL de PBS, 2 μL de 0,2 M CuSO₄, 0,2 μL de 2 mM de azida Dy-530, 2 μL de ácido ascórbico 1 M.
      NOTA: Se puede preparar una mezcla maestra del tampón Azide Dye fresco mezclando los reactivos en el orden antes mencionado.
   5. Resuspender el pellet con 40 μL de tampón Azide Dye recién hecho. Incubar a RT en la oscuridad durante 60 min.
   6. Granular las células durante 2 min a 10.000 × g en una microfuga. Deseche el sobrenadante con una pipeta de vacío.
   7. Lave las células 2 veces con 300 μL de etanol al 10% en PBS.
      NOTA: Los lavados son cruciales para eliminar toda la azida soluble Dy-530.
   8. Granular las células durante 2 min a 10.000 × g en una microcentrífuga. Deseche el sobrenadante con una pipeta de vacío.
   9. Resuspender las células en 100 μL de 0,5 μg/mL 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) en PBS. Dejar actuar durante 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.
   10. Granular las células durante 2 min a 10.000 × g en una microcentrífuga. Deseche el sobrenadante con una pipeta de vacío.
   11. Lavar con 300 μL de PBS para eliminar el exceso de DAPI.
   12. Granular las células durante 2 minutos a 10.000 × g en una microfuga. Deseche el sobrenadante con una pipeta de vacío.
   13. Resuspender el pellet con 10-50 μL de PBS dependiendo de la concentración celular.
   14. Sonicate 2x, durante 2 s cada vez, a una amplitud de 40-50.
       NOTA: Las células pueden mantenerse en esta etapa a 4 °C durante unos días.
   15. Pipetear 1,7 μL de las células en un portaobjetos de microscopio de vidrio y cubrir con un cubreobjetos limpio.
   16. Observe inmediatamente bajo un microscopio de fluorescencia con los filtros DAPI y TexasRed o Cy3.

Resultados

Para determinar la duración de la fase S y, más ampliamente, la duración de G 1 y G₂ + M (paso del protocolo 1.1), las células de tipo salvaje W303 de S. cerevisiae (WT, Tabla 1) se cultivaron asíncronamente en medio SC durante 7 h. Cada hora, la concentración celular fue monitoreada para determinar el tiempo de duplicación (Figura 2B). En estas condiciones de crecimiento, el tiempo de duplicación calculado fue de 120 min ± 13 min a 25...

Discusión

La levadura es un organismo modelo principal para estudios del ciclo celular, sin embargo, la caracterización de su fase S se ha visto obstaculizada durante mucho tiempo por su incapacidad para incorporar nucleósidos exógenos, como BrdU, que se utilizan como trazadores de la replicación del ADN. El equipamiento de la levadura con una alta expresión de herpes simple timidina quinasa (TK) y la adición de un transportador de nucleósidos humanos (hENT) ha resuelto en gran medida este problema^15,16

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
α-factor	Genescript	RP01002
Bovine Serum Albumin (BSA)	Euromedex	04-100--812-E
Copper sulfate	Sigma	C1297
DAPI	Sigma	D9542
Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide)	Interchim	FP-JV6320	Alternative to Alexa647-Azide
Dy-530 azide	Dyomics	530-10
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine)	Carbosynth	NE08701
Ethanol absolute	Carlo Erba reagents	P013A10D16	or equivalent
L- ascorbic acid	Sigma	A4544
Propidium iodide	Sigma	P4864
Proteinase K	Euromedex	EU0090
Rnase	SIGMA	R5000
Sytox Green	Invitrogen	S-7020
Equipment
Cell counter	OLS	CASY
Flow cytometer	Agilent	NovoSampler Pro
Shaking incubator	Infors	444-4230	or equivalent
Shaking water bath	Julabo	SW22	or equivalent
Sonicator	Sonics	Vibra cell
Wide-field microscopy	Leica	THUNDER Imager	or equivalent