流式细胞术 检测 接种乙型脑炎疫苗的儿童多功能T细胞

摘要

本协议结合了 离体 刺激和流式细胞术，以分析日本脑炎病毒（JEV）疫苗接种的儿童中外周血单核细胞（PBMC）中的多功能T细胞（T_PF）谱。对JEV特异性TPF的检测方法和流式细胞术配色方案进行了测试，为类似研究提供参考。

摘要

T细胞介导的免疫在控制黄病毒感染方面起着重要作用，无论是在接种疫苗后还是在自然感染后。T细胞的"质量"需要通过功能来评估，而更高的功能与更强大的免疫保护有关。在单细胞水平上可以同时产生两种或两种以上细胞因子或趋化因子的T细胞称为多功能T细胞（T_PFs），其通过多种分子机制介导免疫应答，表达脱颗粒标志物（CD107a）并分泌干扰素（IFN）-γ、肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-2或巨噬细胞炎症蛋白（MIP）-1α。越来越多的证据表明，T_PFs与维持长期免疫记忆和保护密切相关，其增加的比例是保护性免疫的重要标志物，对有效控制病毒感染和再激活具有重要意义。该评估不仅适用于特异性免疫反应，也适用于交叉反应性免疫反应的评估。本文以乙型脑炎病毒（JEV）为例，对接种乙型脑炎接种患儿外周血单核细胞产生的JEV特异性T_PFS的检测方法和流式细胞术配色方案进行了检测，为类似研究提供参考。

引言

日本脑炎病毒（JEV）是一种重要的蚊媒病毒，属于黄病毒科¹中的黄病毒属。由于乙型脑炎（JE）造成的巨大疾病负担，许多亚太国家长期以来一直面临巨大的公共卫生挑战，但随着各类疫苗接种的增加，这种情况已得到显著改善²。自然感染或疫苗接种引起的适应性保护性免疫应答有助于预防和抗病毒调节。体液免疫和细胞介导免疫被归类为适应性免疫，前者的诱导一直被视为疫苗设计中的关键策略，^{尽管过去3}的理解相对有限。然而，T细胞介导的免疫在限制黄病毒传播和病毒清除方面的作用越来越受到关注和广泛研究⁴。此外，T细胞免疫不仅在JEV特异性抗病毒反应中不可或缺，而且在交叉保护异源黄病毒继发感染方面也起着重要作用，这已在^{先前的研究中}得到证实5。据推测，这种效应可能会绕过感染中潜在的抗体介导的增强效应⁵。值得注意的是，这种交叉反应性T细胞免疫很重要，特别是在没有针对黄病毒的疫苗和抗病毒药物的情况下。尽管已经进行了许多研究来确定T细胞在JEV感染中相对于CD4⁺和CD8 ⁺ T细胞的贡献6，^7，但分泌细胞因子的各自谱系及其功能多样化仍未确定^，这意味着辅助和杀伤性^T细胞的确切功能的阐明受到阻碍。

它们的抗病毒防御规模决定了T细胞反应的质量。CD4⁺或CD8 ⁺ T细胞可以相容地赋予两种或多种功能，包括细胞因子分泌和脱颗粒，在单^{细胞水平8}的特异性刺激下被表征为多功能T细胞（T_PFs）。产生单个或多种细胞因子的CD4 ⁺ T细胞可能具有各种作用和免疫记忆。例如，IL-2+ IFN-γ⁺ CD4+ T细胞比IL-2⁺ CD4⁺ T细胞^更容易形成长期有效的保护性反应9，这可以作为评估疫苗接种效果的重要参数。IL-2⁺ IFN-γ+ CD4 + T细胞的频率在长期不进展的获得性免疫缺陷综合征（AIDS）患者中增加，而由于IL-2对T细胞增殖的促进作用，艾滋病进展患者中CD4 ⁺ T细胞更倾向于单独产生IFN-γ¹⁰。此外，IL-2⁺ IFN-γ⁺ TNF-α ⁺的一个子集被证明可以在体内长期存活并协同促进杀伤功能¹¹。虽然CD8 + T细胞更有可能表现出细胞毒性活性，但一些CD4 ⁺ T细胞还具有细胞毒性活性，作为间接检测到表面CD107a分子的表达¹²。此外，某些T细胞亚群表达趋化因子MIP-1α，其通常由单核细胞分泌以参与T细胞介导的中性粒细胞募集¹³。同样，CD8⁺ T_PFs也可用于表征上述标志物的多功能性。研究表明，初免-加强策略可以有效诱导长时间的T_PF保护作用¹³，从而增强疫苗接种引起的保护作用。检查免疫系统的一个核心特征是记忆T细胞能够促进比幼稚T细胞更强，更快，更有效地应对继发性病毒攻击。效应记忆T细胞（T_EM）和中央记忆T细胞（T_CM）是重要的T细胞亚群，通常通过CD27 / CD45RO或CCR7 / CD45RA¹⁴的复合表达进行分化。T_CM（CD27+ CD45RO+ 或 CCR7+ CD45RA-）倾向于定位在继发性淋巴组织中，而 T_EM（CD27- CD45RO⁺ 或 CCR7- CD45RA^-）定位于淋巴和外周组织^15，16。T_EM提供即时但不是持续的防御，而T_CM通过在次级淋巴器官中增殖并产生新的效应物来维持反应¹⁷。因此，鉴于记忆细胞可以介导对病毒的特定和有效的回忆反应，关于这一多功能子集的贡献出现了问题。

随着流式细胞术技术的发展，同时检测10多个簇、表型和分化抗原的标志物已变得普遍，有利于更丰富地注释单个T细胞的功能免疫特征，以减少对T细胞表型的误解和理解困难。这项研究使用 离体 刺激和流式细胞术来分析接种JEV疫苗的儿童外周血单核细胞（PBMC）中的T_PF 谱。应用这种方法，将扩大对疫苗接种诱导的短期和长期JEV特异性甚至交叉反应性T细胞免疫的理解。

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研究方案

本研究已获得首都医科大学附属北京儿童医院伦理委员会的伦理批准（批准文号:2020-k-85）。志愿者来自首都医科大学附属北京儿童医院。外周静脉血样本取自表面上健康的儿童（2岁），这些儿童以前接种过初免和加强接种乙脑SA14-14-2减毒活疫苗不到半年（接种乙脑疫苗的儿童，n = 5）和未接种疫苗的儿童（6个月大，n = 5）。放弃了人类受试者的知情同意，因为本研究仅使用了经过临床测试后的残留样本。为了保护志愿者的隐私，所有数据都经过完全匿名化和去识别化处理。

1. 从外周静脉血中分离PBMC

1. 通过标准静脉穿刺技术在EDTA-K₂抗凝管中收集JE疫苗接种和未接种疫苗儿童的外周静脉血样本（2mL）（见材料表¹⁸）。
2. 加入 2 mL 磷酸盐缓冲盐水 （1x PBS） 以稀释外周血。
   注意:该过程将尽快处理，以保持最大的生存能力。
3. 将 4 mL 密度梯度培养基（参见 材料表）加入 15 mL 离心管中，然后将稀释的血液缓慢转移到分离介质的上层。
   注意:请勿将血液与分离介质混合或破坏两种液体形成的接触表面;否则，将无法达到分离效果。
4. 在室温下以800× g 离心20分钟。观察离心后的重要层数。
5. 将PBMC（中间层）转移到另一个15 mL离心管中，并用含有10%胎牛血清的10 mL RPMI-1640培养基洗涤PBMC（FBS，参见 材料表）。
6. 在室温下以800× g 离心10分钟，并小心地用移液管弃去上清液。
7. 用含有10%FBS的1 mL RPMI-1640培养基重悬PBMC，并用台盼蓝自动计数器计数细胞（参见 材料表）。

2. 失活的JEV颗粒刺激PBMC诱导细胞因子表达

1. 分别在接种JE和未接种的样本中设置JEV刺激组和对照组的两个亚组。
2. 用含有 10% FBS 的 RPMI-1640 培养基将 PBMC 的数量调整为 2 × 10 个 6 个细胞/mL，并将 PBMC 接种在 24 孔板中（每孔 2 × 10^{个 6} 个细胞/1 mL 培养基）;每组接种三个孔。
3. 在单克隆抗体CD28（1μg/ mL，1:1，000）和CD49d（1μg/ mL），高尔基塞（1μg/ mL，1:1，000）和莫能菌素（1μg/ mL，1:1，000）和莫能菌素（1μg/ mL，1:1，000）的存在下，用浓缩的灭活JEV颗粒⁵ （2×10^5PFU ）刺激JEV刺激组的PBMC16小时。对于表面染色，请使用BV605-抗CD107a（1μg/mL，1:1，000）（见 材料表）。
   注意:如前所述，JEV 被紫外线照射灭活¹⁹.
4. 在单克隆抗体CD28（1μg/ mL，1:1，000）和CD49d（1μg/ mL，1:1，000），GolgiPlug（1μg/ mL，1:1，000）和莫能菌素（1μg/ mL，1:1，000）的存在下，在37°C下刺激对照组的PBMC16小时。用 BV605-抗 CD107a（1 μg/mL，1:1，000）染色表面。

3. 离体 细胞内染色

1. 在1.5mL微量离心管中收集每组的细胞悬液，在室温下以500× g 离心5分钟，并用移液管除去上清液。
2. 将细胞重悬于1 mL的1x PBS中，向细胞悬液中加入可固定的活力染料（1μL / mL，1:1，000，参见 材料表），并在室温下在黑暗中孵育10分钟。以500× g （室温）离心5分钟并除去上清液。
3. 将细胞重悬于 1 mL 的 1x PBS 中。以500× g （室温）离心5分钟。小心丢弃上清液。
4. 进行细胞表面标志物染色。
   1. 将细胞重悬于100μL的1x PBS中，并向每个试管中的细胞悬液中加入2μL每种表面标志物抗体（BV650-抗CD3，BUV395-抗CD4，BV421-抗CD8，BUV737-抗CD27和BV480-抗CD45RO，稀释因子:1:50，参见 材料表）。
      注意:彩色荧光抗体染色方案如 表1所示。
   2. 将试管（步骤3.4.1）在室温下孵育30分钟，并保护它们免受光照。以500× g 离心5分钟，除去上清液。
      注意:BUV737-抗CD27和BV480-抗CD45RO的抗体可以用BUV737-抗CCR7和BV480-抗CD45RA代替，作为记忆T细胞的注释。
5. 将细胞重悬于 1 mL 的 1x PBS 中。在室温下以500× g 离心5分钟。小心丢弃上清液。
6. 进行固定和破膜。
   1. 用500μL破膜固定溶液（参见 材料表）重悬细胞，并在室温下在黑暗中固定细胞20分钟。以500× g 离心5分钟，除去上清液。
7. 将细胞重悬于 1 mL 的 1x PBS 中。在室温下以500× g 离心5分钟，并小心除去上清液。
8. 进行细胞内细胞因子染色。
   1. 将细胞重悬于100μL 1x PBS中，并向每个管中的细胞悬液中加入2μL每种细胞因子抗体（FITC-抗-IFN-γ，PE-抗TNF-α，BV785-抗IL-2和APC-抗MIP-1α，稀释因子:1:50，参见 材料表）。
      注意:荧光团偶联抗体的体积和信息如 表1所示。
   2. 将试管（步骤3.8.1）在室温下在黑暗中孵育30分钟。以500 ×g 离心5分钟，除去上清液。
9. 将细胞重悬于 1 mL 的 1x PBS 中。在室温下以500× g 离心5分钟，并小心除去上清液。加入 500 μL 的 1x PBS 以重悬细胞。

4. 流式细胞术设置

1. 按照步骤1中描述的程序单独分离PBMC样品作为对照样品。如下所述，在 1.5 mL 微量离心管（100 μL/管）中将细胞悬液分成 12 等份。
   1. 设置未染色、APC-Cy7 活/死可固定染色、BV650-抗 CD3 单染色、BUV395-抗 CD4 单染色、BV421-抗 CD8 单染色、BUV737-抗 CD27 单染色、BV480-抗 CD45RO 染色、BV605-抗 CD107a、FITC 抗 IFN-γ 染色、PE-抗 TNF-α 单染色、BV785-抗 IL-2 单染色和 APC-抗 MIP-1α 单染色样品。
2. 如步骤3所述添加细胞表面标志物和细胞内细胞因子染色。对于每个单染色样品，仅添加染色步骤中的一种荧光团。加入 500 μL 的 1x PBS 以重悬细胞并以低速涡旋。
3. 使用未染色的样品，调整正向散射 （FSC）、侧向散射 （SSC） 和不同的荧光染料电压。
   注意:对于本研究，设置了以下电压。FSC: 440 V， SSC: 233 V， BV650: 575 V， APC-Cy7: 449 V， BUV395: 500 V， BV421: 402 V， BUV737: 585 V， BV480: 444 V， BV605: 457 V， FITC: 475 V， PE: 469 V， APC: 623 V， 和 BV785: 725 V.
4. 使用单染色样品，调整流式细胞术补偿以消除不同荧光团之间的污染信号。
   注:补偿参数如 表2所示。

5. 门控策略和数据分析

注意:在本研究中，对于此分析，分别定义了CD8 +或CD4 + T细胞的CD27 + CD45RO+或CCR7+ CD45RA-的中枢记忆T细胞（T_CM）和CD8+或CD4 ⁺ T细胞的效应记忆T细胞（T_EM）作为CD27-CD45RO⁺或CCR7-CD45RA^-分别定义¹⁶。

1. 通过FSC区域（FSC-A）/SSC-AREA（SSC-A）点图绘制多边形门，以选择完整的淋巴细胞群，同时排除碎片（图1A）。
2. 通过 FSC-A/FSC-WIDTH （FSC-W） 点图绘制一个矩形门以选择单个单元格（图 1B）。
3. 通过活/死/ SSC-A点图绘制一个矩形门以选择活细胞（图1C）。
4. 通过CD3 / SSC-A点图绘制一个矩形门以识别CD3 ⁺ T细胞（图1D）。
5. 通过CD4 / CD8点图绘制四门以识别CD4 ⁺ 或CD8 ⁺ T细胞（图1E）。
6. 通过CD45RO / CD27点图绘制四门，将CD4 ⁺或CD8 + T细胞细分为T_CM（CD27 + CD45RO +）和T_EM（CD27- CD45RO ⁺）（图1F-I）。
7. 从^{CD8 +}或CD4 ⁺ T细胞的T_CM或T_EM绘制CD107a，IFN-γ，TNF-α，IL-2和MIP-1α的门，分别确定不同反应模式的频率。
8. 将样品依次加载到细胞仪上。使用止动门²⁰ 获取1×10⁶ 个淋巴细胞。
   注意:单个用户可以收集超过 1 个× 10 个^{6 个} 单元格。这个数字是所花费的时间和收集足够细胞以提供有意义的结果之间的折衷。

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结果

图1显示了用于从接种JE疫苗的儿童的代表性JEV刺激组中分离CD8 ⁺或CD4 ⁺ T细胞的T_CM或T_EM的门控策略。FSC-A/SSC-A 点图用于识别淋巴细胞，FSC-A/FSC-W 点图用于识别单个细胞。在活/死/SSC-A点图上选择活细胞。CD3 / SSC-A点图用于识别CD3 ⁺ T细胞。CD4 / CD8点图分别用于识别CD3 + CD4 ⁺和CD3 + CD8 ⁺ T细胞。CD8⁺或CD4...

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讨论

该协议代表了一种可行的基于流式细胞术的检测方法，用于接种JEV疫苗SA14-14-2的儿童的PBMC中的T_PF 谱。本研究使用接种疫苗和未接种疫苗的儿童的静脉血PBMC作为研究材料。随着JEV抗原对PBMC的刺激，那些扩增的抗原特异性T_PFs可以通过多色流式细胞术抗体染色进行表征。与传统的酶联免疫点测定方法相比，流式细胞术的突出优势是尽可能多样化地呈现单细胞水平PBMC的功能特征，减少...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-human CD28	Biolegend	302934	Antibody
anti-human CD49d	Biolegend	304339	Antibody
APC anti-human MIP-1α	BD	551533	Fluorescent antibody
Automated cell counter	BIO RAD	TC20	Cell count
BD FACSymphony A5	BD	A5	flow Cytometry
BUV395 anti-human CD4	BD	563550	Fluorescent antibody
BUV737 anti-human CCR7	BD	741786	Fluorescent antibody
BUV737 anti-human CD27	BD	612829	Fluorescent antibody
BV421 anti-human CD8	Biolegend	344748	Fluorescent antibody
BV480 anti-human CD45RA	BD	566114	Fluorescent antibody
BV480 anti-human CD45RO	BD	566143	Fluorescent antibody
BV605 anti-human CD107a	Biolegend	328634	Fluorescent antibody
BV650 anti-human CD3	BD	563999	Fluorescent antibody
BV785 anti-human IL-2	Biolegend	500348	Fluorescent antibody
Centrifuge Tube	BD Falcon	BD-35209715	15 mL centrifuge tube
Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit	BD	554714	Cell fixation and permeabilization
Density gradient medium	Dakewe	DKW-KLSH-0100	Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium
FITC anti-human IFN-γ	Biolegend	502506	Fluorescent antibody
Gibco Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16000-044	Fetal Bovine Serum
Gibco RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	22400089	cell culture medium
High-speed centrifuge	Sigma	3K15	Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube
High-speed centrifuge	Eppendorf	5424R	Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube
Microcentrifuge tubes	Axygen	MCT-150-C	1.5 mL microcentrifuge tube
PE anti-human TNF-α	Biolegend	502909	Fluorescent antibody
Phosphate Buffered Saline (PBS)	BI	02-024-1ACS	PBS
Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug)	BD	555029	blocks intracellular protein transport processes
Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)	BD	554724	blocks intracellular protein transport processes
Round-bottom test tube	BD Falcon	352235	5 mL test tube
Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit	Beyotime	C0011	Trypan Blue Staining
Zombie NIR Fixable Viability Dye	Biolegend	423106	Dead cell stain