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  • Discusión
  • Divulgaciones
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  • Materiales
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  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

El presente protocolo combina la estimulación ex vivo y la citometría de flujo para analizar los perfiles de células T polifuncionales (T PF) en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en niños vacunados contra el virus de la encefalitis japonesa (JEV). El método de detección y el esquema de color de citometría de flujo de los TPF específicos de JEV se probaron para proporcionar una referencia para estudios similares.

Resumen

La inmunidad mediada por células T juega un papel importante en el control de la infección por flavivirus, ya sea después de la vacunación o después de una infección natural. La "calidad" de una célula T debe evaluarse por función, y una mayor función se asocia con una protección inmune más potente. Las células T que pueden producir simultáneamente dos o más citoquinas o quimiocinas a nivel de una sola célula se denominan células T polifuncionales (TPFs), que median las respuestas inmunes a través de una variedad de mecanismos moleculares para expresar marcadores de desgranulación (CD107a) y secretar interferón (IFN)-γ, factor de necrosis tumoral (TNF)-α, interleucina (IL)-2 o proteína inflamatoria de macrófagos (MIP)-1α. Cada vez hay más pruebas de que losPFT están estrechamente relacionados con el mantenimiento de la memoria y la protección inmunitaria a largo plazo y que su mayor proporción es un marcador importante de inmunidad protectora y es importante en el control efectivo de la infección viral y la reactivación. Esta evaluación se aplica no solo a respuestas inmunes específicas, sino también a la evaluación de respuestas inmunes de reacción cruzada. Aquí, tomando el virus de la encefalitis japonesa (JEV) como ejemplo, el método de detección y el esquema de color de citometría de flujo de TPFespecíficos de JEV producidos por células mononucleares de sangre periférica de niños vacunados contra la encefalitis japonesa se probaron para proporcionar una referencia para estudios similares.

Introducción

El virus de la encefalitis japonesa (JEV) es un importante virus transmitido por mosquitos perteneciente al género Flavivirus dentro de la familia Flaviviridae1. Muchos países de Asia y el Pacífico han enfrentado durante mucho tiempo enormes desafíos de salud pública debido a la enorme carga de enfermedad causada por la encefalitis japonesa (EJ), pero esto ha mejorado dramáticamente con la creciente disponibilidad de varios tipos de vacunas2. Las respuestas inmunes protectoras adaptativas evocadas por la infección natural o la vacunación contribuyen a la prevención y la regulación antiviral. La inmunidad humoral y la inmunidad mediada por células se clasifican como inmunidad adaptativa, y la inducción de la primera siempre se ha considerado como una estrategia clave en el diseño de vacunas, aunque con una comprensión relativamente limitada en los últimos3. Sin embargo, el papel de la inmunidad mediada por células T en la limitación de la diseminación del flavivirus y la eliminación del virus se ha centrado cada vez más y se ha estudiado ampliamente4. Además, la inmunidad de las células T no solo es indispensable en las respuestas antivirales específicas del JEV, sino que también desempeña un papel destacado en la protección cruzada contra la infección secundaria con flavivirus heterólogos, lo que se ha demostrado en estudios previos5. Se especula que este efecto puede pasar por alto los posibles efectos de mejora mediados por anticuerpos en la infección5. Cabe destacar que tal inmunidad de células T de reacción cruzada es importante, especialmente en ausencia de vacunas y medicamentos antivirales contra los flavivirus. Aunque se han realizado muchos estudios para determinar la contribución de las células T en la infección por JEV con respecto a las células T CD4+ y CD8+ 6,7, los respectivos linajes secretores de citoquinas y su diversificación funcional permanecen indeterminados, lo que significa que la elucidación de las funciones exactas de las células T auxiliares y asesinas se ve obstaculizada.

La escala de sus defensas antivirales determina la calidad de las respuestas de las células T. Las células T CD4+ o CD8+ que pueden conferir de manera compatible dos o más funciones, incluida la secreción de citoquinas y la desgranulación, se caracterizan como células Tpolifuncionales (T PF) tras la estimulación específica a nivel de una sola célula8. Las células T CD4+ que producen citoquinas únicas o múltiples pueden tener varios efectos y memorias inmunitarias. Por ejemplo, las células T IL-2+ IFN-γ+ CD4+ tienen más probabilidades de formar una respuesta protectora efectiva a largo plazoque las células T IL-2+ CD4+ 9, que pueden usarse como un parámetro importante para evaluar el efecto de la vacunación. La frecuencia de IL-2+ IFN-γ+ linfocitos T CD4+ aumenta en pacientes con no progresión a largo plazo del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), mientras que los linfocitos T CD4+ en pacientes con progresión del SIDA son más propensos a producir IFN-γ solo debido al efecto promotor de IL-2 sobre la proliferación de linfocitos T10. Además, se demostró que un subconjunto de IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+ sobrevive a largo plazo in vivo y promueve sinérgicamente la función de matar11. Aunque las células T CD8+ tienen más probabilidades de exhibir actividad citotóxica, algunas células T CD4+ también están equipadas con actividad citotóxica como expresión detectada indirectamente de moléculas CD107a de superficie12. Además, ciertos subconjuntos de células T expresan la quimiocina MIP-1α, que a menudo es secretada por monocitos para participar en el reclutamiento de neutrófilos mediado por células T13. Del mismo modo, CD8 + TPFs también se puede utilizar para caracterizar la versatilidad de los marcadores anteriores. Los estudios han demostrado que la estrategia prime-boost puede inducir eficazmente un período prolongado de efectos protectores de TPF 13, lo que puede mejorar la protección provocada por la vacunación. Una característica central en el examen del sistema inmune es la capacidad de las células T de memoria para facilitar respuestas más fuertes, más rápidas y más efectivas a los desafíos virales secundarios que las células T ingenuas. Las células T de memoria efectora (TEM) y las células T de memoria central (TCM) son subconjuntos importantes de células T que a menudo se diferencian por la expresión compuesta de CD27/CD45RO o CCR7/CD45RA14. LaCM T (CD27+ CD45RO+ o CCR7+ CD45RA-) tiende a localizarse en tejidos linfoides secundarios, mientras que laEM T (CD27- CD45RO+ o CCR7- CD45RA-) se localiza en tejidos linfoides y periféricos 15,16. LaEM T proporciona una defensa inmediata pero no sostenida, mientras quela CM T sostiene la respuesta proliferando en los órganos linfoides secundarios y generando nuevos efectores17. Por lo tanto, dado que las células de memoria pueden mediar respuestas de recuerdo específicas y eficientes a los virus, surgen preguntas sobre la contribución de este subconjunto de polifunciones.

Con el desarrollo de la tecnología de citometría de flujo, se ha vuelto común detectar simultáneamente marcadores de más de 10 grupos, fenotipos y antígenos de diferenciación, lo que es beneficioso para anotar más abundantemente las características inmunológicas funcionales en las células T individuales para reducir la mala interpretación y las dificultades en la comprensión de los fenotipos de células T. Este estudio utilizó estimulación ex vivo y citometría de flujo para analizar los perfiles de TPF en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en niños vacunados con JEV. Aplicando este enfoque, se ampliará la comprensión de la inmunidad de células T específica de JEV e incluso de reacción cruzada a corto y largo plazo inducida por la vacunación.

Protocolo

La aprobación ética para el presente estudio fue obtenida por el Comité de Ética del Hospital de Niños de Beijing, Universidad Médica Capital (Número de aprobación: 2020-k-85). Los voluntarios fueron reclutados del Hospital de Niños de Beijing, Universidad Médica Capital. Se obtuvieron muestras de sangre venosa periférica de niños aparentemente sanos (2 años de edad) que habían recibido previamente una vacuna principal y potenciada con la vacuna JE SA14-14-2 viva atenuada durante menos de medio año (niños vacunados con JE, n = 5) y niños no vacunados (6 meses de edad, n = 5). El consentimiento informado de los sujetos humanos no se aplicó ya que sólo las muestras residuales, después de ser probadas clínicamente, se utilizaron en este estudio. Para proteger la privacidad de los voluntarios, todos los datos fueron completamente anónimos y desidentificados.

1. Aislamiento de PBMC de sangre venosa periférica

  1. Recolectar muestras de sangre venosa periférica (2 mL) de niños vacunados y no vacunados con JE en tubos anticoagulados con EDTA-K2 (ver Tabla de Materiales) mediante la técnica estándar de venopunción18.
  2. Agregue 2 ml de solución salina tamponada con fosfato (1x PBS) para diluir la sangre periférica.
    NOTA: El proceso se maneja lo antes posible para mantener la máxima capacidad de supervivencia.
  3. Agregue 4 ml del medio de gradiente de densidad (consulte la Tabla de materiales) a un tubo centrífugo de 15 ml y transfiera lentamente la sangre diluida a la capa superior del medio de separación.
    NOTA: No mezcle la sangre con el medio de separación ni destruya la superficie de contacto formada por los dos líquidos; de lo contrario, no se logrará el efecto de separación.
  4. Centrifugar a 800 × g durante 20 min a temperatura ambiente. Observe las capas significativas después de la centrifugación.
  5. Transfiera las PBMC (la capa intermedia) a otro tubo de centrífuga de 15 ml y lave las PBMC con 10 ml de medio RPMI-1640 que contenga 10% de suero bovino fetal (FBS, consulte la Tabla de materiales).
  6. Centrifugar a 800 × g durante 10 min a temperatura ambiente y desechar cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta.
  7. Vuelva a suspender las PBMC con 1 ml de medio RPMI-1640 que contenga 10% de FBS y cuente las células con un contador automatizado basado en azul de tripano (consulte la Tabla de materiales).

2. Estimulación de PBMCs por partículas JEV inactivadas para inducir la expresión de citoquinas

  1. Establecer dos subgrupos de los grupos de estimulación y control de JEV en las muestras vacunadas y no vacunadas con JE, respectivamente.
  2. Ajustar el número de PBMC a 2 × 106 células/ml con RPMI-1640 medio que contenga 10% de FBS, y sembrar los PBMC en placas de 24 pocillos (2 × 106 células/1 ml de medio por pocillo); Inocular tres pozos para cada grupo.
  3. Estimular las PBMC del grupo de estimulación JEV con partículas concentradas inactivadas de JEV 5 (2 × 105 UFP) durante 16 h a 37 °C en presencia de anticuerpos monoclonales CD28 (1 μg/mL, 1:1.000) y CD49d (1 μg/mL), GolgiPlug (1 μg/mL, 1:1.000) y monensina (1 μg/mL, 1:1.000). Para la tinción superficial, utilice BV605-anti-CD107a (1 μg/ml, 1:1.000) (consulte la Tabla de materiales).
    NOTA: El JEV fue inactivado por irradiación UV como se describió anteriormente19.
  4. Estimular las PBMC del grupo control sin partículas virales concentradas durante 16 h a 37 °C en presencia de anticuerpos monoclonales CD28 (1 μg/mL, 1:1.000) y CD49d (1 μg/mL, 1:1.000), GolgiPlug (1 μg/mL, 1:1.000) y monensina (1 μg/mL, 1:1.000). Manchar la superficie con BV605-anti-CD107a (1 μg/ml, 1:1.000).

3. Tinción intracelular ex vivo

  1. Recoger la suspensión celular de cada grupo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, centrifugar a 500 × g durante 5 min a temperatura ambiente y retirar el sobrenadante con una pipeta.
  2. Resuspender las células en 1 ml de 1x PBS, añadir colorante de viabilidad reparable (1 μL/ml, 1:1.000, ver Tabla de materiales) a la suspensión celular, e incubar durante 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Centrifugar a 500 × g (a temperatura ambiente) durante 5 min y retirar el sobrenadante.
  3. Resuspender las células en 1 mL de 1x PBS. Centrifugar a 500 × g (a temperatura ambiente) durante 5 min. Deseche el sobrenadante cuidadosamente.
  4. Realizar tinción de marcadores de superficie celular.
    1. Resuspender las células en 100 μL de 1x PBS, y añadir 2 μL de cada anticuerpo de marcadores de superficie (BV650-anti-CD3, BUV395-anti-CD4, BV421-anti-CD8, BUV737-anti-CD27, y BV480-anti-CD45RO, factor de dilución: 1:50, ver Tabla de materiales) a la suspensión celular en cada tubo.
      NOTA: El protocolo de tinción de anticuerpos fluorescentes de color se muestra en la Tabla 1.
    2. Incubar los tubos (paso 3.4.1) durante 30 min a temperatura ambiente y protegerlos de la luz. Centrifugar a 500 × g durante 5 min y retirar el sobrenadante.
      NOTA: El anticuerpo de BUV737-anti-CD27 y BV480-anti-CD45RO se puede reemplazar con BUV737-anti-CCR7 y BV480-anti-CD45RA como anotación de las células T de memoria.
  5. Resuspender las células en 1 mL de 1x PBS. Centrifugar a 500 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante cuidadosamente.
  6. Realizar fijación y rotura de membranas.
    1. Resuspender las células con 500 μL de solución fijadora que rompe la membrana (ver Tabla de materiales) y fijar las células durante 20 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Centrifugar a 500 × g durante 5 min y retirar el sobrenadante.
  7. Resuspender las células en 1 mL de 1x PBS. Centrifugar durante 5 min a 500 × g a temperatura ambiente y retirar el sobrenadante con cuidado.
  8. Realizar tinción de citoquinas intracelulares.
    1. Resuspender las células en 100 μL de 1x PBS y agregar 2 μL de cada anticuerpo de citoquinas (FITC-anti-IFN-γ, PE-anti-TNF-α, BV785-anti-IL-2 y APC-anti-MIP-1α, factor de dilución: 1:50, ver Tabla de materiales) a la suspensión celular en cada tubo.
      NOTA: Los volúmenes y la información sobre los anticuerpos conjugados fluoróforos se muestran en la Tabla 1.
    2. Incubar los tubos (paso 3.8.1) durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Centrifugar a 500 × g durante 5 min y retirar el sobrenadante.
  9. Resuspender las células en 1 mL de 1x PBS. Centrifugar a 500 × g durante 5 min a temperatura ambiente y retirar el sobrenadante con cuidado. Agregue 500 μL de 1x PBS para resuspender las células.

4. Configuración de la citometría de flujo

  1. Aísle la muestra PBMC sola siguiendo los procedimientos descritos en el paso 1 como muestra de control. Divida la suspensión celular en 12 partes iguales en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml (100 μL/tubo) como se menciona a continuación.
    1. Configure tinción, APC-Cy7-vivo/muerto reparable teñido, BV650-anti-CD3 de una sola tinción, BUV395-anti-CD4 de una sola tinción, BV421-anti-CD8 de una sola tinción, BUV737-anti-CD27 de una sola tinción, BV480-anti-CD45RO teñido, BV605-anti-CD107a, FITC-anti-IFN-γ teñido, PE-anti-TNF-α de una sola tinción, BV785-anti-IL-2 de una sola tinción y APC-anti-MIP-1α de una sola tiñida.
  2. Agregue los marcadores de superficie celular y la tinción de citoquinas intracelulares como se describe en el paso 3. Para cada muestra de tinción única, agregue solo uno de los fluoróforos de la etapa de tinción. Agregue 500 μL de 1x PBS para resuspender las células y el vórtice con baja velocidad.
  3. Usando una muestra no teñida, ajuste la dispersión directa (FSC), la dispersión lateral (SSC) y diferentes voltajes de tinte fluorescente.
    NOTA: Para el presente estudio, se establecieron los siguientes voltajes. FSC: 440 V, SSC: 233 V, BV650: 575 V, APC-Cy7: 449 V, BUV395: 500 V, BV421: 402 V, BUV737: 585 V, BV480: 444 V, BV605: 457 V, FITC: 475 V, PE: 469 V, APC: 623 V y BV785: 725 V.
  4. Usando las muestras de tinción única, ajuste la compensación de citometría de flujo para eliminar las señales de contaminación entre los diferentes fluoróforos.
    NOTA: Los parámetros de compensación se muestran en la Tabla 2.

5. Estrategia de gating y análisis de datos

NOTA: En el presente estudio, para este análisis, las células T de memoria central (TCM de linfocitos T CD8+ o CD4+ como CD27+ CD45RO+ o CCR7+ CD45RA- y los linfocitos T de memoria efectora (TEM) de linfocitos T CD8+ o CD4+ como CD27- CD45RO+ o CCR7- CD45RA- fueron definidos respectivamente16.

  1. Dibuje una puerta poligonal a través del diagrama de puntos del área FSC (FSC-A)/SSC (SC-A) para seleccionar la población de linfocitos intacta mientras se excluyen los desechos (Figura 1A).
  2. Dibuje una puerta rectangular a través del diagrama de puntos FSC-A/FSC-width (FSC-W) para seleccionar las celdas individuales (Figura 1B).
  3. Dibuje una puerta rectangular a través del diagrama de puntos vivo/muerto/SSC-A para seleccionar las celdas vivas (Figura 1C).
  4. Dibuje una puerta rectangular a través del diagrama de puntos CD3/SSC-A para identificar las células T CD3+ (Figura 1D).
  5. Dibuje una puerta cuádruple a través del diagrama de puntos CD4/CD8 para identificar las células T CD4+ o CD8+ (Figura 1E).
  6. Dibuje una puerta cuádruple a través del diagrama de puntos CD45RO/CD27 para subdividir las células T CD4+ o CD8+ en TCM (CD27+ CD45RO+) y TEM (CD27- CD45RO+) (Figura 1F-I).
  7. Dibuje las puertas de CD107a, IFN-γ, TNF-α, IL-2 y MIP-1α a partir de la TCM o TEM de las células T CD8+ o CD4+ para determinar la frecuencia de diferentes patrones de respuesta, respectivamente.
  8. Cargue las muestras en la citometría secuencialmente. Utilice una puerta de parada 20 para adquirir 1 ×10 6 linfocitos.
    NOTA: El usuario individual puede recopilar más de 1 × 106 celdas. Este número fue un compromiso entre el tiempo necesario y la recolección de suficientes células para proporcionar resultados significativos.

Resultados

La Figura 1 muestra la estrategia de activación utilizada para dividirla CM T ola EM T de las células T CD8+ o CD4+ de un grupo representativo de estimulación JEV de niños vacunados con JE. El diagrama de puntos FSC-A/SSC-A se utiliza para identificar linfocitos, y el diagrama de puntos FSC-A/FSC-W se utiliza para identificar células individuales. Las células viables se seleccionan en el diagrama de puntos vivo/muerto/SSC-A. El diagrama de pu...

Discusión

Este protocolo representa un método de detección factible basado en citometría de flujo para perfiles deT PF en las PBMC de niños vacunados con la vacuna JEV SA14-14-2. Este estudio utilizó las PBMC de sangre venosa de niños vacunados y no vacunados como materiales de investigación. Con la estimulación de PBMC con el antígeno JEV, esos antígenosT PFespecíficos amplificados pueden caracterizarse por tinción de anticuerpos de citometría de flujo multicolor. En comparación con el método ...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

R.W. fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82002130), la Fundación de Ciencias Naturales de Beijing de China (7222059). ZD.X. fue apoyado por el Fondo de Innovación CAMS para Ciencias Médicas (2019-I2M-5-026).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
anti-human CD28Biolegend302934Antibody
anti-human CD49dBiolegend304339Antibody
APC anti-human MIP-1αBD551533Fluorescent antibody 
Automated cell counterBIO RADTC20Cell count
BD FACSymphony A5BDA5flow Cytometry
BUV395 anti-human CD4BD563550Fluorescent antibody 
BUV737 anti-human CCR7BD741786Fluorescent antibody 
BUV737 anti-human CD27BD612829Fluorescent antibody 
BV421 anti-human CD8Biolegend344748Fluorescent antibody 
BV480 anti-human CD45RABD566114Fluorescent antibody 
BV480 anti-human CD45ROBD566143Fluorescent antibody 
BV605 anti-human CD107aBiolegend328634Fluorescent antibody 
BV650 anti-human CD3BD563999Fluorescent antibody 
BV785 anti-human IL-2Biolegend500348Fluorescent antibody 
Centrifuge TubeBD FalconBD-3520971515 mL centrifuge tube
Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution KitBD554714Cell fixation and permeabilization
Density gradient mediumDakeweDKW-KLSH-0100Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium
FITC anti-human IFN-γBiolegend502506Fluorescent antibody 
Gibco Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific16000-044Fetal Bovine Serum
Gibco RPMI-1640 mediumThermo Fisher Scientific22400089cell culture medium
High-speed centrifugeSigma 3K15Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube
High-speed centrifugeEppendorf5424RCell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube
Microcentrifuge tubesAxygenMCT-150-C1.5 mL microcentrifuge tube
PE anti-human TNF-αBiolegend502909Fluorescent antibody 
Phosphate Buffered Saline (PBS)BI02-024-1ACSPBS
Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug)BD555029blocks intracellular protein transport processes
Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)BD554724blocks intracellular protein transport processes
Round-bottom test tubeBD Falcon3522355 mL test tube
Trypan Blue Staining Cell Viability Assay KitBeyotimeC0011Trypan Blue Staining
Zombie NIR Fixable Viability DyeBiolegend423106Dead cell stain

Referencias

  1. Vanden Eynde, C., Sohier, C., Matthijs, S., De Regge, N. Japanese encephalitis virus interaction with mosquitoes: A review of vector competence, vector capacity and mosquito immunity. Pathogens. 11 (3), 317 (2022).
  2. Wang, R., et al. The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study. PLoS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), 0010562 (2022).
  3. Wang, R., et al. Decreases in both the seroprevalence of serum antibodies and seroprotection against Japanese encephalitis virus among vaccinated children. Virologica Sinica. 34 (3), 243-252 (2019).
  4. Wang, R., et al. Neutralizing antibody rather than cellular immune response is maintained for nearly 20 years among Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccinees in an endemic setting. Infection, Genetics and Evolution. 85, 104476 (2020).
  5. Wang, R., et al. T cell immunity rather than antibody mediates cross-protection against Zika virus infection conferred by a live attenuated Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccine. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (15), 6779-6789 (2020).
  6. Redant, V., Favoreel, H. W., Dallmeier, K., Van Campe, W., De Regge, N. Japanese encephalitis virus persistence in porcine tonsils is associated with a weak induction of the innate immune response, an absence of IFNgamma mRNA expression, and a decreased frequency of CD4(+)CD8(+) double-positive T cells. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 834888 (2022).
  7. Jain, N., et al. CD8 T cells protect adult naive mice from JEV-induced morbidity via lytic function. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (2), 0005329 (2017).
  8. Khakhum, N., Bharaj, P., Walker, D. H., Torres, A. G., Endsley, J. J. Antigen-specific antibody and polyfunctional T cells generated by respiratory immunization with protective Burkholderia DeltatonB Deltahcp1 live attenuated vaccines. NPJ Vaccines. 6 (1), 72 (2021).
  9. Weaver, J. M., et al. Increase in IFNgamma(-)IL-2(+) cells in recent human CD4 T cell responses to 2009 pandemic H1N1 influenza. PloS One. 8 (-), 57275 (2013).
  10. Boaz, M. J., Waters, A., Murad, S., Easterbrook, P. J., Vyakarnam, A. Presence of HIV-1 Gag-specific IFN-gamma+IL-2+ and CD28+IL-2+ CD4 T cell responses is associated with nonprogression in HIV-1 infection. Journal of Immunology. 169 (11), 6376-6385 (2002).
  11. Gui, L., et al. IL-2, IL-4, IFN-gamma or TNF-alpha enhances BAFF-stimulated cell viability and survival by activating Erk1/2 and S6K1 pathways in neoplastic B-lymphoid cells. Cytokine. 84, 37-46 (2016).
  12. Terahara, K., et al. Vaccine-induced CD107a+ CD4+ T cells are resistant to depletion following AIDS virus infection. Journal of Virology. 88 (24), 14232-14240 (2014).
  13. Tanyi, J. L., et al. Personalized cancer vaccine strategy elicits polyfunctional T cells and demonstrates clinical benefits in ovarian cancer. NPJ Vaccines. 6 (1), 36 (2021).
  14. Ammirati, E., et al. Effector memory T cells are associated with atherosclerosis in humans and animal models. Journal of the American Heart Association. 1 (1), 27-41 (2012).
  15. Rizk, N. M., Fadel, A., AlShammari, W., Younes, N., Bashah, M. The immunophenotyping changes of peripheral CD4+ T lymphocytes and inflammatory markers of class III obesity subjects after laparoscopic gastric sleeve surgery - A follow-up study. Journal of Inflammation Research. 14, 1743-1757 (2021).
  16. Zhang, Y., et al. Phenotypic and functional characterizations of CD8(+) T cell populations in malignant pleural effusion. Experimental Cell Research. 417 (1), 113212 (2022).
  17. Shin, H., Iwasaki, A. Tissue-resident memory T cells. Immunological Reviews. 255 (1), 165-181 (2013).
  18. Birnie, K. A., Noel, M., Chambers, C. T., Uman, L. S., Parker, J. A. Psychological interventions for needle-related procedural pain and distress in children and adolescents. Cochrane Database of Systematic Reviews. 10 (10), (2018).
  19. Lin, R. J., Liao, C. L., Lin, Y. L. Replication-incompetent virions of Japanese encephalitis virus trigger neuronal cell death by oxidative stress in a culture system. Journal of General Virology. 85, 521-533 (2004).
  20. Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).
  21. Zheng, X., et al. Immune responses and protective effects against Japanese encephalitis induced by a DNA vaccine encoding the prM/E proteins of the attenuated SA14-14-2 strain. Infection, Genetics and Evolution. 85, 104443 (2020).
  22. Zheng, X., et al. Complete protection for mice conferred by a DNA vaccine based on the Japanese encephalitis virus P3 strain used to prepare the inactivated vaccine in China. Virology Journal. 17 (1), 126 (2020).
  23. Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers in Microbiology. 9, 416 (2018).
  24. Meckiff, B. J., et al. Imbalance of regulatory and cytotoxic SARS-CoV-2-reactive CD4(+) T cells in COVID-19. Cell. 183 (5), 1340-1353 (2020).
  25. Ning, R. J., Xu, X. Q., Chan, K. H., Chiang, A. K. Long-term carriers generate Epstein-Barr virus (EBV)-specific CD4(+) and CD8(+) polyfunctional T-cell responses which show immunodominance hierarchies of EBV proteins. Immunology. 134 (2), 161-171 (2011).

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