Nachweis polyfunktioneller T-Zellen bei Kindern, die mit Impfstoff gegen Japanische Enzephalitis geimpft wurden, mittels Durchflusszytometrie

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll kombiniert Ex-vivo-Stimulation und Durchflusszytometrie, um polyfunktionelle T-Zell-Profile (T PF) in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) bei mit dem Japanischen Enzephalitis-Virus (JEV₎ geimpften Kindern zu analysieren. Die Detektionsmethode und das Farbschema der Durchflusszytometrie von JEV-spezifischen TPFs wurden getestet, um eine Referenz für ähnliche Studien zu liefern.

Zusammenfassung

Die T-Zell-vermittelte Immunität spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der Flavivirus-Infektion, entweder nach der Impfung oder nach einer natürlichen Infektion. Die "Qualität" einer T-Zelle muss nach Funktion beurteilt werden, und eine höhere Funktion ist mit einem stärkeren Immunschutz verbunden. T-Zellen, die gleichzeitig zwei oder mehr Zytokine oder Chemokine auf Einzelzellebene produzieren können, werden als polyfunktionelle T-Zellen (T_PFs) bezeichnet, die Immunantworten durch eine Vielzahl von molekularen Mechanismen vermitteln, um Degranulationsmarker (CD107a) zu exprimieren und Interferon (IFN)-γ, Tumornekrosefaktor (TNF)-α, Interleukin (IL)-2 oder Makrophagen-Entzündungsprotein (MIP)-1α zu sezernieren. Es gibt zunehmend Hinweise darauf, dass_T-PFeng mit der Aufrechterhaltung des langfristigen Immungedächtnisses und -schutzes zusammenhängen und dass ihr erhöhter Anteil ein wichtiger Marker für schützende Immunität und wichtig für die wirksame Kontrolle von Virusinfektionen und Reaktivierungen ist. Diese Bewertung gilt nicht nur für spezifische Immunantworten, sondern auch für die Beurteilung von kreuzreaktiven Immunantworten. Hier wurden am Beispiel des Japanischen Enzephalitis-Virus (JEV) die Nachweismethode und das durchflusszytometrische Farbschema von JEV-spezifischen_T-PFsgetestet, die von peripheren mononukleären Blutzellen von Kindern produziert werden, die gegen Japanische Enzephalitis geimpft wurden, um eine Referenz für ähnliche Studien zu liefern.

Einleitung

Das Japanische Enzephalitis-Virus (JEV) ist ein wichtiges durch Mücken übertragenes Virus der Gattung Flavivirus innerhalb der Familie Flaviviridae¹. Viele asiatisch-pazifische Länder stehen aufgrund der enormen Krankheitslast durch die Japanische Enzephalitis (JE) seit langem vor enormen Herausforderungen für die öffentliche Gesundheit, aber dies hat sich mit der zunehmenden Verfügbarkeit verschiedener Arten von Impfungen dramatisch verbessert². Adaptive schützende Immunantworten, die durch natürliche Infektionen oder Impfungen hervorgerufen werden, tragen zur Prävention und antiviralen Regulation bei. Humorale Immunität und zellvermittelte Immunität werden als adaptive Immunität klassifiziert, und die Induktion der ersteren wurde immer als Schlüsselstrategie im Impfstoffdesign angesehen, wenn auch mit relativ begrenztem Verständnis in der Vergangenheit³. Die Rolle der T-Zell-vermittelten Immunität bei der Begrenzung der Flavivirusverbreitung und Virusclearance wurde jedoch zunehmend in den Fokus gerückt und umfassend untersucht⁴. Darüber hinaus ist die T-Zell-Immunität nicht nur für JEV-spezifische antivirale Reaktionen unverzichtbar, sondern spielt auch eine herausragende Rolle beim Kreuzschutz vor Sekundärinfektionen mit heterologen Flaviviren, was in früheren Studien gezeigt wurde⁵. Es wird spekuliert, dass dieser Effekt potenzielle Antikörper-vermittelte Verstärkungseffekte bei Infektion umgehen kann⁵. Bemerkenswert ist, dass eine solche kreuzreaktive T-Zell-Immunität wichtig ist, insbesondere in Abwesenheit von Impfstoffen und antiviralen Medikamenten gegen Flaviviren. Obwohl viele Studien durchgeführt wurden, um den Beitrag von T-Zellen bei der JEV-Infektion in Bezug auf CD4+ und CD8⁺ T-Zellen^6,7 zu bestimmen, bleiben die jeweiligen Linien der Zytokine und ihre funktionelle Diversifizierung unbestimmt, was bedeutet^, dass die Aufklärung der genauen Funktionen von Helfer- und Killer-T-Zellen behindert wird.

Das Ausmaß ihrer antiviralen Abwehrkräfte bestimmt die Qualität der T-Zell-Antworten. CD4+ oder CD8⁺ T-Zellen, die kompatibel zwei oder mehr Funktionen übertragen können, einschließlich Zytokinsekretion und Degranulation, werden bei spezifischer Stimulation auf Einzelzellebene als polyfunktionelle T-Zellen (T_PFs) charakterisiert⁸. CD4⁺ T-Zellen, die einzelne oder mehrere Zytokine produzieren, können verschiedene Wirkungen und Immungedächtnisse haben. Zum Beispiel bilden IL-2+ IFN-γ⁺ CD4+ T-Zellen eher eine langfristig wirksame Schutzreaktion als IL-2+ CD4⁺ T-Zellen⁹, was als wichtiger Parameter zur Bewertung des Impfeffekts verwendet werden kann. Die Häufigkeit von IL-2+ IFN-γ⁺ CD4+ T-Zellen ist bei Patienten mit langfristiger Nicht-Progression des erworbenen Immunschwächesyndroms (AIDS) erhöht, während CD4⁺ T-Zellen bei Patienten mit AIDS-Progression aufgrund der fördernden Wirkung von IL-2 auf die T-Zellproliferation^eher dazu neigen, IFN-γ allein zu produzieren. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass eine Untergruppe von IL-2⁺ IFN-γ+ TNF-α⁺ langfristig in vivo überlebt und die Tötungsfunktion synergistisch fördert¹¹. Obwohl CD8+ T-Zellen eher zytotoxische Aktivität aufweisen, sind einige CD4⁺ T-Zellen auch mit zytotoxischer Aktivität als indirekt nachgewiesene Expression von Oberflächen-CD107a-Molekülen^{ausgestattet 12}. Darüber hinaus exprimieren bestimmte T-Zell-Untergruppen das Chemokin MIP-1α, das oft von Monozyten sezerniert wird, um an der T-Zell-vermittelten Neutrophilenrekrutierung teilzunehmen¹³. In ähnlicher Weise können CD8⁺ T_PFs auch verwendet werden, um die Vielseitigkeit der oben genannten Marker zu charakterisieren. Studien haben gezeigt, dass die Prime-Boost-Strategie effektiv einen längeren Zeitraum von T-PF-Schutzwirkungen induzieren kann¹³, was den durch die Impfung hervorgerufenen Schutz verstärken kann. Ein zentrales Merkmal bei der Untersuchung des Immunsystems ist die Fähigkeit von Gedächtnis-T-Zellen, stärkere, schnellere und effektivere Reaktionen auf sekundäre virale Herausforderungen zu ermöglichen als naive T-Zellen. Effektorgedächtnis-T-Zellen (T EM) und zentrale Gedächtnis-T-Zellen (T CM) sind wichtige T-Zell-Untergruppen, die oft durch die zusammengesetzte Expression von CD27/CD45RO oder CCR7/_CD45RA ¹⁴ unterschieden werden. T_CM (CD27+ CD45RO+ oder CCR7+ CD45RA-) neigt dazu, sich in sekundären lymphatischen Geweben zu lokalisieren, während T_EM (CD27- CD45RO⁺ oder CCR7- CD45RA^-) in lymphatischen und peripheren Geweben lokalisiert^15,16. T_EM bietet eine sofortige, aber nicht anhaltende Abwehr, während T_CM die Reaktion aufrechterhält, indem es sich in den sekundären lymphatischen Organen vermehrt und neue Effektoren erzeugt¹⁷. Da Gedächtniszellen spezifische und effiziente Erinnerungsreaktionen auf Viren vermitteln können, stellen sich Fragen nach dem Beitrag dieser Untergruppe von Polyfunktionen.

Mit der Entwicklung der Durchflusszytometrie-Technologie ist es üblich geworden, Marker von mehr als 10 Clustern, Phänotypen und Differenzierungsantigenen gleichzeitig zu erkennen, was vorteilhaft ist, um die funktionellen immunologischen Merkmale einzelner T-Zellen besser zu kommentieren, um Fehlinterpretationen und Schwierigkeiten beim Verständnis von T-Zell-Phänotypen zu reduzieren. Diese Studie verwendete Ex-vivo-Stimulation und Durchflusszytometrie, um_T-PF-Profile in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) bei JEV-geimpften Kindern zu analysieren. Mit diesem Ansatz wird das Verständnis der kurz- und langfristigen JEV-spezifischen und sogar kreuzreaktiven T-Zell-Immunität, die durch Impfung induziert wird, erweitert.

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Protokoll

Die ethische Genehmigung für die vorliegende Studie wurde von der Ethikkommission des Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, erhalten (Zulassungsnummer: 2020-k-85). Freiwillige wurden vom Beijing Children's Hospital der Capital Medical University rekrutiert. Periphere venöse Blutproben wurden von scheinbar gesunden Kindern (2 Jahre alt) entnommen, die zuvor weniger als ein halbes Jahr lang eine Prime- und Boost-Impfung mit lebend-attenuiertem JE SA14-14-2-Impfstoff erhalten hatten (JE-geimpfte Kinder, n = 5) und ungeimpfte Kinder (6 Monate alt, n = 5). Auf die Einwilligung des Menschen wurde verzichtet, da in dieser Studie nur die Restproben verwendet wurden, nachdem sie klinisch getestet wurden. Um die Privatsphäre der Freiwilligen zu schützen, wurden alle Daten vollständig anonymisiert und anonymisiert.

1. Isolierung von PBMCs aus peripherem venösem Blut

1. Sammeln Sie periphere venöse Blutproben (2 ml) von JE-geimpften und ungeimpften Kindern in EDTA-K 2-antikoagulierten Röhrchen (siehe Materialtabelle) mit der Standard-Venenpunktionstechnik¹⁸.
2. Fügen Sie 2 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1x PBS) hinzu, um das periphere Blut zu verdünnen.
   HINWEIS: Der Prozess wird so schnell wie möglich durchgeführt, um die maximale Überlebensfähigkeit zu erhalten.
3. 4 ml des Dichtegradientenmediums (siehe Materialtabelle) in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen geben und das verdünnte Blut langsam in die obere Schicht des Trennmediums überführen.
   HINWEIS: Mischen Sie das Blut nicht mit dem Trennmedium und zerstören Sie nicht die Kontaktfläche, die von den beiden Flüssigkeiten gebildet wird. Andernfalls wird der Trenneffekt nicht erreicht.
4. Bei 800 × g 20 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Beobachten Sie die signifikanten Schichten nach dem Zentrifugieren.
5. Die PBMCs (die mittlere Schicht) werden in ein weiteres 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und die PBMCs mit 10 ml RPMI-1640-Medium gewaschen, das 10% fötales Rinderserum enthält (FBS, siehe Materialtabelle).
6. Bei 800 × g 10 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand mit einer Pipette vorsichtig entsorgen.
7. Resuspendieren Sie die PBMCs mit 1 ml RPMI-1640-Medium, das 10% FBS enthält, und zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Trypanblau-basierten Zähler (siehe Materialtabelle).

2. Stimulation von PBMCs durch inaktivierte JEV-Partikel zur Induktion der Zytokinexpression

1. Legen Sie zwei Untergruppen der JEV-Stimulations- und Kontrollgruppen in den JE-geimpften bzw. ungeimpften Proben fest.
2. Stellen Sie die Anzahl der PBMCs auf 2 × 10 6 Zellen/ml mit RPMI-1640-Medium mit 10 % FBS ein und säen Sie die PBMCs in 24-Well-Platten (2 × 10⁶ Zellen/1 ml Medium pro Well); Impfen Sie drei Brunnen für jede Gruppe.
3. Stimulation der PBMCs der JEV-Stimulationsgruppe mit konzentrierten inaktivierten JEV-Partikeln 5 (2 × 10⁵ PFU) für 16 h bei 37 °C in Gegenwart der monoklonalen Antikörper CD28 (1 μg/ml, 1:1.000) und CD49d (1 μg/ml), GolgiPlug (1 μg/ml, 1:1.000) und Monensin (1 μg/ml, 1:1.000). Verwenden Sie zur Oberflächenfärbung BV605-anti-CD107a (1 μg/ml, 1:1.000) (siehe Materialtabelle).
   ANMERKUNG: Der JEV wurde durch UV-Bestrahlung inaktiviert, wie zuvor beschrieben¹⁹.
4. Stimulierung der PBMCs der Kontrollgruppe ohne konzentrierte Viruspartikel für 16 h bei 37 °C in Gegenwart der monoklonalen Antikörper CD28 (1 μg/ml, 1:1.000) und CD49d (1 μg/ml, 1:1.000), GolgiPlug (1 μg/ml, 1:1.000) und Monensin (1 μg/ml, 1:1.000). Färben Sie die Oberfläche mit BV605-anti-CD107a (1 μg/ml, 1:1.000).

3. Ex-vivo intrazelluläre Färbung

1. Sammeln Sie die Zellsuspension von jeder Gruppe in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, zentrifugieren Sie bei 500 × g für 5 min bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette.
2. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml 1x PBS, fügen Sie fixierbaren Lebensfähigkeitsfarbstoff (1 μL / ml, 1:1.000, siehe Materialtabelle) zur Zellsuspension hinzu und inkubieren Sie für 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. Bei 500 × g (bei Raumtemperatur) 5 min zentrifugieren und den Überstand entfernen.
3. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml 1x PBS. Bei 500 × g (bei Raumtemperatur) 5 min zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand vorsichtig.
4. Führen Sie eine Zelloberflächenmarkerfärbung durch.
   1. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μL 1x PBS und fügen Sie der Zellsuspension in jedem Röhrchen 2 μL jedes Oberflächenmarker-Antikörpers (BV650-anti-CD3, BUV395-anti-CD4, BV421-anti-CD8, BUV737-anti-CD27 und BV480-anti-CD45RO, Verdünnungsfaktor: 1:50, siehe Materialtabelle) hinzu.
      HINWEIS: Das Farbfluoreszenz-Antikörper-Färbeprotokoll ist in Tabelle 1 dargestellt.
   2. Die Röhrchen (Schritt 3.4.1) 30 min bei Raumtemperatur inkubieren und vor Licht schützen. Bei 500 × g 5 min zentrifugieren und den Überstand entfernen.
      HINWEIS: Der Antikörper von BUV737-anti-CD27 und BV480-anti-CD45RO kann durch BUV737-anti-CCR7 und BV480-anti-CD45RA als Annotation der Gedächtnis-T-Zellen ersetzt werden.
5. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml 1x PBS. Bei 500 × g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand vorsichtig.
6. Führen Sie eine Fixierung und einen Membranbruch durch.
   1. Resuspendieren Sie die Zellen mit 500 μL membranbrechender Fixierlösung (siehe Materialtabelle) und fixieren Sie die Zellen für 20 min im Dunkeln bei Raumtemperatur. Bei 500 × g 5 min zentrifugieren und den Überstand entfernen.
7. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml 1x PBS. 5 min bei 500 × g bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand vorsichtig entfernen.
8. Führen Sie eine intrazelluläre Zytokinfärbung durch.
   1. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μL 1x PBS und geben Sie 2 μL jedes Zytokin-Antikörpers (FITC-anti-IFN-γ, PE-anti-TNF-α, BV785-anti-IL-2 und APC-anti-MIP-1α, Verdünnungsfaktor: 1:50, siehe Materialtabelle) zur Zellsuspension in jedem Röhrchen.
      HINWEIS: Die Volumina und Informationen zu fluorophorkonjugierten Antikörpern sind in Tabelle 1 aufgeführt.
   2. Die Röhrchen (Schritt 3.8.1) 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Bei 500 × g 5 min zentrifugieren und den Überstand entfernen.
9. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml 1x PBS. Bei 500 × g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand vorsichtig entfernen. Fügen Sie 500 μL 1x PBS hinzu, um die Zellen zu resuspendieren.

4. Einrichtung der Durchflusszytometrie

1. Isolieren Sie die PBMC-Probe allein, indem Sie die in Schritt 1 beschriebenen Verfahren als Kontrollstichprobe ausführen. Teilen Sie die Zellsuspension in 12 gleiche Teile in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (100 μL / Röhrchen), wie unten erwähnt.
   1. Stellen Sie ungefärbte, APC-Cy7-live/dead fixierbare gefärbte, BV650-anti-CD3 einfach gefärbte, BUV395-anti-CD4 einfach gefärbte, BV421-anti-CD8 einfach gefärbte, BUV737-anti-CD27 einfach gefärbte, BV480-anti-CD45RO gefärbt, BV605-anti-CD107a, FITC-anti-IFN-γ gefärbt, PE-anti-TNF-α einfach gefärbt, BV785-anti-IL-2 einfach gefärbt und APC-anti-MIP-1α einfach gefärbte Proben auf.
2. Fügen Sie die Zelloberflächenmarker und die intrazelluläre Zytokinfärbung wie in Schritt 3 beschrieben hinzu. Fügen Sie für jede einzelne Färbeprobe nur einen der Fluorophore aus dem Färbeschritt hinzu. Fügen Sie 500 μL 1x PBS hinzu, um die Zellen und den Wirbel mit niedriger Geschwindigkeit zu resuspendieren.
3. Passen Sie mit einer ungefärbten Probe die Vorwärtsstreuung (FSC), die Seitenstreuung (SSC) und die verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffspannungen an.
   HINWEIS: Für die vorliegende Studie wurden die folgenden Spannungen eingestellt. FSC: 440 V, SSC: 233 V, BV650: 575 V, APC-Cy7: 449 V, BUV395: 500 V, BV421: 402 V, BUV737: 585 V, BV480: 444 V, BV605: 457 V, FITC: 475 V, PE: 469 V, APC: 623 V und BV785: 725 V.
4. Passen Sie die Durchflusszytometrie-Kompensation mithilfe der Einzelfärbungsproben an, um die Kontaminationssignale zwischen den verschiedenen Fluorophoren zu eliminieren.
   HINWEIS: Die Kompensationsparameter sind in Tabelle 2 aufgeführt.

5. Gating-Strategie und Datenanalyse

ANMERKUNG: In der vorliegenden Studie wurden für diese Analyse die zentralen Gedächtnis-T-Zellen (T_CM von CD8+ oder CD4+ T-Zellen als CD27+ CD45RO+ oder CCR7+ CD45RA- und die Effektorgedächtnis-T-Zellen (T_EM) von CD8+ oder CD4+ T-Zellen als CD27- CD45RO⁺ oder CCR7^- CD45RA^- definiert¹⁶.

1. Zeichnen Sie ein Polygongatter durch das FSC-Area (FSC-A)/SSC-Area (SSC-A) Punktdiagramm, um die intakte Lymphozytenpopulation auszuwählen und dabei die Trümmer auszuschließen (Abbildung 1A).
2. Zeichnen Sie ein rechteckiges Tor durch das FSC-A/FSC-width (FSC-W)-Punktdiagramm, um die einzelnen Zellen auszuwählen (Abbildung 1B).
3. Zeichnen Sie ein rechteckiges Tor durch das Live/Dead/SSC-A-Punktdiagramm, um die lebenden Zellen auszuwählen (Abbildung 1C).
4. Zeichnen Sie ein rechteckiges Tor durch das CD3/SSC-A-Punktdiagramm, um die CD3⁺ T-Zellen zu identifizieren (Abbildung 1D).
5. Zeichnen Sie ein Quad-Gate durch das CD4/CD8-Punktdiagramm, um die CD4+- oder CD8⁺-T-Zellen zu identifizieren (Abbildung 1E).
6. Zeichnen Sie ein Quad-Gate durch das CD45RO/CD27-Punktdiagramm, um die CD4+- oder CD8+-T-Zellen in T_CM (CD27+ CD45RO+) und T_EM (CD27- CD45RO⁺) zu unterteilen (Abbildung 1F-I).
7. Zeichnen Sie die Gatter von CD107a, IFN-γ, TNF-α, IL-2 und MIP-1α aus dem T_CM oder T_EM der CD8+ oder CD4⁺ T-Zellen, um die Frequenz verschiedener Antwortmuster zu bestimmen.
8. Laden Sie die Proben nacheinander auf die Zytometrie. Verwenden Sie ein Stopptor 20, um 1 ×^{10 6} Lymphozyten zu erfassen.
   HINWEIS: Der einzelne Benutzer kann mehr als 1 × 10⁶ Zellen sammeln. Diese Zahl war ein Kompromiss zwischen der benötigten Zeit und der Sammlung von genügend Zellen, um aussagekräftige Ergebnisse zu liefern.

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Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt die Gating-Strategie, mit der die_T-CM- oder_T-EM von CD8+- oder CD4⁺-T-Zellen aus einer repräsentativen JEV-Stimulationsgruppe von JE-geimpften Kindern geteilt wird. Das FSC-A/SSC-A-Punktdiagramm wird verwendet, um Lymphozyten zu identifizieren, und das FSC-A/FSC-W-Punktdiagramm wird verwendet, um einzelne Zellen zu identifizieren. Lebensfähige Zellen werden auf dem Lebend/Toten/SSC-A-Punktdiagramm ausgewählt. Das CD3/SSC-A-Punk...

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Diskussion

Dieses Protokoll stellt eine praktikable Durchflusszytometrie-basierte Nachweismethode für_T-PF-Profile in den PBMCs von Kindern dar, die mit dem JEV-Impfstoff SA14-14-2 geimpft wurden. Diese Studie verwendete die venösen Blut-PBMCs von geimpften und ungeimpften Kindern als Forschungsmaterialien. Mit der Stimulation von PBMCs mit dem JEV-Antigen können diese amplifizierten antigenspezifischen_T-PFsdurch mehrfarbige Durchflusszytometrie-Antikörperfärbung charakterisiert werden. Im Vergleich zur he...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-human CD28	Biolegend	302934	Antibody
anti-human CD49d	Biolegend	304339	Antibody
APC anti-human MIP-1α	BD	551533	Fluorescent antibody
Automated cell counter	BIO RAD	TC20	Cell count
BD FACSymphony A5	BD	A5	flow Cytometry
BUV395 anti-human CD4	BD	563550	Fluorescent antibody
BUV737 anti-human CCR7	BD	741786	Fluorescent antibody
BUV737 anti-human CD27	BD	612829	Fluorescent antibody
BV421 anti-human CD8	Biolegend	344748	Fluorescent antibody
BV480 anti-human CD45RA	BD	566114	Fluorescent antibody
BV480 anti-human CD45RO	BD	566143	Fluorescent antibody
BV605 anti-human CD107a	Biolegend	328634	Fluorescent antibody
BV650 anti-human CD3	BD	563999	Fluorescent antibody
BV785 anti-human IL-2	Biolegend	500348	Fluorescent antibody
Centrifuge Tube	BD Falcon	BD-35209715	15 mL centrifuge tube
Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit	BD	554714	Cell fixation and permeabilization
Density gradient medium	Dakewe	DKW-KLSH-0100	Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium
FITC anti-human IFN-γ	Biolegend	502506	Fluorescent antibody
Gibco Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16000-044	Fetal Bovine Serum
Gibco RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	22400089	cell culture medium
High-speed centrifuge	Sigma	3K15	Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube
High-speed centrifuge	Eppendorf	5424R	Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube
Microcentrifuge tubes	Axygen	MCT-150-C	1.5 mL microcentrifuge tube
PE anti-human TNF-α	Biolegend	502909	Fluorescent antibody
Phosphate Buffered Saline (PBS)	BI	02-024-1ACS	PBS
Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug)	BD	555029	blocks intracellular protein transport processes
Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)	BD	554724	blocks intracellular protein transport processes
Round-bottom test tube	BD Falcon	352235	5 mL test tube
Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit	Beyotime	C0011	Trypan Blue Staining
Zombie NIR Fixable Viability Dye	Biolegend	423106	Dead cell stain