フローサイトメトリー法 による 日本脳炎ワクチン接種小児における多機能性T細胞の検出

要約

本プロトコルは、 ex vivo 刺激とフローサイトメトリーを組み合わせて、日本脳炎ウイルス(JEV)ワクチン接種小児内の末梢血単核球(PBMC)の多機能T細胞(_TFP)プロファイルを分析します。JEV特異的TPFの検出方法とフローサイトメトリーの配色を試験し、同様の研究の参考資料を提供しました。

要約

T細胞媒介免疫は、ワクチン接種後または自然感染後のフラビウイルス感染の制御に重要な役割を果たします。T細胞の「品質」は機能によって評価する必要があり、より高い機能はより強力な免疫防御と関連しています。単一細胞レベルで2つ以上のサイトカインまたはケモカインを同時に産生できるT細胞は、多機能性T細胞(_TFPs)と呼ばれ、さまざまな分子メカニズムを介して免疫応答を仲介し、脱顆粒マーカー(CD107a)を発現し、インターフェロン(IFN)-γ、腫瘍壊死因子(TNF)-α、インターロイキン(IL)-2、またはマクロファージ炎症タンパク質(MIP)-1αを分泌します。TFPは長期的な免疫記憶と保護の維持に密接に関連しており、その割合の増加は防御免疫の重要なマーカーであり、ウイルス感染と再活性化の効果的な制御に重要であるという証拠が増えています。この評価は、特異的免疫応答だけでなく、交差反応性免疫応答の評価にも適用されます。ここでは、日本脳炎ウイルス(JEV)を例にとり、日本脳炎の予防接種を受けた小児の末梢血単核球によって産生されるJEV特異的_TFPsの検出方法およびフローサイトメトリーの配色を試験し、同様の研究の参考とした。

概要

日本脳炎ウイルス(JEV)は、フラビウイルス科¹に属するフラビウイルス属に属する重要な蚊媒介性ウイルスです。多くのアジア太平洋諸国は、日本脳炎(JE)によって引き起こされる莫大な病気の負担のために長い間大きな公衆衛生上の課題に直面してきましたが、これはさまざまな種類の予防接種の利用可能性の増加とともに劇的に改善されました²。自然感染またはワクチン接種によって引き起こされる適応防御免疫応答は、予防および抗ウイルス調節に寄与する。体液性免疫と細胞性免疫は獲得免疫に分類され、前者の誘導は、過去³では比較的限られた理解しかありませんでしたが、ワクチン設計における重要な戦略として常に見なされてきました。しかし、フラビウイルスの蔓延とウイルスクリアランスを制限する上でのT細胞媒介免疫の役割はますます注目され、広く研究されています⁴。さらに、T細胞免疫は、JEV特異的抗ウイルス反応に不可欠であるだけでなく、以前の研究で実証されている異種フラビウイルスによる二次感染からの交差防御においても重要な役割を果たしています⁵。この効果は、感染症における潜在的な抗体媒介増強効果を回避する可能性があると推測^{されています5}。注目すべきことに、このような交差反応性T細胞免疫は、特にフラビウイルスに対するワクチンおよび抗ウイルス薬が存在しない場合に重要である。CD4⁺およびCD8⁺ T細胞に関してJEV感染におけるT細胞の寄与を決定するために多くの研究が行われてきた^が6,7、サイトカインを分泌するそれぞれの系統とその機能多様化は未定のままであり、これはヘルパーおよびキラーT細胞の正確な機能の解明が妨げられていることを意味する。

それらの抗ウイルス防御の規模は、T細胞応答の質を決定する。サイトカイン分泌および脱顆粒を含む2つ以上の機能を相溶的に付与することができるCD4+またはCD8⁺ T細胞は、単一細胞レベルでの特異的刺激に対して多機能性T細胞(_TFs)として特徴付けられる⁸。単一または複数のサイトカインを産生するCD4⁺ T細胞は、さまざまな効果と免疫記憶を持っている可能性があります。例えば、IL-2+ IFN-γ⁺ CD4+ T細胞^は、IL-2+ CD4⁺ T細胞よりも長期的に有効な防御応答を形成する可能性が高く、ワクチン接種効果を評価する際の重要なパラメータとして使用できます。IL-2+ IFN-γ⁺ CD4+ T細胞の頻度は、後天性免疫不全症候群(AIDS)の長期非進行の患者で増加しますが、エイズ進行患者のCD4⁺ T細胞は、T細胞増殖に対するIL-2の促進効果により、IFN-γ単独で産生する傾向があります¹⁰。さらに、IL-2⁺ IFN-γ+ TNF-α⁺のサブセットは、in vivoで長期間生存し、殺傷機能を相乗的に促進することが示されました¹¹。CD8+ T細胞は細胞傷害活性を示す可能性が高いが、一部のCD4⁺ T細胞は、表面CD107a分子の発現を間接的に検出する¹²として細胞傷害活性も備えている。さらに、特定のT細胞サブセットはケモカインMIP-1αを発現し、これはT細胞媒介好中球動員に関与するために単球によって分泌されることが多い¹³。同様に、CD8⁺ T_PFsは、上記のマーカーの汎用性を特徴付けるためにも使用できます。研究によると、プライムブースト戦略は_{、ワクチン接種によって}誘発される保護を強化することができるTf保護効果¹³の長期間を効果的に誘発することができます。免疫系を調べる際の中心的な特徴は、記憶T細胞がナイーブT細胞よりも二次的なウイルスの課題に対してより強く、より速く、より効果的な応答を促進する能力です。エフェクターメモリーT細胞(T_EM)および中枢メモリーT細胞(T_CM)は、CD27/CD45ROまたはCCR7/CD45RAの複合発現によってしばしば分化される重要なT細胞サブセットである¹⁴。T_CM(CD27+ CD45RO+またはCCR7+ CD45RA-)は二次リンパ組織に局在する傾向があり、T_EM(CD27-CD45RO⁺またはCCR7-CD45RA^-)はリンパ系および末梢組織に局在する^15,16。T_EMは即時の、しかし持続的ではない防御を提供するのに対し、T_CMは、二次リンパ器官で増殖し、新しいエフェクターを生成することによって応答を維持する¹⁷。したがって、メモリセルがウイルスに対する特異的で効率的な想起応答を媒介できることを考えると、この多関数のサブセットの寄与について疑問が生じます。

フローサイトメトリー技術の発展に伴い、10を超えるクラスター、表現型、分化抗原のマーカーを同時に検出することが一般的になり、個々のT細胞の機能的免疫学的特徴をより豊富にアノテーションして、T細胞の表現型の誤解や理解の難しさを減らすのに役立ちます。この研究では、 ex vivo 刺激とフローサイトメトリーを使用して、JEVワクチン接種を受けた子供の末梢血単核細胞(PBMC)の_TFP プロファイルを分析しました。このアプローチを適用することで、ワクチン接種によって誘導される短期および長期のJEV特異的、さらには交差反応性T細胞免疫の理解が拡大されます。

プロトコル

本研究の倫理的承認は、首都医科大学北京小児病院の倫理委員会によって取得されました(承認番号:2020-k-85)。ボランティアは首都医科大学北京小児病院から募集されました。末梢静脈血サンプルは、以前に半年未満の弱毒生JE SA14-14-2ワクチンによるプライムおよびブーストワクチン接種を受けたことがある明らかに健康な子供(2歳)から取得されました(JEワクチン接種の子供、n = 5)およびワクチン未接種の子供(生後6か月、n = 5)。ヒト被験者のインフォームドコンセントは、臨床的にテストされた後の残留サンプルのみがこの研究で使用されたため、放棄されました。ボランティアのプライバシーを保護するために、すべてのデータは完全に匿名化され、匿名化されました。

1.末梢静脈血からのPBMCの分離

1. 標準的な静脈穿刺技術¹⁸によって、EDTA-K 2抗凝固チューブ(材料の表を参照)でJEワクチン接種および未接種の子供から末梢静脈血サンプル(₂ mL)を収集します。
2. 2 mLのリン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)を加えて末梢血を希釈します。.
   注:このプロセスは、最大の存続可能性を維持するためにできるだけ早く処理されます。
3. 4 mLの密度勾配培地( 材料の表を参照)を15 mLの遠沈管に加え、希釈した血液を分離媒体の上層にゆっくりと移します。
   注意: 血液を分離媒体と混合したり、2つの液体によって形成された接触面を破壊したりしないでください。そうしないと、分離効果が得られません。
4. 室温で800 × g で20分間遠心分離します。遠心分離後の重要な層を観察します。
5. PBMC(中間層)を別の15 mL遠心チューブに移し、10%ウシ胎児血清を含む10 mLのRPMI-1640培地でPBMCを洗浄します(FBS、 材料の表を参照)。
6. 室温で800 × g で10分間遠心分離し、上清をピペットで慎重に廃棄します。
7. 10%FBSを含む1 mLのRPMI-1640培地でPBMCを再懸濁し、トリパンブルーベースの自動カウンターで細胞をカウントします(材料の表を参照)。

2. 不活化JEV粒子によるPBMCのサイトカイン発現誘導

1. JEV刺激群と対照群の2つのサブグループを、JEワクチン接種サンプルと非ワクチン接種サンプルにそれぞれ設定します。
2. 10% FBSを含むRPMI-1640培地でPBMCの数を2×10 6細胞/mLに調整し、PBMCを24ウェルプレート(ウェルあたり2×10⁶細胞/ 1 mL培地)に播種します。各グループに3つのウェルを接種します。
3. モノクローナル抗体CD28(1 μg/mL, 1:1,000)およびCD49d(1 μg/mL)、ゴルジプラグ(1 μg/mL、1:1,000)、およびモネンシン(1 μg/mL、1:1,000)の存在下で、濃縮不活化JEV粒子5(2 ×^{10 5 PFU})でJEV刺激群のPBMCを37°Cで16時間刺激します。表面染色には、BV605-抗CD107a(1 μg/mL、1:1,000)を使用してください(材料表を参照)。
   注:JEVは、前述のようにUV照射によって不活性化されました¹⁹。
4. モノクローナル抗体CD28(1 μg/mL、1:1,000)およびCD49d(1 μg/mL、1:1,000)、ゴルジプラグ(1 μg/mL、1:1,000)、およびモネンシン(1 μg/mL、1:1,000)の存在下で、濃縮ウイルス粒子なしで対照群のPBMCを37°Cで16時間刺激します。BV605-抗CD107a(1 μg/mL、1:1,000)で表面を染色します。

3. 生体外 細胞内染色

1. 各群の細胞懸濁液を1.5 mLの微量遠心チューブに集め、室温で5分間500 × g で遠心分離し、ピペットで上清を除去します。
2. 細胞を1 mLの1x PBSに再懸濁し、固定可能な生存率色素(1 μL/mL、1:1,000、 材料の表を参照)を細胞懸濁液に加え、暗所で室温で10分間インキュベートします。500 × g (室温)で5分間遠心分離し、上清を除去します。
3. 細胞を1 mLの1x PBSに再懸濁します。500 × g (室温)で5分間遠心分離します。上清は慎重に捨ててください。
4. 細胞表面マーカー染色を行います。
   1. 細胞を100 μLの1x PBSに再懸濁し、各表面マーカー抗体(BV650-抗CD3、BUV395-抗CD4、BV421-抗CD8、BUV737-抗CD27、およびBV480-抗CD45RO、希釈係数:1:50、 材料の表を参照)を各チューブの細胞懸濁液に2 μL加えます。
      注:カラー蛍光抗体染色プロトコルを 表1に示します。
   2. チューブを室温で30分間インキュベートし(ステップ3.4.1)、光から保護します。500 × g で5分間遠心分離し、上清を除去します。
      注:BUV737-抗CD27およびBV480-抗CD45ROの抗体は、メモリーT細胞のアノテーションとしてBUV737-抗CCR7およびBV480-抗CD45RAに置き換えることができます。
5. 細胞を1 mLの1x PBSに再懸濁します。室温で500 × g で5分間遠心分離します。上清は慎重に捨ててください。
6. 固定と膜破壊を行います。
   1. 細胞を500 μLの膜破壊固定液( 材料の表を参照)で再懸濁し、室温で暗所で20分間細胞を固定します。500 × g で5分間遠心分離し、上清を除去します。
7. 細胞を1 mLの1x PBSに再懸濁します。室温で500× g で5分間遠心分離し、上清を注意深く除去する。
8. 細胞内サイトカイン染色を行う。
   1. 細胞を100 μLの1x PBSに再懸濁し、各サイトカイン抗体(FITC-抗IFN-γ、PE-抗TNF-α、BV785-抗IL-2、およびAPC-抗MIP-1α、希釈係数:1:50、 材料の表を参照)を各チューブの細胞懸濁液に2 μL加えます。
      注:蛍光色素標識抗体の量と情報を 表1に示します。
   2. チューブを暗所で室温で30分間インキュベートします(ステップ3.8.1)。500 × g で5分間遠心分離し、上清を除去します。
9. 細胞を1 mLの1x PBSに再懸濁します。室温で500× g で5分間遠心分離し、上清を注意深く除去する。500 μLの1x PBSを加えて、細胞を再懸濁します。

4. フローサイトメトリーのセットアップ

1. ステップ1で説明されている手順に従って、PBMCサンプルのみをコントロールサンプルとして分離します。下記のように、細胞懸濁液を1.5 mLマイクロ遠心チューブ(100 μL /チューブ)で12等分します。
   1. 非染色、APC-Cy7-生/死固定染色、BV650-抗CD3単一染色、BUV395-抗CD4単一染色、BV421-抗CD8単一染色、BUV737-抗CD27単一染色、BV480-抗CD45RO染色、BV605-抗CD107a、FITC抗IFN-γ染色、PE-抗TNF-α単一染色、BV785-抗IL-2単一染色、およびAPC-抗MIP-1α単一染色サンプルを設定します。
2. ステップ3に記載されているように細胞表面マーカーおよび細胞内サイトカイン染色を追加します。単一染色サンプルごとに、染色ステップの蛍光色素を1つだけ追加します。500 μLの1x PBSを添加して、細胞とボルテックスを低速で再懸濁します。
3. 染色されていないサンプルを使用して、前方散乱(FSC)、側方散乱(SSC)、および異なる蛍光色素電圧を調整します。
   注:本研究では、以下の電圧を設定しました。FSC: 440 V, SSC: 233 V, BV650: 575 V, APC-Cy7: 449 V, BUV395: 500 V, BV421: 402 V, BUV737: 585 V, BV480: 444 V, BV605: 457 V, FITC: 475 V, PE: 469 V, APC: 623 V, and BV785: 725 V.
4. 単一染色サンプルを使用して、フローサイトメトリー補正を調整し、異なる蛍光色素間のコンタミネーションシグナルを排除します。
   メモ: 補正パラメータを 表 2 に示します。

5. ゲーティング戦略とデータ分析

注:本研究では、この解析のために、CD27+ CD45RO+またはCCR7+ CD45RA^-としてCD8⁺または^CD4+ T細胞のセントラルメモリーT細胞(_TCM)をCD27-CD45RO+またはCCR7-CD45RA^-としてCD8+または^CD4+ T細胞のエフェクターメモリーT細胞_(TM)をそれぞれ定義した¹⁶。

1. FSCエリア(FSC-A)/SSCエリア(SSC-A)ドットプロットを通るポリゴンゲートを描画し、破片を除外しながら無傷のリンパ球集団を選択します(図1A)。
2. FSC-A/FSC-幅(FSC-W)ドットプロットを通して長方形のゲートを描画し、単一セルを選択します(図1B)。
3. 生/死/SSC-Aドットプロットに長方形のゲートを描き、生細胞を選択します(図1C)。
4. CD3/SSC-Aドットプロットに長方形のゲートを描き、CD3⁺ T細胞を特定します(図1D)。
5. CD4/CD8ドットプロットを通してクワッドゲートを描画し、CD4⁺ またはCD8⁺ T細胞を特定します(図1E)。
6. CD45RO/CD27ドットプロットを通してクワッドゲートを描き、CD4⁺またはCD8+ T細胞を_TCM(CD27+ CD45RO+)とT_EM(CD27- CD45RO⁺)に細分化します(図1F-I)。
7. CD8⁺またはCD4⁺ T細胞のTCMまたは_TEMからCD107a、IFN-γ、TNF-α、IL-2、およびMIP-1αのゲートを描画して、それぞれ異なる応答パターンの頻度を決定します。
8. サンプルをサイトメトリーに順次ロードします。停止ゲート²⁰ を使用して、1×10⁶ リンパ球を獲得する。
   注:個々のユーザーは、10^{個の6セル} ×1個以上を収集できます。この数値は、意味のある結果を提供するのに十分なセルの収集にかかる時間との間の妥協点でした。

結果

図1は、CD8⁺またはCD4⁺ T細胞のTCMまたは_TMをJEワクチン接種小児の代表的なJEV刺激群から分割するために用いられるゲーティング戦略を示す。 FSC-A/SSC-Aドットプロットはリンパ球の同定に使用され、FSC-A/FSC-Wドットプロットは単一細胞の同定に使用されます。生細胞は、生/死/SSC-Aドットプロットで選択されます。CD3/SSC-Aドットプロットは、CD...

ディスカッション

このプロトコルは、JEVワクチンSA14-14-2を接種した小児のPBMCにおける_TFP プロファイルの実行可能なフローサイトメトリーベースの検出方法を表しています。この研究では、ワクチン接種を受けた子供と予防接種を受けていない子供の両方の静脈血PBMCを研究資料として使用しました。JEV抗原によるPBMCの刺激により、増幅された抗原特異的_TFPsは、多色フローサイトメトリー抗体?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-human CD28	Biolegend	302934	Antibody
anti-human CD49d	Biolegend	304339	Antibody
APC anti-human MIP-1α	BD	551533	Fluorescent antibody
Automated cell counter	BIO RAD	TC20	Cell count
BD FACSymphony A5	BD	A5	flow Cytometry
BUV395 anti-human CD4	BD	563550	Fluorescent antibody
BUV737 anti-human CCR7	BD	741786	Fluorescent antibody
BUV737 anti-human CD27	BD	612829	Fluorescent antibody
BV421 anti-human CD8	Biolegend	344748	Fluorescent antibody
BV480 anti-human CD45RA	BD	566114	Fluorescent antibody
BV480 anti-human CD45RO	BD	566143	Fluorescent antibody
BV605 anti-human CD107a	Biolegend	328634	Fluorescent antibody
BV650 anti-human CD3	BD	563999	Fluorescent antibody
BV785 anti-human IL-2	Biolegend	500348	Fluorescent antibody
Centrifuge Tube	BD Falcon	BD-35209715	15 mL centrifuge tube
Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit	BD	554714	Cell fixation and permeabilization
Density gradient medium	Dakewe	DKW-KLSH-0100	Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium
FITC anti-human IFN-γ	Biolegend	502506	Fluorescent antibody
Gibco Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16000-044	Fetal Bovine Serum
Gibco RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	22400089	cell culture medium
High-speed centrifuge	Sigma	3K15	Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube
High-speed centrifuge	Eppendorf	5424R	Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube
Microcentrifuge tubes	Axygen	MCT-150-C	1.5 mL microcentrifuge tube
PE anti-human TNF-α	Biolegend	502909	Fluorescent antibody
Phosphate Buffered Saline (PBS)	BI	02-024-1ACS	PBS
Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug)	BD	555029	blocks intracellular protein transport processes
Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)	BD	554724	blocks intracellular protein transport processes
Round-bottom test tube	BD Falcon	352235	5 mL test tube
Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit	Beyotime	C0011	Trypan Blue Staining
Zombie NIR Fixable Viability Dye	Biolegend	423106	Dead cell stain