JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול הנוכחי משלב גירוי ex vivo וציטומטריה של זרימה כדי לנתח פרופילים של תאי T פוליפונקציונליים (T PF) בתאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) בתוך ילדים שחוסנו בנגיף דלקת המוח היפנית (JEV). שיטת הזיהוי וסכמת הצבעים של ציטומטריה של TPFs ספציפיים ל- JEV נבדקו כדי לספק סימוכין למחקרים דומים.

Abstract

חסינות בתיווך תאי T ממלאת תפקיד חשוב בשליטה על זיהום בנגיף הפלבי, לאחר חיסון או לאחר הדבקה טבעית. יש להעריך את "איכותו" של תא T לפי תפקוד, ותפקוד גבוה יותר נקשר להגנה חזקה יותר על מערכת החיסון. תאי T שיכולים לייצר בו-זמנית שני ציטוקינים או כימוקינים או כימוקינים ברמת התא הבודד נקראים תאי T רב-תפקודיים (TPFs), אשר מתווכים תגובות חיסוניות באמצעות מגוון מנגנונים מולקולריים כדי לבטא סמני פירוק (CD107a) ולהפריש אינטרפרון (IFN)-γ, גורם נמק גידולי (TNF)-α, אינטרלוקין (IL)-2, או חלבון דלקתי מקרופאגים (MIP)-1α. ישנן עדויות הולכות וגוברות לכך ש- TPFs קשורים קשר הדוק לשמירה על זיכרון חיסוני לטווח ארוך והגנה וכי שיעורם המוגבר הוא סמן חשוב של חסינות מגן והוא חשוב בשליטה יעילה של זיהום ויראלי והפעלה מחדש. הערכה זו חלה לא רק על תגובות חיסוניות ספציפיות, אלא גם על הערכת תגובות חיסוניות צולבות. כאן, אם ניקח את נגיף דלקת המוח היפנית (JEV) כדוגמה, נבדקה שיטת הזיהוי וסכמת הצבעים הציטומטריה של TPFספציפי ל- JEV המיוצר על ידי תאי דם חד-גרעיניים היקפיים של ילדים שחוסנו נגד דלקת המוח היפנית כדי לספק התייחסות למחקרים דומים.

Introduction

נגיף דלקת המוח היפנית (JEV) הוא נגיף חשוב המועבר על ידי יתושים השייך לסוג Flavivirus בתוך משפחת Flaviviridae1. מדינות רבות באסיה-פסיפיק מתמודדות זה זמן רב עם אתגרים עצומים בבריאות הציבור בשל נטל התחלואה העצום הנגרם על ידי דלקת המוח היפנית (JE), אך זה השתפר באופן דרמטי עם הזמינות הגוברת של סוגים שונים של חיסונים2. תגובות חיסוניות הגנתיות נרכשות המעוררות על ידי זיהום טבעי או חיסון תורמות למניעה ולוויסות אנטי-ויראלי. חסינות הומורלית וחסינות תאית מסווגות כחסינות מסתגלת, והאינדוקציה של הראשונה תמיד נחשבה לאסטרטגיה מרכזית בתכנון חיסונים, אם כי עם הבנה מוגבלת יחסית ב-3 האחרונים. עם זאת, התפקיד של חסינות בתיווך תאי T בהגבלת הפצת נגיף הפלבי וסילוק הנגיף התמקד יותר ויותר ונחקר בהרחבה4. יתר על כן, חסינות תאי T היא לא רק הכרחית בתגובות אנטי-ויראליות ספציפיות ל-JEV, אלא גם ממלאת תפקיד בולט בהגנה צולבת מפני זיהום משני בנגיפי פלבי הטרולוגיים, שהוכח במחקרים קודמים5. משערים כי השפעה זו עשויה לעקוף השפעות שיפור פוטנציאליות בתיווך נוגדנים בזיהום5. יש לציין כי חסינות תאי T צולבת כזו חשובה, במיוחד בהיעדר חיסונים ותרופות אנטי-ויראליות נגד נגיפי פלבי. למרות שמחקרים רבים בוצעו כדי לקבוע את התרומה של תאי T בזיהום JEV ביחס לתאי CD4+ ו- CD8+ T6,7, השושלות המתאימות המפרישות ציטוקינים והגיוון התפקודי שלהם נותרו בלתי מוגדרות, כלומר הבהרת הפונקציות המדויקות של תאי T מסייעים והורגים מתעכבת.

קנה המידה של ההגנות האנטי-ויראליות שלהם קובע את איכות התגובות של תאי T. תאי CD4+ או CD8+ T שיכולים להעניק באופן תואם שתי פונקציות או יותר, כולל הפרשת ציטוקינים ודה-גרנולציה, מאופיינים כתאי T רב-תכליתיים (TPFs) על גירוי ספציפי ברמת התא הבודד8. לתאי CD4+ T המייצרים ציטוקינים בודדים או מרובים עשויות להיות השפעות שונות וזיכרונות חיסוניים. לדוגמה, תאי IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T נוטים יותר ליצור תגובת הגנה יעילה לטווח ארוך מאשר תאי IL-2+ CD4+ T9, שיכולים לשמש כפרמטר חשוב בהערכת אפקט החיסון. התדירות של IL-2+ IFN-γ+ CD4+ תאי T מוגברת בחולים עם אי-התקדמות ארוכת טווח של תסמונת מחסור חיסוני נרכש (איידס), בעוד שתאי CD4+ T בחולים עם התקדמות איידס נוטים יותר לייצר IFN-γ בלבד בשל ההשפעה המקדמת של IL-2 על התפשטות תאי T10. יתר על כן, תת-קבוצה של IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+ הוכחה כשורדה לטווח ארוך in vivo ומקדמת בסינרגיה את פונקציית ההרג11. למרות שתאי CD8+ T נוטים יותר להפגין פעילות ציטוטוקסית, חלק מתאי CD4+ T מצוידים גם בפעילות ציטוטוקסית כביטוי שזוהה בעקיפין של מולקולות CD107a על פני השטח12. בנוסף, תת-קבוצות מסוימות של תאי T מבטאות את הכימוקין MIP-1α, שלעתים קרובות מופרש על ידי מונוציטים כדי להשתתף בגיוס נויטרופילים בתיווך תאי T13. באופן דומה, CD8+ TPFs יכול לשמש גם כדי לאפיין את הרבגוניות של הסמנים לעיל. מחקרים הראו כי אסטרטגיית הדחיפה הראשונית יכולה לגרום ביעילות לתקופה ממושכת של השפעות מגןT PF 13, אשר יכול לשפר את ההגנה שמעורר החיסון. מאפיין מרכזי בבחינת מערכת החיסון הוא היכולת של תאי זיכרון מסוג T לאפשר תגובות חזקות, מהירות ויעילות יותר לאתגרים נגיפיים משניים מאשר תאי T נאיביים. תאי T של זיכרון אפקטים (TEM) ותאי זיכרון T מרכזיים (TCM) הם תת-קבוצות חשובות של תאי T שלעתים קרובות מתמיינות על ידי הביטוי המורכב של CD27/CD45RO או CCR7/CD45RA14. TCM (CD27+ CD45RO+ או CCR7+ CD45RA-) נוטה להתמקם ברקמות לימפה משניות, בעוד ש- TEM (CD27- CD45RO+ או CCR7- CD45RA-) מתמקם ברקמות לימפואידיות והיקפיות15,16. TEM מספק הגנה מיידית אך לא מתמשכת, ואילו TCM מקיים את התגובה על ידי שגשוג באיברי הלימפה המשניים ויצירת אפקטים חדשים17. לפיכך, בהתחשב בכך שתאי זיכרון יכולים לתווך תגובות היזכרות ספציפיות ויעילות לווירוסים, מתעוררות שאלות לגבי תרומתה של תת-קבוצה זו של פוליפונקציות.

עם התפתחות טכנולוגיית ציטומטריה של זרימה, זה הפך נפוץ לזהות בו זמנית סמנים של יותר מ -10 אשכולות, פנוטיפים ואנטיגנים התמיינות, אשר מועיל לבאר בשפע רב יותר את התכונות החיסוניות הפונקציונליות על תאי T בודדים כדי להפחית פרשנות שגויה וקשיים בהבנה של פנוטיפים של תאי T. מחקר זה השתמש בגירוי ex vivo ובציטומטריית זרימה כדי לנתח פרופיליT PF בתאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) בקרב ילדים שחוסנו ב-JEV. ביישום גישה זו, תורחב ההבנה של חסינות תאי T ספציפיים ל-JEV לטווח קצר וארוך ואף צולבת הנגרמת על ידי חיסון.

Protocol

אישור אתי למחקר הנוכחי התקבל על ידי ועדת האתיקה של בית החולים לילדים בבייג'ינג, האוניברסיטה הרפואית קפיטל (מספר אישור: 2020-k-85). מתנדבים גויסו מבית החולים לילדים בבייג'ינג, האוניברסיטה הרפואית קפיטל. דגימות דם ורידי היקפי התקבלו מילדים בריאים לכאורה (בני שנתיים) שקיבלו בעבר חיסון ראשוני ומוגבר עם חיסון JE SA14-14-2 מוחלש במשך פחות מחצי שנה (ילדים מחוסנים ב-JE, n = 5) וילדים לא מחוסנים (6 חודשים, n = 5). הסכמה מדעת של נבדקים אנושיים ויתרה מכיוון שרק שאריות הדגימות, לאחר שנבדקו קלינית, שימשו במחקר זה. כדי להגן על פרטיות המתנדבים, כל הנתונים עברו אנונימיזציה מלאה וביטול זיהוי.

1. בידוד של PBMCs מדם ורידי היקפי

  1. איסוף דגימות דם ורידי היקפי (2 מ"ל) מילדים מחוסני JE ולא מחוסנים בצינורות נוגדי קרישהEDTA-K 2 (ראו טבלת חומרים) בטכניקת הדיקור הוורידי הסטנדרטית18.
  2. יש להוסיף 2 מ"ל של תמיסת מלח עם אגירת פוספטים (1x PBS) כדי לדלל את הדם ההיקפי.
    הערה: התהליך מטופל בהקדם האפשרי כדי לשמור על שרידות מרבית.
  3. הוסף 4 מ"ל של מדיום שיפוע הצפיפות (ראה טבלת חומרים) לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל, והעבר באיטיות את הדם המדולל לשכבה העליונה של מדיום ההפרדה.
    הערה: אין לערבב את הדם עם מדיום ההפרדה או להרוס את משטח המגע שנוצר על ידי שני הנוזלים; אחרת, אפקט ההפרדה לא יושג.
  4. צנטריפוגה ב 800 × גרם במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. שימו לב לשכבות המשמעותיות לאחר הצנטריפוגה.
  5. העבירו את ה-PBMCs (השכבה האמצעית) לצינור צנטריפוגות נוסף של 15 מ"ל, ושטפו את ה-PBMCs ב-10 מ"ל של מדיום RPMI-1640 המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS, ראו טבלת חומרים).
  6. צנטריפוגה ב 800 × גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולהשליך את supernatant עם פיפטה בזהירות.
  7. השהה את ה- PBMCs עם 1 מ"ל של מדיום RPMI-1640 המכיל 10% FBS וספור את התאים באמצעות מונה אוטומטי מבוסס טריפן כחול (ראה טבלת חומרים).

2. גירוי של PBMCs על ידי חלקיקי JEV מומתים כדי לגרום לביטוי ציטוקינים

  1. הגדר שתי תת-קבוצות של קבוצות הגירוי והביקורת של JEV בדגימות המחוסנות ב-JE ובדגימות הלא מחוסנות, בהתאמה.
  2. התאם את מספר ה- PBMCs ל- 2 × 10 6 תאים למ"ל עם מדיום RPMI-1640 המכיל 10% FBS, וזרע את ה- PBMCs בלוחות של 24 בארות (2 × 106 תאים / 1 מ"ל בינוני לכל באר); לחסן שלוש בארות לכל קבוצה.
  3. לעורר את ה-PBMCs של קבוצת הגירוי JEV עם חלקיקי JEV מומתים מרוכזים5 (2 × 105 PFU) במשך 16 שעות ב-37 מעלות צלזיוס בנוכחות נוגדנים חד-שבטיים CD28 (1 מיקרוגרם/מ"ל, 1:1,000) ו-CD49d (1 מיקרוגרם/מ"ל), GolgiPlug (1 מיקרוגרם/מ"ל, 1:1,000) ומוננסין (1 מיקרוגרם/מ"ל, 1:1,000). לצביעת משטחים, יש להשתמש ב-BV605-anti-CD107a (1 מיקרוגרם/מ"ל, 1:1,000) (ראו טבלת חומרים).
    הערה: ה- JEV הושבת על ידי קרינת UV כפי שתואר קודםלכן 19.
  4. לעורר את ה-PBMCs של קבוצת הביקורת ללא חלקיקי נגיף מרוכזים במשך 16 שעות ב-37 מעלות צלזיוס בנוכחות נוגדנים חד-שבטיים CD28 (1 מיקרוגרם/מ"ל, 1:1,000) ו-CD49d (1 מיקרוגרם/מ"ל, 1:1,000), GolgiPlug (1 מיקרוגרם/מ"ל, 1:1,000) ומונסין (1 מיקרוגרם/מ"ל, 1:1,000). הכתימו את המשטח ב-BV605-anti-CD107a (1 מיקרוגרם/מ"ל, 1:1,000).

3. מכתים תוך-תאיים Ex vivo

  1. לאסוף את מתלה התא מכל קבוצה בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל, צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולהסיר את supernatant עם פיפטה.
  2. החזירו את התאים ל-1 מ"ל של PBS אחד, הוסיפו צבע הניתן לתיקון (1 μL/mL, 1:1,000, ראו טבלת חומרים) לתלויית התא, ודגרו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. צנטריפוגה ב 500 × גרם (בטמפרטורת החדר) במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant.
  3. השהה את התאים ב-1 מ"ל של PBS אחד. צנטריפוגה ב-500 × גרם (בטמפרטורת החדר) למשך 5 דקות. השליכו בזהירות את הסופר-נטנט.
  4. ביצוע צביעת סמן פני התא.
    1. השהה את התאים ב- 100 μL של 1x PBS, והוסף 2 μL מכל נוגדן סמני פני שטח (BV650-anti-CD3, BUV395-anti-CD4, BV421-anti-CD8, BUV737-anti-CD27 ו- BV480-anti-CD45RO, גורם דילול: 1:50, ראה טבלת חומרים) לתרחיף התא בכל צינור.
      הערה: פרוטוקול צביעת נוגדנים פלואורסצנטיים בצבע מוצג בטבלה 1.
    2. דגירה של הצינורות (שלב 3.4.1) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, והגנה עליהם מפני אור. צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant.
      הערה: ניתן להחליף את הנוגדן של BUV737-anti-CD27 ו- BV480-anti-CD45RO ב- BUV737-anti-CCR7 ו- BV480-anti-CD45RA כביאור של תאי הזיכרון T.
  5. השהה את התאים ב-1 מ"ל של PBS אחד. צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו בזהירות את הסופר-נטנט.
  6. בצע קיבוע ושבירת ממברנה.
    1. החזירו את התאים עם תמיסה מקובעת שוברת ממברנה בנפח 500 מיקרוגרם (ראו טבלת חומרים) וקבעו את התאים למשך 20 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant.
  7. השהה את התאים ב-1 מ"ל של PBS אחד. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 500 × גרם בטמפרטורת החדר ולהסיר את supernatant בזהירות.
  8. ביצוע צביעת ציטוקינים תוך-תאיים.
    1. יש להשעות את התאים ב-100 μL של 1x PBS, ולהוסיף 2 μL מכל נוגדן ציטוקינים (FITC-anti-IFN-γ, PE-anti-TNF-α, BV785-anti-IL-2 ו-APC-anti-MIP-1α, גורם דילול: 1:50, ראה טבלת חומרים) לתרחיף התא בכל צינור.
      הערה: הנפחים והמידע על נוגדנים מצומדים לפלואורופור מוצגים בטבלה 1.
    2. לדגור על הצינורות (שלב 3.8.1) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant.
  9. השהה את התאים ב-1 מ"ל של PBS אחד. צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולהסיר את supernatant בזהירות. הוסף 500 μL של 1x PBS כדי להשעות את התאים.

4. הגדרת ציטומטריה של זרימה

  1. בודד את דגימת ה- PBMC לבדה בהתאם להליכים המתוארים בשלב 1 כדגימת הבקרה. חלק את מתלה התא ל -12 חלקים שווים בצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל (100 μL / צינור) כפי שצוין להלן.
    1. הגדר מוכתם לא מוכתם, APC-Cy7-חי/מת מוכתם, BV650-anti-CD3 מוכתם יחיד, BUV395-anti-CD4 מוכתם יחיד, BV421-anti-CD8 מוכתם יחיד, BUV737-anti-CD27 מוכתם יחיד, BV480-anti-CD45RO מוכתם, BV605-anti-CD107a, FITC-anti-IFN-γ מוכתם, PE-anti-TNF-α מוכתם יחיד, BV785-anti-IL-2 מוכתם יחיד, ו- APC-anti-MIP-1α מוכתם יחיד.
  2. הוסף את סמני פני השטח של התא ואת מכתים הציטוקינים התוך-תאיים כמתואר בשלב 3. עבור כל דגימת צביעה בודדת, הוסיפו רק אחד מהפלואורופורים משלב ההכתמה. הוסף 500 μL של 1x PBS כדי להשעות את התאים ואת המערבולת במהירות נמוכה.
  3. באמצעות דגימה לא מוכתמת, התאם את הפיזור הקדמי (FSC), פיזור הצד (SSC) ומתחי צבע פלואורסצנטיים שונים.
    הערה: עבור המחקר הנוכחי, נקבעו המתחים הבאים. FSC: 440 V, SSC: 233 V, BV650: 575 V, APC-Cy7: 449 V, BUV395: 500 V, BV421: 402 V, BUV737: 585 V, BV480: 444 V, BV605: 457 V, FITC: 475 V, PE: 469 V, APC: 623 V, ו- BV785: 725 V.
  4. באמצעות דגימות צביעה בודדת, התאימו את פיצוי הציטומטריה של הזרימה כדי לחסל את אותות הזיהום בין הפלואורופורים השונים.
    הערה: פרמטרי הפיצוי מוצגים בטבלה 2.

5. אסטרטגיית גטינג וניתוח נתונים

הערה: במחקר הנוכחי, לצורך ניתוח זה, תאי הזיכרון המרכזיים T (TCM של תאי CD8+ או CD4+ T כ-CD27+ CD45RO+ או CCR7+ CD45RA- ותאי הזיכרון המשפיעים (TEM) של תאי CD8+ או CD4+ T כ-CD27- CD45RO+ או CCR7- CD45RA - הוגדרו בהתאמה16.

  1. ציירו שער מצולע דרך חלקת הנקודה של אזור FSC (FSC-A)/SSC-area (SSC-A) כדי לבחור את אוכלוסיית הלימפוציטים השלמה תוך אי-הכללת הפסולת (איור 1A).
  2. צייר שער מלבני דרך מתווה הנקודה FSC-A/FSC-WIDTH (FSC-W) כדי לבחור את התאים הבודדים (איור 1B).
  3. ציירו שער מלבני דרך תרשים הנקודה החי/מת/SSC-A כדי לבחור את התאים החיים (איור 1C).
  4. ציירו שער מלבני דרך מתווה הנקודה CD3/SSC-A כדי לזהות את תאי ה-T של CD3+ (איור 1D).
  5. ציירו שער מרובע דרך מתווה הנקודה CD4/CD8 כדי לזהות את תאי ה-CD4+ או ה-CD8+ T (איור 1E).
  6. ציירו שער מרובע דרך מתווה הנקודה CD45RO/CD27 כדי לחלק את תאי ה-CD4+ או ה-CD8+ T ל-T CM (CD27+ CD45RO+) ול-TEM (CD27- CD45RO+) (איור 1F-I).
  7. צייר את השערים של CD107a, IFN-γ, TNF-α, IL-2 ו- MIP-1α מתאי TCM או TEM של תאי CD8+ או CD4+ T כדי לקבוע את התדירות של דפוסי תגובה שונים, בהתאמה.
  8. העמיסו את הדגימות על הציטומטריה ברצף. השתמש בשער עצירה20 כדי לרכוש 1 × 106 לימפוציטים.
    הערה: המשתמש הבודד יכול לאסוף יותר מ- 1 × 106 תאים. מספר זה היווה פשרה בין הזמן שנדרש לבין איסוף של מספיק תאים כדי לספק תוצאות משמעותיות.

תוצאות

איור 1 מראה את אסטרטגיית ה-gating המשמשת לחלוקת תאי ה-TCM או ה-TEM של תאי CD8+ או CD4+ T מקבוצת גירוי JEV מייצגת של ילדים מחוסני JE. עלילת הנקודה FSC-A/SSC-A משמשת לזיהוי לימפוציטים, ועלילת הנקודה FSC-A/FSC-W משמשת לזיהוי תאים בודדים. תאים בני קיימא נבחרים על עלילת הנקודה החי?...

Discussion

פרוטוקול זה מייצג שיטת זיהוי אפשרית מבוססת ציטומטריה של זרימה עבור פרופיליT PF ב- PBMCs של ילדים שחוסנו בחיסון JEV SA14-14-2. מחקר זה השתמש ב-PBMCs בדם ורידי של ילדים מחוסנים ולא מחוסנים כאחד כחומרי מחקר. עם הגירוי של PBMCs עם אנטיגן JEV, אלה אנטיגן מוגבר ספציפי TPFs יכול להיות מאופיין על ידי כתמים...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

R.W. נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82002130), קרן בייג'ינג למדעי הטבע של סין (7222059). ZD.X. נתמך על ידי קרן החדשנות CAMS למדעי הרפואה (2019-I2M-5-026).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
anti-human CD28Biolegend302934Antibody
anti-human CD49dBiolegend304339Antibody
APC anti-human MIP-1αBD551533Fluorescent antibody 
Automated cell counterBIO RADTC20Cell count
BD FACSymphony A5BDA5flow Cytometry
BUV395 anti-human CD4BD563550Fluorescent antibody 
BUV737 anti-human CCR7BD741786Fluorescent antibody 
BUV737 anti-human CD27BD612829Fluorescent antibody 
BV421 anti-human CD8Biolegend344748Fluorescent antibody 
BV480 anti-human CD45RABD566114Fluorescent antibody 
BV480 anti-human CD45ROBD566143Fluorescent antibody 
BV605 anti-human CD107aBiolegend328634Fluorescent antibody 
BV650 anti-human CD3BD563999Fluorescent antibody 
BV785 anti-human IL-2Biolegend500348Fluorescent antibody 
Centrifuge TubeBD FalconBD-3520971515 mL centrifuge tube
Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution KitBD554714Cell fixation and permeabilization
Density gradient mediumDakeweDKW-KLSH-0100Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium
FITC anti-human IFN-γBiolegend502506Fluorescent antibody 
Gibco Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific16000-044Fetal Bovine Serum
Gibco RPMI-1640 mediumThermo Fisher Scientific22400089cell culture medium
High-speed centrifugeSigma 3K15Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube
High-speed centrifugeEppendorf5424RCell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube
Microcentrifuge tubesAxygenMCT-150-C1.5 mL microcentrifuge tube
PE anti-human TNF-αBiolegend502909Fluorescent antibody 
Phosphate Buffered Saline (PBS)BI02-024-1ACSPBS
Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug)BD555029blocks intracellular protein transport processes
Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)BD554724blocks intracellular protein transport processes
Round-bottom test tubeBD Falcon3522355 mL test tube
Trypan Blue Staining Cell Viability Assay KitBeyotimeC0011Trypan Blue Staining
Zombie NIR Fixable Viability DyeBiolegend423106Dead cell stain

References

  1. Vanden Eynde, C., Sohier, C., Matthijs, S., De Regge, N. Japanese encephalitis virus interaction with mosquitoes: A review of vector competence, vector capacity and mosquito immunity. Pathogens. 11 (3), 317 (2022).
  2. Wang, R., et al. The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study. PLoS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), 0010562 (2022).
  3. Wang, R., et al. Decreases in both the seroprevalence of serum antibodies and seroprotection against Japanese encephalitis virus among vaccinated children. Virologica Sinica. 34 (3), 243-252 (2019).
  4. Wang, R., et al. Neutralizing antibody rather than cellular immune response is maintained for nearly 20 years among Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccinees in an endemic setting. Infection, Genetics and Evolution. 85, 104476 (2020).
  5. Wang, R., et al. T cell immunity rather than antibody mediates cross-protection against Zika virus infection conferred by a live attenuated Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccine. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (15), 6779-6789 (2020).
  6. Redant, V., Favoreel, H. W., Dallmeier, K., Van Campe, W., De Regge, N. Japanese encephalitis virus persistence in porcine tonsils is associated with a weak induction of the innate immune response, an absence of IFNgamma mRNA expression, and a decreased frequency of CD4(+)CD8(+) double-positive T cells. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 834888 (2022).
  7. Jain, N., et al. CD8 T cells protect adult naive mice from JEV-induced morbidity via lytic function. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (2), 0005329 (2017).
  8. Khakhum, N., Bharaj, P., Walker, D. H., Torres, A. G., Endsley, J. J. Antigen-specific antibody and polyfunctional T cells generated by respiratory immunization with protective Burkholderia DeltatonB Deltahcp1 live attenuated vaccines. NPJ Vaccines. 6 (1), 72 (2021).
  9. Weaver, J. M., et al. Increase in IFNgamma(-)IL-2(+) cells in recent human CD4 T cell responses to 2009 pandemic H1N1 influenza. PloS One. 8 (-), 57275 (2013).
  10. Boaz, M. J., Waters, A., Murad, S., Easterbrook, P. J., Vyakarnam, A. Presence of HIV-1 Gag-specific IFN-gamma+IL-2+ and CD28+IL-2+ CD4 T cell responses is associated with nonprogression in HIV-1 infection. Journal of Immunology. 169 (11), 6376-6385 (2002).
  11. Gui, L., et al. IL-2, IL-4, IFN-gamma or TNF-alpha enhances BAFF-stimulated cell viability and survival by activating Erk1/2 and S6K1 pathways in neoplastic B-lymphoid cells. Cytokine. 84, 37-46 (2016).
  12. Terahara, K., et al. Vaccine-induced CD107a+ CD4+ T cells are resistant to depletion following AIDS virus infection. Journal of Virology. 88 (24), 14232-14240 (2014).
  13. Tanyi, J. L., et al. Personalized cancer vaccine strategy elicits polyfunctional T cells and demonstrates clinical benefits in ovarian cancer. NPJ Vaccines. 6 (1), 36 (2021).
  14. Ammirati, E., et al. Effector memory T cells are associated with atherosclerosis in humans and animal models. Journal of the American Heart Association. 1 (1), 27-41 (2012).
  15. Rizk, N. M., Fadel, A., AlShammari, W., Younes, N., Bashah, M. The immunophenotyping changes of peripheral CD4+ T lymphocytes and inflammatory markers of class III obesity subjects after laparoscopic gastric sleeve surgery - A follow-up study. Journal of Inflammation Research. 14, 1743-1757 (2021).
  16. Zhang, Y., et al. Phenotypic and functional characterizations of CD8(+) T cell populations in malignant pleural effusion. Experimental Cell Research. 417 (1), 113212 (2022).
  17. Shin, H., Iwasaki, A. Tissue-resident memory T cells. Immunological Reviews. 255 (1), 165-181 (2013).
  18. Birnie, K. A., Noel, M., Chambers, C. T., Uman, L. S., Parker, J. A. Psychological interventions for needle-related procedural pain and distress in children and adolescents. Cochrane Database of Systematic Reviews. 10 (10), (2018).
  19. Lin, R. J., Liao, C. L., Lin, Y. L. Replication-incompetent virions of Japanese encephalitis virus trigger neuronal cell death by oxidative stress in a culture system. Journal of General Virology. 85, 521-533 (2004).
  20. Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).
  21. Zheng, X., et al. Immune responses and protective effects against Japanese encephalitis induced by a DNA vaccine encoding the prM/E proteins of the attenuated SA14-14-2 strain. Infection, Genetics and Evolution. 85, 104443 (2020).
  22. Zheng, X., et al. Complete protection for mice conferred by a DNA vaccine based on the Japanese encephalitis virus P3 strain used to prepare the inactivated vaccine in China. Virology Journal. 17 (1), 126 (2020).
  23. Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers in Microbiology. 9, 416 (2018).
  24. Meckiff, B. J., et al. Imbalance of regulatory and cytotoxic SARS-CoV-2-reactive CD4(+) T cells in COVID-19. Cell. 183 (5), 1340-1353 (2020).
  25. Ning, R. J., Xu, X. Q., Chan, K. H., Chiang, A. K. Long-term carriers generate Epstein-Barr virus (EBV)-specific CD4(+) and CD8(+) polyfunctional T-cell responses which show immunodominance hierarchies of EBV proteins. Immunology. 134 (2), 161-171 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

187T

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved