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  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Le présent protocole combine la stimulation ex vivo et la cytométrie en flux pour analyser les profils de lymphocytes T polyfonctionnels (TPF) dans les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) chez les enfants vaccinés contre le virus de l’encéphalite japonaise (JEV). La méthode de détection et la palette de couleurs de cytométrie en flux des TPF spécifiques au JEV ont été testées pour fournir une référence pour des études similaires.

Résumé

L’immunité à médiation par les lymphocytes T joue un rôle important dans le contrôle de l’infection à flavivirus, soit après la vaccination, soit après une infection naturelle. La « qualité » d’un lymphocyte T doit être évaluée par fonction, et une fonction supérieure est associée à une protection immunitaire plus puissante. Les lymphocytes T qui peuvent produire simultanément deux cytokines ou chimiokines ou plus au niveau unicellulaire sont appelés lymphocytes T polyfonctionnels (TPFs), qui médient les réponses immunitaires par divers mécanismes moléculaires pour exprimer les marqueurs de dégranulation (CD107a) et sécréter de l’interféron (IFN)-γ, du facteur de nécrose tumorale (TNF)-α, de l’interleukine (IL)-2 ou de la protéine inflammatoire des macrophages (MIP)-1α. Il existe de plus en plus de preuves que les TPFsont étroitement liés au maintien de la mémoire immunitaire et de la protection à long terme et que leur proportion accrue est un marqueur important de l’immunité protectrice et est important dans le contrôle efficace de l’infection virale et de la réactivation. Cette évaluation s’applique non seulement à des réponses immunitaires spécifiques, mais aussi à l’évaluation des réponses immunitaires réactives croisées. Ici, en prenant le virus de l’encéphalite japonaise (JEV) comme exemple, la méthode de détection et la palette de couleurs de cytométrie en flux des TPFspécifiques du JEV produites par les cellules mononucléaires du sang périphérique d’enfants vaccinés contre l’encéphalite japonaise ont été testées pour fournir une référence pour des études similaires.

Introduction

Le virus de l’encéphalite japonaise (JEV) est un important virus transmis par les moustiques appartenant au genre Flavivirus de la familledes Flaviviridae 1. De nombreux pays d’Asie-Pacifique sont depuis longtemps confrontés à d’énormes défis de santé publique en raison de l’énorme charge de morbidité causée par l’encéphalite japonaise (EJ), mais cela s’est considérablement amélioré avec la disponibilité croissante de divers types de vaccins2. Les réponses immunitaires protectrices adaptatives évoquées par l’infection naturelle ou la vaccination contribuent à la prévention et à la régulation antivirale. L’immunité humorale et l’immunité à médiation cellulaire sont classées comme immunité adaptative, et l’induction de la première a toujours été considérée comme une stratégie clé dans la conception de vaccins, bien qu’avec une compréhension relativement limitée au cours des3 dernières années. Cependant, le rôle de l’immunité médiée par les lymphocytes T dans la limitation de la dissémination des flavivirus et de l’élimination du virus a été de plus en plus ciblé et étudié de manière approfondie4. De plus, l’immunité des lymphocytes T est non seulement indispensable dans les réponses antivirales spécifiques du JEV, mais joue également un rôle de premier plan dans la protection croisée contre l’infection secondaire par des flavivirus hétérologues, ce qui a été démontré dans des études antérieures5. On suppose que cet effet peut contourner les effets potentiels d’amélioration médiés par les anticorps dans l’infection5. Il convient de noter qu’une telle immunité croisée des lymphocytes T est importante, en particulier en l’absence de vaccins et de médicaments antiviraux contre les flavivirus. Bien que de nombreuses études aient été réalisées pour déterminer la contribution des lymphocytes T dans l’infection par le JEV par rapport aux lymphocytes T CD4+ et CD8+ 6,7, les lignées respectives sécrétant des cytokines et leur diversification fonctionnelle restent indéterminées, ce qui signifie que l’élucidation des fonctions exactes des lymphocytes T auxiliaires et tueurs est entravée.

L’échelle de leurs défenses antivirales détermine la qualité des réponses des lymphocytes T. Les lymphocytes T CD4+ ou CD8+ qui peuvent conférer de façon compatible deux fonctions ou plus, y compris la sécrétion et la dégranulation de cytokines, sont caractérisés comme des lymphocytes T polyfonctionnels (TPF) lors d’une stimulation spécifique au niveau unicellulaire8. Les lymphocytes T CD4+ qui produisent une ou plusieurs cytokines peuvent avoir divers effets et mémoires immunitaires. Par exemple, les lymphocytes T CD4+ IL-2+ IFN-γ+ sont plus susceptibles de former une réponse protectrice efficace à long terme que les lymphocytes T CD4+ IL-2+ 9, qui peuvent être utilisés comme paramètre important dans l’évaluation de l’effet vaccinal. La fréquence des lymphocytes T CD4+ IL-2+ IFN-γ+ est augmentée chez les patients présentant une non-progression à long terme du syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA), tandis que les lymphocytes T CD4+ chez les patients atteints de progression du sida sont plus enclins à produire de l’IFN-γ seul en raison de l’effet favorisant l’IL-2 sur la prolifération des lymphocytes T10. En outre, il a été démontré qu’un sous-ensemble d’IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+ survivait à long terme in vivo et favorisait de manière synergique la fonction de destruction11. Bien que les lymphocytes T CD8+ soient plus susceptibles de présenter une activité cytotoxique, certains lymphocytes T CD4+ sont également équipés d’une activité cytotoxique en tant qu’expression indirectement détectée de molécules CD107ade surface 12. De plus, certains sous-ensembles de lymphocytes T expriment la chimiokine MIP-1α, qui est souvent sécrétée par les monocytes pour participer au recrutement des neutrophiles médiés par les lymphocytes T13. De même, les CD8+ TPFs peuvent également être utilisés pour caractériser la polyvalence des marqueurs ci-dessus. Des études ont montré que la stratégie prime-boost peut induire efficacement une période prolongée d’effets protecteurs du TPF 13, ce qui peut renforcer la protection obtenue par la vaccination. Une caractéristique centrale de l’examen du système immunitaire est la capacité des lymphocytes T mémoire à faciliter des réponses plus fortes, plus rapides et plus efficaces aux défis viraux secondaires que les lymphocytes T naïfs. Les lymphocytes T à mémoire effectrice (TEM) et les lymphocytes T à mémoire centrale (TCM) sont des sous-ensembles importants de lymphocytes T qui sont souvent différenciés par l’expression composite de CD27/CD45RO ou CCR7/CD45RA14. TCM (CD27+ CD45RO+ ou CCR7+ CD45RA-) a tendance à se localiser dans les tissus lymphoïdes secondaires, tandis que TEM (CD27- CD45RO+ ou CCR7- CD45RA-) se localise dans les tissus lymphoïdes et périphériques15,16. La TEM assure une défense immédiate mais non soutenue, tandis que la TCM soutient la réponse en proliférant dans les organes lymphoïdes secondaires et en générant de nouveaux effecteurs17. Ainsi, étant donné que les cellules mémoire peuvent intervenir des réponses de rappel spécifiques et efficaces aux virus, des questions se posent quant à la contribution de ce sous-ensemble de polyfonctions.

Avec le développement de la technologie de cytométrie en flux, il est devenu courant de détecter simultanément les marqueurs de plus de 10 grappes, phénotypes et antigènes de différenciation, ce qui est bénéfique pour annoter plus abondamment les caractéristiques immunologiques fonctionnelles sur les cellules T individuelles afin de réduire les erreurs d’interprétation et les difficultés de compréhension des phénotypes des cellules T. Cette étude a utilisé la stimulation ex vivo et la cytométrie de flux pour analyser les profils de TPF dans les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) chez les enfants vaccinés par le JEV. En appliquant cette approche, la compréhension de l’immunité à court et à long terme des lymphocytes T spécifiques au JEV et même à réactivité croisée induite par la vaccination sera élargie.

Protocole

L’approbation éthique de la présente étude a été obtenue par le Comité d’éthique de l’Hôpital pour enfants de Beijing, Capital Medical University (numéro d’approbation : 2020-k-85). Des volontaires ont été recrutés à l’hôpital pour enfants de Beijing et à l’Université médicale de la capitale. Des échantillons de sang veineux périphérique ont été prélevés chez des enfants apparemment en bonne santé (2 ans) qui avaient déjà reçu une vaccination prime et une vaccination renforcée avec le vaccin vivant atténué contre l’encéphalite japonaise SA14-14-2 pendant moins de six mois (enfants vaccinés contre l’EJ, n = 5) et d’enfants non vaccinés (6 mois, n = 5). Le consentement éclairé des sujets humains a été levé car seuls les échantillons résiduels, après avoir été testés cliniquement, ont été utilisés dans cette étude. Pour protéger la vie privée des volontaires, toutes les données ont été entièrement anonymisées et anonymisées.

1. Isolement des PBMC du sang veineux périphérique

  1. Prélever des échantillons de sang veineux périphérique (2 mL) d’enfants vaccinés et non vaccinés dans des tubes anticoagulés EDTA-K2 (voir le tableau des matières) selon la technique standard de ponction veineuse18.
  2. Ajouter 2 mL de solution saline tamponnée au phosphate (1x PBS) pour diluer le sang périphérique.
    REMARQUE: Le processus est traité dès que possible pour maintenir une capacité de survie maximale.
  3. Ajouter 4 mL du milieu de gradient de densité (voir le tableau des matériaux) dans un tube à centrifuger de 15 mL et transférer lentement le sang dilué dans la couche supérieure du milieu de séparation.
    NOTE: Ne pas mélanger le sang avec le milieu de séparation ou détruire la surface de contact formée par les deux liquides; sinon, l’effet de séparation ne sera pas atteint.
  4. Centrifuger à 800 × g pendant 20 min à température ambiante. Observez les couches significatives après la centrifugation.
  5. Transférer les PBMC (la couche intermédiaire) dans un autre tube centrifuge de 15 mL et laver les PBMC avec 10 mL de milieu RPMI-1640 contenant 10% de sérum fœtal bovin (FBS, voir le tableau des matières).
  6. Centrifuger à 800 × g pendant 10 min à température ambiante et jeter soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette.
  7. Remettez en suspension les PBMC avec 1 mL de milieu RPMI-1640 contenant 10 % de FBS et comptez les cellules à l’aide d’un compteur automatisé à base de trypan bleu (voir le tableau des matières).

2. Stimulation des PBMC par des particules JEV inactivées pour induire l’expression de cytokines

  1. Définir deux sous-groupes des groupes de stimulation et de contrôle JEV dans les échantillons vaccinés et non vaccinés, respectivement.
  2. Ajuster le nombre de PBMC à 2 × 10 6 cellules/mL avec un milieu RPMI-1640 contenant 10 % de FBS, et ensemencer les PBMC dans des plaques de 24 puits (2 × 106 cellules/1 mL de milieu par puits); inoculer trois puits pour chaque groupe.
  3. Stimuler les PBMC du groupe de stimulation JEV avec des particules JEV inactivéesconcentrées 5 (2 × 105 PFU) pendant 16 h à 37 °C en présence d’anticorps monoclonaux CD28 (1 μg/mL, 1:1 000) et CD49d (1 μg/mL), GolgiPlug (1 μg/mL, 1:1 000) et monensin (1 μg/mL, 1:1 000). Pour la coloration de surface, utiliser BV605-anti-CD107a (1 μg/mL, 1:1 000) (voir le tableau des matériaux).
    REMARQUE : Le JEV a été inactivé par irradiation UV comme décrit précédemment19.
  4. Stimuler les PBMC du groupe témoin sans particules virales concentrées pendant 16 h à 37 °C en présence d’anticorps monoclonaux CD28 (1 μg/mL, 1:1 000) et CD49d (1 μg/mL, 1:1 000), GolgiPlug (1 μg/mL, 1:1 000) et monensin (1 μg/mL, 1:1 000). Colorer la surface avec BV605-anti-CD107a (1 μg/mL, 1:1 000).

3. Coloration intracellulaire ex vivo

  1. Prélever la suspension cellulaire de chaque groupe dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL, centrifuger à 500 × g pendant 5 minutes à température ambiante et retirer le surnageant à l’aide d’une pipette.
  2. Remettez les cellules en suspension dans 1 mL de 1x PBS, ajoutez un colorant de viabilité réparable (1 μL/mL, 1:1 000, voir le tableau des matériaux) à la suspension cellulaire et incuber pendant 10 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Centrifuger à 500 × g (à température ambiante) pendant 5 min et retirer le surnageant.
  3. Remettez les cellules en suspension dans 1 mL de 1x PBS. Centrifuger à 500 × g (à température ambiante) pendant 5 min. Jetez soigneusement le surnageant.
  4. Effectuer la coloration des marqueurs de surface cellulaire.
    1. Resuspendre les cellules dans 100 μL de 1x PBS et ajouter 2 μL de chaque anticorps marqueur de surface (BV650-anti-CD3, BUV395-anti-CD4, BV421-anti-CD8, BUV737-anti-CD27 et BV480-anti-CD45RO, facteur de dilution: 1:50, voir le tableau des matériaux) à la suspension cellulaire dans chaque tube.
      REMARQUE: Le protocole de coloration des anticorps fluorescents couleur est indiqué dans le tableau 1.
    2. Incuber les tubes (étape 3.4.1) pendant 30 min à température ambiante et les protéger de la lumière. Centrifuger à 500 × g pendant 5 min et retirer le surnageant.
      REMARQUE: L’anticorps de BUV737-anti-CD27 et BV480-anti-CD45RO peut être remplacé par BUV737-anti-CCR7 et BV480-anti-CD45RA comme annotation des cellules T mémoire.
  5. Remettez les cellules en suspension dans 1 mL de 1x PBS. Centrifuger à 500 × g pendant 5 min à température ambiante. Jetez soigneusement le surnageant.
  6. Effectuer la fixation et la rupture de membrane.
    1. Remettez les cellules en suspension avec 500 μL de solution fixatrice qui brise la membrane (voir le tableau des matériaux) et fixez les cellules pendant 20 minutes à l’obscurité à température ambiante. Centrifuger à 500 × g pendant 5 min et retirer le surnageant.
  7. Remettez les cellules en suspension dans 1 mL de 1x PBS. Centrifuger pendant 5 min à 500 × g à température ambiante et retirer le surnageant soigneusement.
  8. Effectuer une coloration intracellulaire des cytokines.
    1. Remettez les cellules en suspension dans 100 μL de 1x PBS et ajoutez 2 μL de chaque anticorps cytokine (FITC-anti-IFN-γ, PE-anti-TNF-α, BV785-anti-IL-2 et APC-anti-MIP-1α, facteur de dilution: 1:50, voir le tableau des matériaux) à la suspension cellulaire dans chaque tube.
      REMARQUE : Les volumes et les informations sur les anticorps conjugués fluorophores sont présentés dans le tableau 1.
    2. Incuber les tubes (étape 3.8.1) pendant 30 min à température ambiante dans l’obscurité. Centrifuger à 500 × g pendant 5 min et retirer le surnageant.
  9. Remettez les cellules en suspension dans 1 mL de 1x PBS. Centrifuger à 500 × g pendant 5 min à température ambiante, et retirer le surnageant soigneusement. Ajouter 500 μL de 1x PBS pour remettre les cellules en suspension.

4. Configuration de la cytométrie en flux

  1. Isoler l’échantillon PBMC seul en suivant les procédures décrites à l’étape 1 comme échantillon témoin. Diviser la suspension cellulaire en 12 parties égales dans des tubes microcentrifugés de 1,5 mL (100 μL/tube) comme mentionné ci-dessous.
    1. Configurez des échantillons non tachés, APC-Cy7-vivant/mort tachables tachés, BV650-anti-CD3 mono-colorés, BUV395-anti-CD4 mono-colorants, BV421-anti-CD8 mono-colorés, BUV737-anti-CD27 mono-coloré, BV480-anti-CD45RO coloré, BV605-anti-CD107a, FITC-anti-IFN-γ coloré, PE-anti-TNF-α mono-coloration, BV785-anti-IL-2 à coloration unique et APC-anti-MIP-1α à coloration unique.
  2. Ajouter les marqueurs de surface cellulaire et la coloration intracellulaire des cytokines comme décrit à l’étape 3. Pour chaque échantillon à coloration unique, n’ajouter qu’un seul des fluorophores de l’étape de coloration. Ajouter 500 μL de 1x PBS pour remettre en suspension les cellules et le vortex à faible vitesse.
  3. À l’aide d’un échantillon non coloré, ajustez la diffusion directe (FSC), la diffusion latérale (SSC) et différentes tensions de colorant fluorescent.
    REMARQUE : Pour la présente étude, les tensions suivantes ont été réglées. FSC : 440 V, SSC : 233 V, BV650 : 575 V, APC-Cy7 : 449 V, BUV395 : 500 V, BV421 : 402 V, BUV737 : 585 V, BV480 : 444 V, BV605 : 457 V, FITC : 475 V, PE : 469 V, APC : 623 V et BV785 : 725 V.
  4. À l’aide des échantillons à coloration unique, ajuster la compensation de cytométrie en flux pour éliminer les signaux de contamination entre les différents fluorophores.
    REMARQUE : Les paramètres de compensation sont indiqués dans le tableau 2.

5. Stratégie de contrôle et analyse des données

REMARQUE : Dans la présente étude, aux fins de cette analyse, les lymphocytes T à mémoire centrale (TCM des lymphocytes T CD8+ ou CD4+ sous forme de CD27+ CD45RO+ ou CCR7+ CD45RA- et les lymphocytes T à mémoire effectrice (TEM) des lymphocytes T CD8+ ou CD4+ comme CD27- CD45RO+ ou CCR7- CD45RA- ont été définis respectivement16.

  1. Tracez une porte polygonale à travers le diagramme à points de la zone FSC (FSC-A)/SSC-area (SSC-A) pour sélectionner la population de lymphocytes intacts tout en excluant les débris (Figure 1A).
  2. Tracez une porte rectangulaire à travers le diagramme à points FSC-A/FSC-width (FSC-W) pour sélectionner les cellules individuelles (Figure 1B).
  3. Tracez une porte rectangulaire à travers le diagramme à points vivant/mort/SSC-A pour sélectionner les cellules vivantes (Figure 1C).
  4. Tracez une porte rectangulaire à travers le diagramme à points CD3/SSC-A pour identifier les lymphocytes T CD3+ (Figure 1D).
  5. Tracez une porte quadruple à travers le diagramme à points CD4/CD8 pour identifier les lymphocytes T CD4+ ou CD8+ (figure 1E).
  6. Tracez une porte quadruple à travers le diagramme à points CD45RO/CD27 pour subdiviser les lymphocytes T CD4+ ou CD8+ en TCM (CD27+ CD45RO+) et TEM (CD27- CD45RO+) (figure 1F-I).
  7. Dessinez les portes de CD107a, IFN-γ, TNF-α, IL-2 et MIP-1α à partir des lymphocytes TCM ou TEM des lymphocytes T CD8+ ou CD4+ pour déterminer la fréquence des différents profils de réponse, respectivement.
  8. Chargez les échantillons sur la cytométrie séquentiellement. Utilisez une porte d’arrêt 20 pour acquérir 1 ×10 6 lymphocytes.
    REMARQUE: L’utilisateur individuel peut collecter plus de 1 × 106 cellules. Ce nombre était un compromis entre le temps nécessaire et la collecte de suffisamment de cellules pour fournir des résultats significatifs.

Résultats

La figure 1 montre la stratégie de déclenchement utilisée pour diviser le TCM ou le TEM des lymphocytes T CD8+ ou CD4+ d’un groupe représentatif de stimulation du JEV d’enfants vaccinés contre l’EJ. Le diagramme à points FSC-A/SSC-A est utilisé pour identifier les lymphocytes, et le diagramme à points FSC-A/FSC-W est utilisé pour identifier les cellules individuelles. Les cellules viables sont sélectionnées sur le diagramme à poin...

Discussion

Ce protocole représente une méthode de détection réalisable basée sur la cytométrie en flux pour les profils TPF dans les PBMC des enfants vaccinés avec le vaccin JEV SA14-14-2. Cette étude a utilisé les PBMC sanguins veineux d’enfants vaccinés et non vaccinés comme matériel de recherche. Avec la stimulation des PBMC avec l’antigène JEV, ces TPFamplifiés spécifiques de l’antigène peuvent être caractérisés par une coloration multicolore des anticorps de cytométrie en flux. P...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

R.W. a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82002130), la Fondation des sciences naturelles de Beijing de Chine (7222059). ZD.X. a été soutenu par le Fonds d’innovation CAMS pour les sciences médicales (2019-I2M-5-026).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
anti-human CD28Biolegend302934Antibody
anti-human CD49dBiolegend304339Antibody
APC anti-human MIP-1αBD551533Fluorescent antibody 
Automated cell counterBIO RADTC20Cell count
BD FACSymphony A5BDA5flow Cytometry
BUV395 anti-human CD4BD563550Fluorescent antibody 
BUV737 anti-human CCR7BD741786Fluorescent antibody 
BUV737 anti-human CD27BD612829Fluorescent antibody 
BV421 anti-human CD8Biolegend344748Fluorescent antibody 
BV480 anti-human CD45RABD566114Fluorescent antibody 
BV480 anti-human CD45ROBD566143Fluorescent antibody 
BV605 anti-human CD107aBiolegend328634Fluorescent antibody 
BV650 anti-human CD3BD563999Fluorescent antibody 
BV785 anti-human IL-2Biolegend500348Fluorescent antibody 
Centrifuge TubeBD FalconBD-3520971515 mL centrifuge tube
Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution KitBD554714Cell fixation and permeabilization
Density gradient mediumDakeweDKW-KLSH-0100Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium
FITC anti-human IFN-γBiolegend502506Fluorescent antibody 
Gibco Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific16000-044Fetal Bovine Serum
Gibco RPMI-1640 mediumThermo Fisher Scientific22400089cell culture medium
High-speed centrifugeSigma 3K15Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube
High-speed centrifugeEppendorf5424RCell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube
Microcentrifuge tubesAxygenMCT-150-C1.5 mL microcentrifuge tube
PE anti-human TNF-αBiolegend502909Fluorescent antibody 
Phosphate Buffered Saline (PBS)BI02-024-1ACSPBS
Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug)BD555029blocks intracellular protein transport processes
Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)BD554724blocks intracellular protein transport processes
Round-bottom test tubeBD Falcon3522355 mL test tube
Trypan Blue Staining Cell Viability Assay KitBeyotimeC0011Trypan Blue Staining
Zombie NIR Fixable Viability DyeBiolegend423106Dead cell stain

Références

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Réimpressions et Autorisations

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