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  • Reimpressões e Permissões

Resumo

O presente protocolo combina estimulação ex vivo e citometria de fluxo para analisar perfis polifuncionais de células T (TPF) em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) em crianças vacinadas com o vírus da encefalite japonesa (JEV). O método de detecção e o esquema de cores da citometria de fluxo de TPFs específicos do JEV foram testados para fornecer uma referência para estudos semelhantes.

Resumo

A imunidade mediada por células T desempenha um papel importante no controle da infecção por flavivírus, seja após a vacinação ou após a infecção natural. A "qualidade" de uma célula T precisa ser avaliada por função, e uma função mais alta está associada a uma proteção imunológica mais poderosa. As células T que podem produzir simultaneamente duas ou mais citocinas ou quimiocinas no nível de célula única são chamadas de células T polifuncionais (TPFs), que medeiam respostas imunes através de uma variedade de mecanismos moleculares para expressar marcadores de degranulação (CD107a) e secretar interferon (IFN)-γ, fator de necrose tumoral (TNF)-α, interleucina (IL)-2 ou proteína inflamatória de macrófagos (MIP)-1α. Há evidências crescentes de que asT PFestão intimamente relacionadas à manutenção da memória e proteção imunológica a longo prazo e que sua proporção aumentada é um importante marcador de imunidade protetora e é importante no controle efetivo da infecção viral e reativação. Esta avaliação aplica-se não só a respostas imunitárias específicas, mas também à avaliação de respostas imunitárias reativas cruzadas. Aqui, tomando o vírus da encefalite japonesa (JEV) como exemplo, o método de detecção e o esquema de cores da citometria de fluxo de TPFespecíficos do JEV produzidos por células mononucleares do sangue periférico de crianças vacinadas contra a encefalite japonesa foram testados para fornecer uma referência para estudos semelhantes.

Introdução

O vírus da encefalite japonesa (JEV) é um importante vírus transmitido por mosquitos pertencente ao gênero Flavivirus da família Flaviviridae1. Muitos países da Ásia-Pacífico há muito enfrentam enormes desafios de saúde pública devido à enorme carga de doenças causadas pela encefalite japonesa (JE), mas isso melhorou drasticamente com a crescente disponibilidade de vários tipos de vacinas2. As respostas imunes protetoras adaptativas evocadas pela infecção natural ou vacinação contribuem para a prevenção e regulação antiviral. A imunidade humoral e a imunidade mediada por células são classificadas como imunidade adaptativa, e a indução da primeira sempre foi considerada uma estratégia-chave no desenho da vacina, embora com compreensão relativamente limitada no passado3. No entanto, o papel da imunidade mediada por células T na limitação da disseminação e depuração do flavivírus tem sido cada vez mais focado e extensivamente estudado4. Além disso, a imunidade das células T não é apenas indispensável nas respostas antivirais específicas do JEV, mas também desempenha um papel proeminente na proteção cruzada contra infecção secundária por flavivírus heterólogos, o que foi demonstrado em estudos anteriores5. Especula-se que esse efeito possa ignorar potenciais efeitos de realce mediados por anticorpos na infecção5. É importante ressaltar que essa imunidade de células T reativas cruzadas é importante, especialmente na ausência de vacinas e medicamentos antivirais contra flavivírus. Embora muitos estudos tenham sido realizados para determinar a contribuição das células T na infecção por JEV em relação às células T CD4+ e CD8+ 6,7, as respectivas linhagens secretoras de citocinas e sua diversificação funcional permanecem indeterminadas, o que significa que a elucidação das funções exatas das células T auxiliares e assassinas é dificultada.

A escala de suas defesas antivirais determina a qualidade das respostas das células T. As células T CD4+ ou CD8+ que podem conferir de forma compatível duas ou mais funções, incluindo secreção e degranulação de citocinas, são caracterizadas como células T polifuncionais (TPFs) após estimulação específica no nível de célula única8. As células T CD4+ que produzem citocinas únicas ou múltiplas podem ter vários efeitos e memórias imunológicas. Por exemplo, as células T IL-2+ IFN-γ+ CD4+ são mais propensas a formar uma resposta protetora eficaz a longo prazo do que as células T IL-2+ CD4+ 9, que podem ser usadas como um parâmetro importante na avaliação do efeito da vacinação. A frequência de IL-2+ IFN-γ+ células T CD4+ está aumentada em pacientes com não progressão a longo prazo da síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), enquanto as células T CD4+ em pacientes com progressão da AIDS estão mais inclinadas a produzir IFN-γ isoladamente devido ao efeito promotor da IL-2 na proliferação de células T10. Além disso, um subconjunto de IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+ demonstrou sobreviver a longo prazo in vivo e promover sinergicamente a função de morte11. Embora as células T CD8+ sejam mais propensas a exibir atividade citotóxica, algumas células T CD4+ também estão equipadas com atividade citotóxica como uma expressão indiretamente detectada de moléculas CD107a de superfície12. Além disso, certos subconjuntos de células T expressam a quimiocina MIP-1α, que é frequentemente secretada pelos monócitos para participar do recrutamento de neutrófilos mediados por células T13. Da mesma forma, o CD8+ TPFs também pode ser usado para caracterizar a versatilidade dos marcadores acima. Estudos têm demonstrado que a estratégia prime-boost pode efetivamente induzir um período prolongado de efeitos protetores da TPF 13, o que pode aumentar a proteção provocada pela vacinação. Uma característica central no exame do sistema imunológico é a capacidade das células T de memória de facilitar respostas mais fortes, rápidas e eficazes a desafios virais secundários do que as células T ingênuas. As células T de memória efetora (T EM) e as células T de memória central (TCM) são subconjuntos importantes de células T que são frequentemente diferenciados pela expressão composta de CD27/CD45RO ou CCR7/CD45RA14. O TCM (CD27+ CD45RO+ ou CCR7+ CD45RA-) tende a se localizar nos tecidos linfoides secundários, enquanto o TEM (CD27- CD45RO+ ou CCR7- CD45RA-) localiza-se nos tecidos linfoides e periféricos 15,16. O TEM fornece defesa imediata, mas não sustentada, enquanto o TCM sustenta a resposta proliferando nos órgãos linfoides secundários e gerando novos efetores17. Assim, dado que as células de memória podem mediar respostas de recordação específicas e eficientes aos vírus, surgem questões sobre a contribuição desse subconjunto de polifunções.

Com o desenvolvimento da tecnologia de citometria de fluxo, tornou-se comum detectar simultaneamente marcadores de mais de 10 clusters, fenótipos e antígenos de diferenciação, o que é benéfico para anotar mais abundantemente as características imunológicas funcionais em células T individuais para reduzir a má interpretação e as dificuldades na compreensão dos fenótipos de células T. Este estudo utilizou estimulação ex vivo e citometria de fluxo para analisar perfis de TPF em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) em crianças vacinadas com JEV. Aplicando essa abordagem, a compreensão da imunidade de células T específica de JEV de curto e longo prazo e até mesmo cruzada reativa induzida pela vacinação será expandida.

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Protocolo

A aprovação ética para o presente estudo foi obtida pelo Comitê de Ética do Hospital Infantil de Pequim, Capital Medical University (Número de Aprovação: 2020-k-85). Os voluntários foram recrutados no Hospital Infantil de Pequim, na Universidade Médica da Capital. Amostras de sangue venoso periférico foram obtidas de crianças aparentemente saudáveis (2 anos de idade) que já haviam recebido uma vacinação primária e reforçada com a vacina JE SA14-14-2 viva atenuada por menos de meio ano (crianças vacinadas com JE, n = 5) e crianças não vacinadas (6 meses de idade, n = 5). O consentimento informado de seres humanos foi dispensado, pois apenas as amostras residuais, após serem testadas clinicamente, foram utilizadas neste estudo. Para proteger a privacidade dos voluntários, todos os dados foram totalmente anonimizados e desidentificados.

1. Isolamento de CMPB do sangue venoso periférico

  1. Coletar amostras de sangue venoso periférico (2 mL) de crianças vacinadas com JE e não vacinadas em tubos EDTA-K 2-anticoagulados (ver Tabela de Materiais) pela técnica padrão de punção venosa18.
  2. Adicione 2 mL de solução salina tamponada com fosfato (1x PBS) para diluir o sangue periférico.
    NOTA: O processo é tratado o mais rapidamente possível para manter a máxima capacidade de sobrevivência.
  3. Adicionar 4 ml do meio gradiente de densidade (ver Tabela de Materiais) a um tubo de centrífuga de 15 ml e transferir lentamente o sangue diluído para a camada superior do meio de separação.
    NOTA: Não misture o sangue com o meio de separação nem destrua a superfície de contacto formada pelos dois líquidos; caso contrário, o efeito de separação não será alcançado.
  4. Centrífuga a 800 × g durante 20 min à temperatura ambiente. Observe as camadas significativas após a centrifugação.
  5. Transfira os PBMCs (a camada intermediária) para outro tubo de centrífuga de 15 mL e lave os PBMCs com 10 mL de meio RPMI-1640 contendo 10% de soro fetal bovino (FBS, ver Tabela de Materiais).
  6. Centrifugar a 800 × g durante 10 min à temperatura ambiente e eliminar cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta.
  7. Ressuspeite os PBMCs com 1 mL de meio RPMI-1640 contendo 10% de FBS e conte as células com um contador automatizado à base de azul de tripano (ver Tabela de Materiais).

2. Estimulação de PBMCs por partículas de JEV inativadas para induzir a expressão de citocinas

  1. Definir dois subgrupos dos grupos de estimulação e controle do JEV nas amostras vacinadas e não vacinadas com JE, respectivamente.
  2. Ajustar o número de PBMCs para 2 × 10 6 células/mL com meio RPMI-1640 contendo 10% de FBS, e semear os PBMCs em placas de 24 poços (2 × 106 células/1 mL de meio por poço); inocular três poços para cada grupo.
  3. Estimular os PBMCs do grupo de estimulação JEV com partículas concentradas inativadas de JEV 5 (2 × 105 PFU) por 16 h a 37 °C na presença de anticorpos monoclonais CD28 (1 μg/mL, 1:1.000) e CD49d (1 μg/mL), GolgiPlug (1 μg/mL, 1:1.000) e monensina (1 μg/mL, 1:1.000). Para coloração superficial, use BV605-anti-CD107a (1 μg/mL, 1:1.000) (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: O JEV foi inativado por irradiação UV conforme descrito anteriormente19.
  4. Estimular os PBMCs do grupo controle sem partículas virais concentradas por 16 h a 37 °C na presença de anticorpos monoclonais CD28 (1 μg/mL, 1:1.000) e CD49d (1 μg/mL, 1:1.000), GolgiPlug (1 μg/mL, 1:1.000) e monensina (1 μg/mL, 1:1.000). Coloração da superfície com BV605-anti-CD107a (1 μg/mL, 1:1.000).

3. Coloração intracelular ex vivo

  1. Recolher a suspensão celular de cada grupo num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, centrifugar a 500 × g durante 5 min à temperatura ambiente e remover o sobrenadante com uma pipeta.
  2. Ressuspeite as células em 1 mL de 1x PBS, adicione corante de viabilidade fixável (1 μL/mL, 1:1.000, ver Tabela de Materiais) à suspensão celular e incube por 10 min à temperatura ambiente no escuro. Centrifugar a 500 × g (à temperatura ambiente) durante 5 min e remover o sobrenadante.
  3. Ressuspeite as células em 1 mL de 1x PBS. Centrífuga a 500 × g (à temperatura ambiente) durante 5 min. Descarte o sobrenadante com cuidado.
  4. Realizar coloração do marcador de superfície celular.
    1. Ressuspeite as células em 100 μL de 1x PBS e adicione 2 μL de cada anticorpo de marcadores de superfície (BV650-anti-CD3, BUV395-anti-CD4, BV421-anti-CD8, BUV737-anti-CD27 e BV480-anti-CD45RO, fator de diluição: 1:50, ver Tabela de Materiais) à suspensão celular em cada tubo.
      NOTA: O protocolo de coloração de anticorpos fluorescentes coloridos é mostrado na Tabela 1.
    2. Incubar os tubos (passo 3.4.1) durante 30 minutos à temperatura ambiente e protegê-los da luz. Centrifugar a 500 × g durante 5 min e remover o sobrenadante.
      NOTA: O anticorpo de BUV737-anti-CD27 e BV480-anti-CD45RO pode ser substituído por BUV737-anti-CCR7 e BV480-anti-CD45RA como a anotação das células T de memória.
  5. Ressuspeite as células em 1 mL de 1x PBS. Centrífuga a 500 × g durante 5 min à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante com cuidado.
  6. Realizar fixação e quebra de membrana.
    1. Ressuspeite as células com 500 μL de solução fixadora que quebra a membrana (ver Tabela de Materiais) e fixe as células durante 20 minutos no escuro à temperatura ambiente. Centrifugar a 500 × g durante 5 min e remover o sobrenadante.
  7. Ressuspeite as células em 1 mL de 1x PBS. Centrifugar durante 5 min a 500 × g à temperatura ambiente e remover cuidadosamente o sobrenadante.
  8. Realizar coloração intracelular de citocinas.
    1. Ressuscite as células em 100 μL de 1x PBS e adicione 2 μL de cada anticorpo de citocina (FITC-anti-IFN-γ, PE-anti-TNF-α, BV785-anti-IL-2 e APC-anti-MIP-1α, fator de diluição: 1:50, ver Tabela de Materiais) à suspensão celular em cada tubo.
      NOTA: Os volumes e informações sobre anticorpos conjugados com fluoróforo são mostrados na Tabela 1.
    2. Incubar os tubos (passo 3.8.1) durante 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. Centrifugar a 500 × g durante 5 min e remover o sobrenadante.
  9. Ressuspeite as células em 1 mL de 1x PBS. Centrifugar a 500 × g durante 5 min à temperatura ambiente e remover cuidadosamente o sobrenadante. Adicione 500 μL de 1x PBS para ressuspender as células.

4. Configuração da citometria de fluxo

  1. Isole a amostra PBMC sozinha seguindo os procedimentos descritos na etapa 1 como a amostra de controle. Divida a suspensão celular em 12 partes iguais em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL (100 μL/tubo), conforme mencionado abaixo.
    1. Configure amostras não coradas, APC-Cy7-live/dead fixable tained, BV650-anti-CD3 single-stained, BUV395-anti-CD4 single-stained, BV421-anti-CD8 single-stained, BUV737-anti-CD27 single-stained, BV480-anti-CD45RO corado, BV605-anti-CD107a, FITC-anti-IFN-γ corado, PE-anti-TNF-α single-stained, BV785-anti-IL-2 single-stapped e APC-anti-MIP-1α single-stained.
  2. Adicione os marcadores da superfície celular e a coloração intracelular das citocinas, conforme descrito na etapa 3. Para cada amostra de coloração única, adicione apenas um dos fluoróforos da etapa de coloração. Adicione 500 μL de 1x PBS para ressuspender as células e o vórtice com baixa velocidade.
  3. Usando uma amostra não corada, ajuste a dispersão frontal (FSC), a dispersão lateral (SSC) e diferentes tensões de corante fluorescente.
    NOTA: Para o presente estudo, foram definidas as seguintes tensões. FSC: 440 V, SSC: 233 V, BV650: 575 V, APC-Cy7: 449 V, BUV395: 500 V, BV421: 402 V, BUV737: 585 V, BV480: 444 V, BV605: 457 V, FITC: 475 V, PE: 469 V, APC: 623 V e BV785: 725 V.
  4. Usando as amostras de coloração única, ajuste a compensação da citometria de fluxo para eliminar os sinais de contaminação entre os diferentes fluoróforos.
    NOTA: Os parâmetros de compensação são mostrados na Tabela 2.

5. Estratégia de bloqueio e análise de dados

NOTA: No presente estudo, para esta análise, as células T de memória central (TCM de células T CD8+ ou CD4+ como CD27+ CD45RO+ ou CCR7+ CD45RA- e as células T efetoras de memória (TEM) de células T CD8+ ou CD4+ como CD27- CD45RO+ ou CCR7- CD45RA- foram definidas, respectivamente16.

  1. Desenhe uma porta de polígono através do gráfico de pontos FSC-area (FSC-A)/SSC-area (SSC-A) para selecionar a população de linfócitos intacta, excluindo os detritos (Figura 1A).
  2. Desenhe uma porta retangular através do gráfico de pontos FSC-A/FSC-width (FSC-W) para selecionar as células individuais (Figura 1B).
  3. Desenhe um portão retangular através do gráfico de pontos live/dead/SSC-A para selecionar as células ativas (Figura 1C).
  4. Desenhe uma porta retangular através do gráfico de pontos CD3/SSC-A para identificar as células T CD3+ (Figura 1D).
  5. Desenhe uma porta quádrupla através do gráfico de pontos CD4/CD8 para identificar as células T CD4+ ou CD8+ (Figura 1E).
  6. Desenhe uma porta quádrupla através do gráfico de pontos CD45RO/CD27 para subdividir as células T CD4+ ou CD8+ em TCM (CD27+ CD45RO+) e TEM (CD27- CD45RO+) (Figura 1F-I).
  7. Desenhe as portas de CD107a, IFN-γ, TNF-α, IL-2 e MIP-1α do TCM ou TEM das células T CD8+ ou CD4+ para determinar a frequência de diferentes padrões de resposta, respectivamente.
  8. Carregue as amostras na citometria sequencialmente. Use um portãode parada 20 para adquirir 1 × 106 linfócitos.
    Observação : O usuário individual pode coletar mais de 1 × 106 células. Esse número foi um compromisso entre o tempo gasto e a coleta de células suficientes para fornecer resultados significativos.

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Resultados

A Figura 1 mostra a estratégia de gating utilizada para dividir o TCM ou TEM de células T CD8+ ou CD4+ de um grupo representativo de estimulação JEV de crianças vacinadas com JE. O gráfico de pontos FSC-A/SSC-A é usado para identificar linfócitos, e o gráfico de pontos FSC-A/FSC-W é usado para identificar células individuais. As células viáveis são selecionadas no gráfico de pontos vivo/morto/SSC-A. O gráfico de pontos CD3/SSC-A é ...

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Discussão

Este protocolo representa um método viável de detecção baseado em citometria de fluxo para perfis de TPF nos PBMCs de crianças vacinadas com a vacina JEV SA14-14-2. Este estudo utilizou como material de pesquisa os PBMCs de sangue venoso de crianças vacinadas e não vacinadas. Com a estimulação de PBMCs com o antígeno JEV,esses PFsT específicos de antígeno amplificados podem ser caracterizados pela coloração de anticorpos de citometria de fluxo multicolorida. Em comparação com o méto...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

R.W. foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82002130), Fundação de Ciências Naturais de Pequim da China (7222059). A ZD.X. foi apoiada pelo Fundo de Inovação CAMS para as Ciências Médicas (2019-I2M-5-026).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
anti-human CD28Biolegend302934Antibody
anti-human CD49dBiolegend304339Antibody
APC anti-human MIP-1αBD551533Fluorescent antibody 
Automated cell counterBIO RADTC20Cell count
BD FACSymphony A5BDA5flow Cytometry
BUV395 anti-human CD4BD563550Fluorescent antibody 
BUV737 anti-human CCR7BD741786Fluorescent antibody 
BUV737 anti-human CD27BD612829Fluorescent antibody 
BV421 anti-human CD8Biolegend344748Fluorescent antibody 
BV480 anti-human CD45RABD566114Fluorescent antibody 
BV480 anti-human CD45ROBD566143Fluorescent antibody 
BV605 anti-human CD107aBiolegend328634Fluorescent antibody 
BV650 anti-human CD3BD563999Fluorescent antibody 
BV785 anti-human IL-2Biolegend500348Fluorescent antibody 
Centrifuge TubeBD FalconBD-3520971515 mL centrifuge tube
Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution KitBD554714Cell fixation and permeabilization
Density gradient mediumDakeweDKW-KLSH-0100Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium
FITC anti-human IFN-γBiolegend502506Fluorescent antibody 
Gibco Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific16000-044Fetal Bovine Serum
Gibco RPMI-1640 mediumThermo Fisher Scientific22400089cell culture medium
High-speed centrifugeSigma 3K15Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube
High-speed centrifugeEppendorf5424RCell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube
Microcentrifuge tubesAxygenMCT-150-C1.5 mL microcentrifuge tube
PE anti-human TNF-αBiolegend502909Fluorescent antibody 
Phosphate Buffered Saline (PBS)BI02-024-1ACSPBS
Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug)BD555029blocks intracellular protein transport processes
Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)BD554724blocks intracellular protein transport processes
Round-bottom test tubeBD Falcon3522355 mL test tube
Trypan Blue Staining Cell Viability Assay KitBeyotimeC0011Trypan Blue Staining
Zombie NIR Fixable Viability DyeBiolegend423106Dead cell stain

Referências

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