小鼠脉络丛的显微切割和全安装扫描电子显微镜可视化

摘要

脉络丛（CP）是神经科学中研究不足的组织，在中枢神经系统的健康和疾病中起着关键作用。该协议描述了用于分离CP的显微切割技术，并使用扫描电子显微镜来获得其细胞结构的整体视图。

摘要

脉络丛（CP）是一种突出到脑室的高度血管化结构，是神经科学中最缺乏研究的组织之一。随着越来越清楚的是，这种微小的结构在中枢神经系统（CNS）的健康和疾病中起着至关重要的作用，因此以允许下游处理的方式正确解剖脑室CP至关重要，从功能到结构分析。这里描述了侧脑室和第四脑室小鼠CP的分离，而无需专门的工具或设备。这种分离技术保留了CP内细胞的活力，功能和结构。由于其高血管化，可以使用双目显微镜可视化漂浮在大脑心室腔内的CP。然而，下游分析所需的经心灌注会使 CP 组织的鉴定复杂化。根据进一步的处理步骤（例如，RNA和蛋白质分析），这可以通过经心灌注溴酚蓝 可视化 CP来解决。分离后，可以使用多种技术（包括RNA，蛋白质或单细胞分析）处理CP，以进一步了解这种特殊大脑结构的功能。在这里，整个安装CP上的扫描电子显微镜（SEM）用于获得结构的整体视图。

引言

紧密的屏障将中枢神经系统 （CNS） 与外围隔离开来，包括血脑屏障 （BBB） 和血脑脊液 （CSF） 屏障。这些屏障保护中枢神经系统免受外部侮辱，并确保平衡和受控的微环境¹，^2，3。虽然BBB随着时间的推移得到了广泛的研究，但位于脉络丛（CP）的血液 - 脑脊液屏障在过去十年中才获得了越来越多的研究兴趣。后一种屏障可以在大脑的四个脑室中找到（图1A，B），其特征在于围绕中央基质的单层脉络丛上皮（CPE）细胞，渗漏的毛细血管，成纤维细胞以及淋巴和骨髓细胞群（图1C）⁴，^5，6.CPE细胞通过紧密的连接牢固地相互连接，从而防止从下面的开窗毛细血管渗漏到脑脊液和大脑中。此外，通过CPE细胞的运输受到许多向内和向外运输系统的调节，这些系统管理有益化合物（例如，营养物质和激素）从血液流入脑脊液以及有害分子（例如，代谢废物，过量的神经递质）在^{另一个方向的}外排1^，6。为了能够发挥其主动转运功能，CPE细胞在其细胞质中含有许多线粒体⁷。此外，CP是脑脊液的主要来源，并通过常驻炎症细胞的存在充当大脑的守门人¹。由于其在血液和大脑之间的独特位置，CP也非常适合进行免疫监视⁸。

图 1:脉络丛 （CP） 的位置和组成的示意图。 （A，B）CP组织存在于（A）人类和（B）小鼠大脑的两个侧脑室，第三脑室和第四脑室内。（C）CP组织由单层紧密连接的骰骨CP上皮（CPE）细胞组成，围绕开窗毛细血管，松散结缔组织以及淋巴和骨髓细胞，并形成血脑脊液屏障（根据参考^文献23改编和修改）。用 Biorender.com 创建的图。请点击此处查看此图的大图。

在过去的十年中，越来越多的证据，包括我们研究小组的几份报告，表明CP在健康和疾病中起着核心作用⁹，10，¹¹，12，^13，14，15，¹⁶，^17，18.例如，已知老化的血液-脑脊液屏障在细胞核、微绒毛和基底膜^1，19 等中显示出形态改变。此外，在阿尔茨海默病的背景下，整体屏障完整性受到损害，所有这些与年龄相关的变化似乎更加明显1，^8，20。除了形态变化外，CP的转录组，蛋白质组和分泌组在疾病¹²，^21，22，23期间也发生了变化。因此，CP的先进知识对于更好地了解其在神经系统疾病中的作用并可能开发新的治疗策略至关重要。

一种将脑室CP准确显微解剖的有效方法是允许正确研究这种微小大脑结构的第一步。由于其高度血管化的性质（图2B），可以使用双目显微镜识别漂浮在脑室腔内的CP。然而，下游分析通常需要经心灌注，使CP组织的正确识别和分离复杂化（图2C）。如果进一步的处理步骤允许（例如，在RNA和蛋白质分析的情况下），可以通过溴酚蓝经心灌注 来 观察CP（图2A）。一些出版物已经描述了从大鼠²⁴ 和小鼠幼崽大脑²⁵中分离CP。本文描述了一种显微解剖分离技术，用于从成年小鼠中分离CP。重要的是，这种分离技术保留了CP内细胞的活力，功能和结构。本文描述了漂浮在第四脑室和侧脑室中的CP的分离。简而言之，小鼠被终末麻醉，并在必要时经心灌注。但是，应该注意的是，灌注会损害CP内细胞的结构。因此，如果要使用透射电子显微镜（TEM），连续块面扫描电子显微镜（SBF-SEM）或聚焦离子束SEM（FIB-SEM）分析样品，则不应进行灌注。接下来，整个大脑被隔离，镊子被用来对大脑进行射手半切。从这里，可以识别和解剖漂浮在侧脑室中的CP，而来自第四脑室的CP可以从大脑的小脑侧分离出来。

图 2:（A，D） 溴酚蓝灌注、（B，E） 无灌注和 （C，F） PBS/肝素灌注后的 （A-C） 第四和 （D-F） 侧脑室脉络丛 （CP） 的可视化。 图像是用体视显微镜（8x-32x放大倍率）拍摄的。请点击此处查看此图的大图。

一旦脑瘫从脑室中正确解剖出来，就可以应用一整套技术来进一步了解这种结构的功能。例如，可以进行流式细胞术或单细胞RNA测序，以量化和表型分析某些疾病条件下的浸润性炎症细胞^26，27。除了细胞组成外，还可以 通过酶联 免疫吸附测定（ELISA）、免疫印迹或使用细胞因子珠阵列²⁸同时分析多种细胞因子来分析CP的分子组成以评估细胞因子和趋化因子的存在。此外，转录组、血管、免疫细胞组织学和分泌组分析可以在显微解剖的 CP 外植体^{上进行 29}。在这里，整个卡口CP上的扫描电子显微镜（SEM）用于获得CP结构的整体视图。SEM使用聚焦电子束扫描表面并创建表面形貌和成分的图像。由于电子的波长远小于光的波长，因此SEM的分辨率在纳米范围内，优于光学显微镜。因此，可以通过SEM 进行 亚细胞水平的形态学研究。 简而言之，将解剖的CP立即转移到含戊二醛的固定剂中进行过夜固定，然后进行渗透和乙酸铀酰染色。然后用天冬氨酸铅染色处理样品，脱水，最终包埋进行成像。

因此，该协议有助于从小鼠脑室中有效分离CP，可以使用各种下游技术进一步分析以研究其结构和功能。

研究方案

本研究中描述的所有动物实验均根据国家（比利时法律14/08/1986和22/12/2003，比利时皇家法令06/04/2010）和欧洲立法（欧盟指令2010/63 / EU，86/609 / EEC）进行。所有关于小鼠和动物实验方案的实验均已获得根特大学伦理委员会的批准（许可证号LA1400091和EC 2017-026）。

1. 准备

1. 麻醉药:准备终末麻醉药。例如，可以制备磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的戊巴比妥钠（≥100mg / kg）溶液。
2. 经心灌注溶液:制备10mL（每只小鼠）PBS/肝素（含0.2%肝素）溶液，补充有0.5%溴酚蓝。
   注意:如果下游处理步骤允许（例如，在RNA和蛋白质分析的情况下），可以通过溴酚蓝经心灌注 可视化 脉络丛（CP）。如果溴酚蓝与进一步的处理步骤（例如，用于成像）不相容，请使用PBS/肝素进行灌注。
3. 准备 SEM 分析所需的解决方案。
   1. 制备0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.4）。在0.1M二甲胂酸钠缓冲液中制备2%多聚甲醛和2.5%戊二醛的溶液。每个样品制备 20 mL 该溶液。
   2. 在 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液（每个样品 5 mL）中制备 2% 四氧化锇。
   3. 准备 50%、70%、85% 和 100% 乙醇溶液。每个样品制备 5 mL 的每种 EtOH 溶液。

2.将脉络丛显微剥离出侧脑室和第四脑室

注意:本研究使用雌性，9周龄的C57BL / 6小鼠。然而，所描述的分离技术与成年小鼠的品系、性别和年龄无关。

1. 隔离小鼠大脑。
   1. 腹膜内注射致死剂量的短效巴比妥酸盐（>100mg / kg，在步骤1.1中制备）使用26G针头对小鼠进行终末麻醉。通过用镊子捏住鼠标的后爪来检查鼠标的脚反射。
   2. 当没有足反射时，将终末麻醉动物置于背褥位置，并通过将四肢固定在板上来固定小鼠。
      注意:如果不需要对小鼠进行经心灌注，则根据下游分析方法（例如，用于SEM成像），继续执行步骤2.1.7。但是，如果需要灌注以去除血液中的血细胞或其他成分，则CP可以通过溴酚蓝灌注 可视化 为漂浮在脑室中的蓝色结构。
   3. 通过喷洒70%乙醇对胸部进行消毒。在手术区域周围放置无菌窗帘。使用碳钢手术刀片在横膈膜下方切开~4厘米的切口（见 材料表）。
   4. 打开皮肤，用手术剪刀露出胸部。将隔膜完全切开。
   5. 分开胸部，露出肺部和跳动的心脏。
   6. 使用灌注泵以4.5mL / min的速率用10mL灌注溶液经心灌注小鼠（参见 材料表）。灌注将需要~2分钟。在左心室插入26G针头，将溶液泵入全身回路。此外，在右心房用手术剪刀切开，以便血液可以流出循环。
      注意:灌注泵比手动施用流体更可取，因为它将以精确编程的速率输送流体，并确保灌注引起的剪切力不会太强。过度的剪切力会损害CP内细胞的活力和结构。 此外，此处推荐的灌注流速最适合从7周开始灌注成年小鼠。如果使用较年轻的小鼠，则应使用较低的流速。同样重要的是，要擦去从右心房流出的血液，以保持手术部位的清洁。
   7. 斩首鼠标。
      注意:注意将头部切得尽可能低到肩膀，以保留大脑结构。如果切口太高，小脑可能会受损。
   8. 斩首后，从耳朵之间切开头皮，从眼睛上方切开。横向拉动皮肤以露出头骨。然后，沿着鳞状缝合线向鼻部切开头骨。
      注意:轻轻移除颅骨以保持大脑完整性很重要。
   9. 将大脑放入冰冷的培养皿中，并在脑组织上加入 1 mL 冰冷的 1x PBS。
      注意:不需要对培养皿进行涂层。
2. 隔离漂浮在第四心室的CP。
   1. 用手术刀轻轻地从大脑中切断小脑。大脑是大脑的最大部分，而小脑是大脑后部的较小部分。如有必要，从小脑中取出剩余的脑干组织部分。
   2. 旋转大脑，使切割线朝上。确保第四脑室腔现在在切片中间可见，CP 漂浮在背侧部位。如有必要，用锋利的镊子拉开结缔组织，稍微打开心室。这样，CP将更加明显，更容易到达。
   3. 使用微小锋利的镊子轻轻地将CP从心室壁中撕下。
      注意 重要的是在此步骤中仅触摸并取出CP，以免样品被周围组织污染。如步骤2.2.2中所述打开心室将有助于步骤2.2.3。
3. 隔离突出于侧心室的CP。
   1. 用微小锋利的镊子将大脑切成两个半球。
   2. 旋转大脑，使切割线朝上。要露出侧脑室，请轻轻地将皮质从丘脑中拉开。
   3. 将海马体缩回矢状中部切割线。现在可以看到侧脑室，CP位于心室底部。如有必要，用锋利的镊子拉开结缔组织，稍微打开心室。这样，CP将更加明显，更容易到达。
   4. 使用微小锋利的镊子轻轻地将CP从心室壁中撕下。
      注意:重要的是在此步骤中仅触摸并取出CP，以免周围组织污染样品。如步骤2.3.4中所述打开心室将有助于步骤2.3.5。在此步骤中，请谨慎行事，以尽可能保留CP的结构。最容易开始将CP从鼻翼拉到尾部方向。

3. 使用扫描电子显微镜（SEM）对CP组织进行形态学分析

注意:在以下处理步骤中使用有毒溶液。建议在通风橱中进行样品制备。

1. 如下所述执行 SEM 的样品制备。
   1. 将新鲜分离的CP转移到0.1M Na-二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.4）中含有2%多聚甲醛和2.5%戊二醛的新鲜固定溶液中。在4°C孵育过夜。
      注意:由于CP组织非常脆弱和薄，因此应将组织放入小标本篮中（参见 材料表）以在缓冲液之间转移。这样，组织的结构将得到更好的保存。基于二甲胂酸盐的固定剂使用于基于PBS的固定剂，因为强二甲胂酸盐缓冲液可以抵消EM固定剂中戊二醛的低pH值。
   2. 用 3-5 mL 的 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液 （pH 7.4） 洗涤样品 3 次，每次 5 分钟。
   3. 将样品后固定在 3-5 mL 的 2% 四氧化锇 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液中 30 分钟。用 3-5 mL 超纯水洗涤样品 3 次，每次 5 分钟。
   4. 将样品在一系列增加EtOH浓度（50%，70%，85%，100%）的冰冷溶液中脱水，每个EtOH溶液15分钟。使用临界点干燥器对样品进行适当的点干燥。
      注意 从液相变为气相会影响表面张力，导致表面结构损坏。临界点干燥步骤允许保留表面结构。
   5. 将样品小心地放在带有碳贴纸的试样支架上（参见 材料表）。
   6. 用一层薄薄的（2-5 nm）铂涂覆样品。为此，将铂金源安装在两个大电流电气端子之间的真空系统中，并将铂金加热到其蒸发温度。细小的铂流沉积在样品上。
      注意:参考^文献30中提供了此步骤的更详细的协议。除铂金外，还可以使用黄金或金/钯。
2. 用SEM可视化CP样品（见材料表）。通过SEM对CP组织的可视化过程与其他类型的组织类似，并且取决于所使用的软件和仪器。带有随附视频的分步SEM协议可在参考^{文献31或参考文献30}中找到。

结果

所描述的方案有助于将CP与小鼠脑侧（图2A-C）和第四（图2D-F）心室有效分离。分离整个大脑后，使用镊子对大脑进行骨状半球化，并识别漂浮在侧脑室中的CP。来自第四脑室的CP可以从大脑的小脑侧分离出来。溴酚蓝灌注可用于可视化CP（图2A，D）;然而，当在进一步?...

讨论

这里描述了一种将脉络丛（CP）从小鼠大脑的侧脑室和第四脑室中分离出来的方法。CP 的整个安装方法有助于使用一系列技术进行进一步分析，以获得 CP 形态、细胞组成、转录组、蛋白质组和分泌组的完整视图。这种分析对于更好地了解从大脑脑室突出的这种显着结构至关重要。这些知识具有巨大的研究兴趣，因为越来越清楚的是，CP在健康和疾病中起着至关重要的作用⁹，10，

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
26G x 1/2 needle	Henke Sass Wolf	4710004512
Aluminium specimen mounts	EM Sciences	75220
Cacodylate buffer	EM Sciences	11652
Carbon steel surgial blades	Swann-Morton	0210	size: 0.45 mm x 12 mm
Carbon adhesive tabs -12 mm	EM Sciences	77825-12
Critical point dryer	Bal-Tec	CPD030
Crossbeam 540	Zeiss		SEM system
Forceps	Fine Science Tools GmbH	91197-00
Glutaraldehyde	EM Sciences	16220
Heparin	Sigma-Aldrich	H-3125
Ismatec Reglo ICC Digital Peristaltic pump 2-channel	Metrohm Belgium N.V	CPA-7800160
Osmium Tetroxide	EM Sciences	19170
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Phosphate buffered saline (PBS)	Lonza	BE17-516F
Platinum	Quorum	Q150T ES	PBS without Ca++ Mg++ or phenol red; sterile filtered
Sodium pentobarbital	Kela NV	514
Specimen Basket Stainless Steel	EM Sciences	70190-01
Stemi DV4 Stereo microscope	Zeiss
Surgical scissors	Fine Science Tools GmbH	91460-11