Определение длительности S-фазы с использованием включения 5-этинил-2'-дезоксиуридина в Saccharomyces cerevisiae

Резюме

Мы описываем два дополнительных протокола для точного определения длительности S-фазы в S. cerevisiae с использованием EdU, аналога тимидина, который включен in vivo и обнаружен с помощью химии Click с помощью микроскопии и проточной цитометрии. Это позволяет легко характеризовать продолжительность репликации ДНК и упущенные дефекты репликации у мутантов.

Аннотация

Репликация эукариотической ДНК является строго регулируемым процессом, который гарантирует, что генетический чертеж клетки правильно дублируется до сегрегации хромосом. Поскольку дефекты синтеза ДНК лежат в основе хромосомных перестроек, мониторинг репликации ДНК стал необходимым для понимания основы нестабильности генома. Saccharomyces cerevisiae является классической моделью для изучения регуляции клеточного цикла, но ключевые параметры репликации ДНК, такие как доля клеток в S-фазе или длительность S-фазы, все еще трудно определить. Этот протокол использует короткие и нетоксичные импульсы 5-этинил-2'-дезоксиуридина (EdU), аналога тимидина, в инженерных дрожжевых клетках TK-hENT1 с последующим его обнаружением реакцией Клика, чтобы обеспечить визуализацию и количественную оценку репликации ДНК с высоким пространственным и временным разрешением как на одноклеточном, так и на популяционном уровнях с помощью микроскопии и проточной цитометрии. Этот метод может идентифицировать ранее упущенные дефекты в S-фазе и прогрессии клеточного цикла дрожжевых мутантов, тем самым позволяя характеризовать новых игроков, необходимых для обеспечения стабильности генома.

Введение

Стабильность генома посредством митотического деления обеспечивается передачей полного и равного набора хромосом двум продуцируемым клеточным потомкам. Это зависит от точного завершения серии событий, происходящих в данное время в каждой фазе клеточного цикла. В G₁ источники репликации лицензируются после набора нескольких лицензионных факторов, включая Cdc6¹. В S-фазе дупликация всего генома инициируется из нескольких активных источников репликации и выполняется механизмами репликации, которые собираются в микроскопически видимые очаги, называемые фабриками репликации². В М-фазе дублированные сестринские хром....

протокол

1. Клеточная культура S. cerevisiae

ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые штаммы дрожжей перечислены в таблице 1

ПРИМЕЧАНИЕ: Длительность S-фазы можно контролировать различными способами. В зависимости от вопроса, который необходимо решить, клетки могут быть выращены асинхронно или синхронно после остановки_G1 .

1. Из асинхронно растущих клеток S. cerevisiae
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод позволяет определить процент клеток в S-фазе в асинхронно растущей клеточной популяции. Определяя время удвоения, продолжительность S-фазы (и других фаз) может быть экстраполиро....

Результаты

Для определения длительности S-фазы и, в более широком смысле, длительности_G1 и_G2 +M (этап протокола 1.1) клетки S. cerevisiae W303 дикого типа (WT, таблица 1) выращивали асинхронно в среде SC в течение 7 ч. Каждый час концентрацию клеток контролировали для определения времени уд.......

Обсуждение

Дрожжи являются основным модельным организмом для исследований клеточного цикла, но характеристика их S-фазы уже давно затруднена их неспособностью включать экзогенные нуклеозиды, такие как BrdU, которые используются в качестве индикаторов репликации ДНК. Оснащение дрожжей высокой экс.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
α-factor	Genescript	RP01002
Bovine Serum Albumin (BSA)	Euromedex	04-100--812-E
Copper sulfate	Sigma	C1297
DAPI	Sigma	D9542
Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide)	Interchim	FP-JV6320	Alternative to Alexa647-Azide
Dy-530 azide	Dyomics	530-10
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine)	Carbosynth	NE08701
Ethanol absolute	Carlo Erba reagents	P013A10D16	or equivalent
L- ascorbic acid	Sigma	A4544
Propidium iodide	Sigma	P4864
Proteinase K	Euromedex	EU0090
Rnase	SIGMA	R5000
Sytox Green	Invitrogen	S-7020
Equipment
Cell counter	OLS	CASY
Flow cytometer	Agilent	NovoSampler Pro
Shaking incubator	Infors	444-4230	or equivalent
Shaking water bath	Julabo	SW22	or equivalent
Sonicator	Sonics	Vibra cell
Wide-field microscopy	Leica	THUNDER Imager	or equivalent