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Resumo

O plexo coroide (PC), um tecido pouco estudado em neurociência, desempenha um papel fundamental na saúde e doença do sistema nervoso central. Este protocolo descreve uma técnica de microdissecção para isolamento do CP e o uso de microscopia eletrônica de varredura para obter uma visão global de sua estrutura celular.

Resumo

O plexo coroide (PC), uma estrutura altamente vascularizada que se projeta para os ventrículos do cérebro, é um dos tecidos mais pouco estudados na neurociência. Como está ficando cada vez mais claro que essa minúscula estrutura desempenha um papel crucial na saúde e na doença do sistema nervoso central (SNC), é de extrema importância dissecar adequadamente o PC para fora dos ventrículos cerebrais de uma forma que permita o processamento a jusante, desde a análise funcional até a estrutural. Aqui é descrito o isolamento da PC lateral e do quarto ventrículo cerebral de camundongos sem a necessidade de ferramentas ou equipamentos especializados. Essa técnica de isolamento preserva a viabilidade, a função e a estrutura das células dentro do PC. Devido à sua alta vascularização, o PC pode ser visualizado flutuando dentro das cavidades ventriculares do cérebro usando um microscópio binocular. Entretanto, a perfusão transcárdica necessária para análise a jusante pode dificultar a identificação do tecido do PC. Dependendo das etapas de processamento adicionais (por exemplo, análise de RNA e proteínas), isso pode ser resolvido visualizando o CP via perfusão transcárdica com azul de bromofenol. Após o isolamento, o PC pode ser processado usando várias técnicas, incluindo análise de RNA, proteína ou célula única, para obter maior compreensão sobre a função dessa estrutura cerebral especial. Aqui, a microscopia eletrônica de varredura (MEV) em todo o CP de montagem é usada para obter uma visão geral da estrutura.

Introdução

Barreiras apertadas separam o sistema nervoso central (SNC) da periferia, incluindo a barreira hematoencefálica (BHE) e a barreira sangue-líquido cefalorraquidiano (LCR). Essas barreiras protegem o SNC contra insultos externos e garantem um microambiente equilibrado e controlado 1,2,3. Embora a BHE tenha sido extensivamente estudada ao longo do tempo, a barreira sangue-LCR localizada no plexo coroide (CP) só ganhou crescente interesse de pesquisa durante a última década. Esta última barreira pode ser encontrada nos quatro ventrículos cerebrais (Figura 1A, B) e é caracterizada por uma única camada de células epiteliais do plexo coroide (ECP) ao redor de um estroma central, capilares vazados, fibroblastos e uma população de células linfoides e mieloides (Figura 1C)4,5,6. As células CPE estão firmemente interconectadas por tight junctions, evitando assim o vazamento dos capilares sanguíneos fenestrados subjacentes para o LCR e o cérebro. Além disso, o transporte através das células CPE é regulado por uma série de sistemas de transporte para dentro e para fora que gerenciam o influxo de compostos benéficos (por exemplo, nutrientes e hormônios) do sangue para o LCR e o efluxo de moléculas nocivas (por exemplo, resíduos metabólicos, excesso de neurotransmissores) na outra direção 1,6. Para poderem exercer sua função de transporte ativo, as células CPE contêm numerosas mitocôndrias em seu citoplasma7. Além disso, o PC é a principal fonte de LCR e atua como gatekeeper do cérebro pela presença de células inflamatóriasresidentes1. Devido à sua localização única entre o sangue e o cérebro, o PC também está perfeitamente posicionado para realizar vigilância imunológica8.

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Figura 1: Visão geral esquemática da localização e composição do plexo coroide (PC). (A,B) O tecido CP é encontrado nos dois ventrículos laterais, o terceiro e o quarto ventrículos de (A) cérebro humano e (B) de camundongo. (C) O tecido do PC consiste de uma única camada de células do epitélio cuboidal do CP (EPC) firmemente conectadas ao redor de capilares fenestrados, tecido conjuntivo frouxo e células linfoides e mieloides, e forma a barreira hemato-liquórica (adaptada e modificada da referência23). Figura criada com Biorender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Na última década, evidências crescentes, incluindo vários relatos de nosso grupo de pesquisa, têm revelado que a PC desempenha um papel central na saúde ena doença9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Por exemplo, sabe-se que a barreira sangue-LCR do envelhecimento apresenta alterações morfológicas, entre outras, nos núcleos, microvilosidades e membrana basal 1,19. Além disso, no contexto da doença de Alzheimer, a integridade global da barreira está comprometida e todas essas mudanças relacionadas à idade parecem ser ainda mais pronunciadas 1,8,20. Além das alterações morfológicas, o transcriptoma, proteoma e secretoma da PC são alterados durante a doença 12,21,22,23. Assim, o conhecimento avançado da PC é essencial para melhor compreender seu papel nas doenças neurológicas e potencialmente desenvolver novas estratégias terapêuticas.

Um método eficiente para a microdissecção precisa do PC para fora dos ventrículos cerebrais é o primeiro passo inestimável para permitir a investigação adequada desta minúscula estrutura cerebral. Devido à sua natureza altamente vascularizada (Figura 2B), o CP flutuando dentro das cavidades ventriculares do encéfalo pode ser identificado por meio de um microscópio binocular. No entanto, a perfusão transcárdica é frequentemente necessária para análise a jusante, dificultando a identificação e o isolamento adequados do tecido do PC (Figura 2C). Se as etapas adicionais de processamento permitirem (por exemplo, no caso de análise de RNA e proteínas), o CP pode ser visualizado via perfusão transcárdica com azul de bromofenol (Figura 2A). Várias publicações já descrevem o isolamento do PC do cérebro de ratos24 e filhotes de camundongos25. Aqui, uma técnica de isolamento por microdissecção é descrita para isolar o PC de camundongos adultos. É importante ressaltar que essa técnica de isolamento preserva a viabilidade, a função e a estrutura das células dentro do PC. O isolamento do CP flutuando no quarto e nos ventrículos laterais é descrito aqui. Em suma, os camundongos são anestesiados terminalmente e, se necessário, perfundidos transcardialmente. No entanto, deve-se notar que a perfusão pode danificar a estrutura das células dentro do PC. Consequentemente, se a amostra for analisada usando microscopia eletrônica de transmissão (MET), microscopia eletrônica de varredura de face serial block (SBF-SEM) ou MEV por feixe de íons focalizado (MEV-FIB), a perfusão não deve ser realizada. Em seguida, todo o cérebro é isolado, e fórceps são usados para hemissectar sagitalmente o cérebro. A partir daí, os CPs que flutuam nos ventrículos laterais podem ser identificados e dissecados, enquanto os CP do quarto ventrículo podem ser isolados do lado cerebelar do cérebro.

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Figura 2: Visualização do plexo coroide (CP) do quarto e (D-F) ventrículo lateral (CP) após (A,D) perfusão com azul de bromofenol, (B,E) sem perfusão e (C,F) perfusão com PBS/heparina. As imagens são obtidas com estereomicroscópio (aumento de 8x-32x). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Uma vez que o PC é adequadamente dissecado para fora dos ventrículos cerebrais, todo um repertório de técnicas pode ser aplicado para obter maior compreensão sobre a função dessa estrutura. Por exemplo, citometria de fluxo ou sequenciamento de RNA de célula única podem ser realizados para quantificar e analisar fenotipicamente as células inflamatórias infiltrantes sob determinadas condições de doença26,27. Além da composição celular, a composição molecular do CP pode ser analisada para avaliar a presença de citocinas e quimiocinas via ensaio imunoenzimático (ELISA), immunoblot, ou através da análise simultânea de múltiplas citocinas utilizando o arranjo de esferas de citocinas28. Além disso, análises de transcriptoma, vascular, histologia de células imunes e secretoma podem ser realizadas nos explantes de CPmicrodissecados29. Aqui, a microscopia eletrônica de varredura (MEV) em CP de montagem inteira é usada para obter uma visão geral da estrutura do CP. O MEV usa um feixe de elétrons focalizados para varrer a superfície e criar uma imagem da topografia e composição da superfície. Como o comprimento de onda dos elétrons é muito menor do que o da luz, a resolução do MEV está na faixa nanométrica e é superior à de um microscópio de luz. Consequentemente, estudos morfológicos em nível subcelular podem ser realizados via MEV. Resumidamente, o CP dissecado é imediatamente transferido para um fixador contendo glutaraldeído para uma fixação noturna, seguida de osmicação e coloração com acetato de uranila. As amostras são então tratadas com coloração de aspartato de chumbo, desidratadas e, finalmente, incluídas para aquisição de imagens.

Assim, este protocolo facilita o isolamento eficiente do PC dos ventrículos cerebrais de camundongos, o que pode ser posteriormente analisado usando uma variedade de técnicas a jusante para investigar sua estrutura e função.

Protocolo

Todos os experimentos com animais descritos neste estudo foram conduzidos de acordo com a legislação nacional (Lei belga 14/08/1986 e 22/12/2003, Decreto Real Belga 06/04/2010) e europeia (Diretivas UE 2010/63/UE, 86/609/CEE). Todos os experimentos em camundongos e protocolos em animais foram aprovados pelo comitê de ética da Universidade de Ghent (números de licença LA1400091 e EC 2017-026).

1. Preparo

  1. Anestésicos: Preparar um anestésico terminal. Por exemplo, uma solução de pentobarbital sódico (≥100 mg/kg) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) pode ser preparada.
  2. Solução de perfusão transcárdica: Preparar 10 mL (por camundongo) de solução de PBS/heparina (contendo heparina a 0,2%) suplementada com azul de bromofenol a 0,5%.
    NOTA: Se as etapas de processamento a jusante permitirem (por exemplo, no caso de análise de RNA e proteínas), o plexo coroide (CP) pode ser visualizado via perfusão transcárdica com azul de bromofenol. Se o azul de bromofenol não for compatível com as etapas de processamento adicionais (por exemplo, para geração de imagens), use PBS/heparina para perfundir.
  3. Preparar as soluções necessárias para análise de MEV.
    1. Preparar tampão Na-cacodilato 0,1 M (pH 7,4). Preparar uma solução de paraformaldeído a 2% e glutaraldeído a 2,5% em tampão Na-cacodilato 0,1 M. Completar 20 ml desta solução por amostra.
    2. Preparar tetróxido de ósmio a 2% em tampão Na-cacodilato 0,1 M (5 ml por amostra).
    3. Prepare soluções de 50%, 70%, 85% e 100% EtOH. Preparar 5 mL de cada solução de EtOH por amostra.

2. Microdissecção do plexo coroide para fora do ventrículo lateral e quarto ventrículo

NOTA: Camundongos fêmeas C57BL/6 com 9 semanas de idade foram usados neste estudo. No entanto, a técnica de isolamento descrita é independente da cepa, sexo e idade do camundongo adulto.

  1. Isole o cérebro do rato.
    1. Injetar intraperitonealmente uma dose letal de um barbitúrico de curta duração (>100 mg/kg, preparado no passo 1.1) utilizando uma agulha 26G para anestesiar terminalmente o rato. Verifique o reflexo do pé do mouse apertando sua pata traseira com pinças.
    2. Quando não houver reflexo no pé, coloque o animal anestesiado terminalmente em decúbito dorsal e fixe o camundongo fixando os membros em uma placa.
      NOTA: Se a perfusão transcárdica dos ratinhos não for necessária, dependendo do método de análise a jusante (por exemplo, para imagens por MEV), avance para o passo 2.1.7. No entanto, se a perfusão for necessária para remover células sanguíneas ou outros componentes no sangue, o PC pode ser visualizado como uma estrutura azul flutuando nos ventrículos cerebrais via perfusão com azul de bromofenol.
    3. Desinfete o tórax borrifando etanol 70%. Coloque um pano estéril ao redor da área cirúrgica. Faça uma incisão de ~4 cm logo abaixo do diafragma usando uma lâmina cirúrgica de aço carbono (ver Tabela de Materiais).
    4. Abra a pele e exponha o tórax com tesoura cirúrgica. Corte o diafragma completamente aberto.
    5. Separe o tórax para expor os pulmões e o coração batendo.
    6. Perfundir transcardialmente os camundongos com 10 mL da solução de perfusão a uma taxa de 4,5 mL/min, usando uma bomba de perfusão (ver Tabela de Materiais). A perfusão levará ~2 min. Insira uma agulha 26G no ventrículo esquerdo para bombear a solução para o circuito sistêmico. Além disso, faça um corte com tesoura cirúrgica no átrio direito para que o sangue possa sair da circulação.
      NOTA: Uma bomba de perfusão é preferível à administração manual do fluido, pois ela fornecerá os fluidos em uma taxa precisamente programada e garantirá que as forças de cisalhamento causadas pela perfusão não sejam muito fortes. Forças de cisalhamento excessivas comprometerão a viabilidade e a estrutura das células dentro do CP. Além disso, a taxa de fluxo de perfusão recomendada aqui é ideal para perfundir camundongos adultos a partir de 7 semanas. Se forem utilizados ratinhos mais jovens, deve ser utilizada uma taxa de fluxo mais baixa. Também é importante eliminar o sangue que sai do átrio direito para preservar um local cirúrgico limpo.
    7. Decapite o rato.
      NOTA: Preste cuidado para cortar a cabeça o mais baixo possível para o ombro para preservar a estrutura cerebral. Se o corte for muito alto, o cerebelo pode ser danificado.
    8. Após a decapitação, corte o couro cabeludo fazendo uma incisão entre as orelhas até os olhos. Puxe a pele lateralmente para expor o crânio. Em seguida, abrir o crânio seguindo as suturas escamosas, em direção à parte nasal.
      NOTA: É importante remover suavemente o crânio para manter a integridade cerebral.
    9. Coloque o cérebro em uma placa de Petri gelada e adicione 1 mL de 1x PBS gelado no tecido cerebral.
      NOTA: O revestimento do prato não é necessário.
  2. Isole o CP flutuando no quarto ventrículo.
    1. Corte suavemente o cerebelo do cérebro com um bisturi. O cérebro é a maior parte do cérebro, enquanto o cerebelo é uma parte muito menor na parte de trás do cérebro. Se necessário, remova as partes restantes do tecido do tronco cerebral do cerebelo.
    2. Gire o cérebro para que a linha de corte esteja voltada para cima. Certifique-se de que a cavidade do quarto ventrículo esteja agora visível no meio da seção, com o CP flutuando no local dorsal. Se necessário, abra um pouco o ventrículo puxando o tecido conjuntivo com pinças afiadas. Desta forma, o CP ficará mais visível e mais fácil de alcançar.
    3. Rasgue suavemente o CP para fora da parede do ventrículo usando pinças minúsculas e afiadas.
      NOTA É importante apenas tocar e retirar o CP nesta etapa, a fim de não contaminar a amostra com o tecido circundante. A abertura dos ventrículos, conforme descrito no passo 2.2.2, facilitará o passo 2.2.3.
  3. Isole o CP que se projeta para fora do ventrículo lateral.
    1. Use pinças afiadas minúsculas para cortar sagitalmente o cérebro em dois hemisférios.
    2. Gire o cérebro para que a linha de corte esteja voltada para cima. Para revelar o ventrículo lateral, puxe suavemente o córtex do tálamo.
    3. Retrair o hipocampo para a linha de corte sagital médio. O ventrículo lateral é agora visível com o CP deitado na parte inferior do ventrículo. Se necessário, abra um pouco o ventrículo puxando o tecido conjuntivo com pinças afiadas. Desta forma, o CP ficará mais visível e mais fácil de alcançar.
    4. Use pinças minúsculas e afiadas para arrancar suavemente o CP da parede do ventrículo.
      NOTA: É importante apenas tocar e retirar o CP nesta etapa para não contaminar a amostra com o tecido circundante. A abertura dos ventrículos, conforme descrito no passo 2.3.4, facilitará o passo 2.3.5. Use os cuidados necessários nesta etapa para preservar ao máximo a estrutura do CP. É mais fácil começar a puxar o CP no sentido rostral para caudal.

3. Análise morfológica do tecido do PC por microscopia eletrônica de varredura (MEV)

CUIDADO: Soluções tóxicas são usadas nas seguintes etapas de processamento. Recomenda-se realizar a preparação da amostra em um exaustor.

  1. Execute a preparação da amostra para MEV conforme descrito abaixo.
    1. Transferir o CP fresco isolado para uma solução de fixação recém-confeccionada contendo paraformaldeído a 2% e glutaraldeído a 2,5% em tampão Na-cacodilato 0,1 M (pH 7,4). Incubar durante a noite a 4 °C.
      NOTA: Como o tecido do CP é muito frágil e fino, o tecido deve ser colocado em pequenos cestos de amostras (ver Tabela de Materiais) para transferi-lo entre tampões. Dessa forma, a estrutura do tecido será melhor preservada. Um fixador à base de cacodilato é usado sobre um à base de PBS, pois o tampão forte de cacodilato pode combater o baixo pH do glutaraldeído no fixador EM.
    2. Lavar a amostra 3x durante 5 min cada com 3-5 ml de tampão Na-cacodilato 0,1 M (pH 7,4).
    3. Pós-fixar as amostras em 3-5 mL de tetróxido de ósmio a 2% em tampão Na-cacodilato 0,1 M por 30 min. Lave as amostras 3x por 5 min cada com 3-5 mL de água ultrapura.
    4. Desidratar as amostras em uma série de soluções geladas de concentrações crescentes de EtOH (50%, 70%, 85%, 100%), por 15 min por solução de EtOH. Use um secador de ponto crítico para apontar corretamente a amostra seca.
      NOTA A mudança da fase líquida para a gasosa afeta a tensão superficial, causando danos à estrutura superficial. A etapa de secagem do ponto crítico permite a preservação da estrutura superficial.
    5. Posicione cuidadosamente a amostra sobre um suporte de amostra fornecido com um adesivo de carbono (consulte a Tabela de Materiais).
    6. Revestir as amostras com uma fina camada (2-5 nm) de platina. Para isso, monte uma fonte de platina em um sistema de vácuo entre dois terminais elétricos de alta corrente e aqueça a platina até sua temperatura de evaporação. Um fluxo fino de platina é depositado na amostra.
      Observação : um protocolo mais detalhado para esta etapa é fornecido na referência30. Além da platina, ouro ou ouro/paládio também podem ser usados.
  2. Visualize as amostras de CP com MEV (consulte Tabela de Materiais). O procedimento de visualização do tecido CP via MEV é semelhante ao de outros tipos de tecidos e depende do software e dos instrumentos utilizados. Um protocolo de MEV passo a passo com um vídeo que o acompanha está disponível na referência31 ouna referência 30.

Resultados

O protocolo descrito facilita o isolamento eficiente do CP dos ventrículos lateral (Figura 2A-C) e quarto (Figura 2D-F) do cérebro de camundongos. Após o isolamento de todo o cérebro, fórceps são usados para hemisseccionalmente o cérebro e identificar os CPs flutuando nos ventrículos laterais. A PC do quarto ventrículo pode ser isolada do lado cerebelar do cérebro. A perfusão com azul...

Discussão

Aqui é descrito um método para isolar o plexo coroide (PC) do ventrículo lateral e do quarto ventrículo de um cérebro de camundongo. Todo esse método de montagem do CP facilita análises posteriores utilizando um repertório de técnicas para obter uma visão completa da morfologia, composição celular, transcriptoma, proteoma e secretoma do CP. Tais análises são cruciais para obter uma melhor compreensão dessa notável estrutura que se projeta dos ventrículos do cérebro. Esse conhecimento é de imenso intere...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Belga de Investigação da Alzheimer (SAO; número do projecto: 20200032), pela Fundação de Investigação da Flandres (FWO Vlaanderen; números do projecto: 1268823N, 11D0520N, 1195021N) e pelo Fundo Baillet Latour. Agradecemos ao VIB BioImaging Core pelo treinamento, suporte e acesso ao parque de instrumentos.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
26G x 1/2 needleHenke Sass Wolf4710004512
Aluminium specimen mountsEM Sciences75220
Cacodylate bufferEM Sciences11652
Carbon steel surgial bladesSwann-Morton0210size: 0.45 mm x 12 mm
Carbon adhesive tabs -12 mmEM Sciences77825-12
Critical point dryer Bal-Tec CPD030
Crossbeam 540ZeissSEM system
ForcepsFine Science Tools GmbH 91197-00
GlutaraldehydeEM Sciences16220
HeparinSigma-AldrichH-3125
Ismatec Reglo ICC Digital Peristaltic pump 2-channelMetrohm Belgium N.VCPA-7800160
Osmium Tetroxide EM Sciences19170
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
Phosphate buffered saline (PBS)LonzaBE17-516F
Platinum Quorum Q150T ESPBS without Ca++ Mg++ or phenol red; sterile filtered
Sodium pentobarbitalKela NV514
Specimen Basket Stainless SteelEM Sciences70190-01
Stemi DV4 Stereo microscopeZeiss
Surgical scissorsFine Science Tools GmbH 91460-11

Referências

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