Микродиссекция и сканирующая электронная микроскопия всего массива Визуализация сосудистого сплетения мыши

Резюме

Сосудистое сплетение (ХП), малоизученная ткань в неврологии, играет ключевую роль в здоровье и заболеваниях центральной нервной системы. Этот протокол описывает метод микродиссекции для выделения CP и использование сканирующей электронной микроскопии для получения общего представления о его клеточной структуре.

Аннотация

Сосудистое сплетение (ХП), сильно васкуляризированная структура, выступающая в желудочки головного мозга, является одной из наиболее малоизученных тканей в неврологии. Поскольку становится все более очевидным, что эта крошечная структура играет решающую роль в здоровье и заболеваниях центральной нервной системы (ЦНС), крайне важно правильно рассечь ДЦП из желудочков головного мозга таким образом, чтобы обеспечить последующую обработку, начиная от функционального и заканчивая структурным анализом. Здесь описана изоляция ЦП бокового и четвертого желудочков головного мозга мыши без необходимости использования специализированных инструментов или оборудования. Этот метод изоляции сохраняет жизнеспособность, функцию и структуру клеток внутри CP. Из-за высокой васкуляризации CP можно визуализировать плавающим внутри желудочковых полостей мозга с помощью бинокулярного микроскопа. Однако транскардиальная перфузия, необходимая для последующего анализа, может усложнить идентификацию ткани ЦП. В зависимости от дальнейших этапов обработки (например, анализ РНК и белка) это может быть решено путем визуализации CP с помощью транскардиальной перфузии бромфеноловым синим. После выделения CP может быть обработан с использованием нескольких методов, включая анализ РНК, белка или отдельных клеток, чтобы получить более глубокое понимание функции этой особой структуры мозга. Здесь сканирующая электронная микроскопия (SEM) на всей монтировке CP используется для получения общего представления о структуре.

Введение

Жесткие барьеры отделяют центральную нервную систему (ЦНС) от периферии, включая гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и гемато-спинномозговой жидкость (СМЖ). Эти барьеры защищают ЦНС от внешних воздействий и обеспечивают сбалансированную и контролируемую микросреду ^1,2,3. В то время как ГЭБ широко изучался с течением времени, гемато-ликворный барьер, расположенный в сосудистом сплетении (ХП), только приобрел растущий исследовательский интерес в течение последнего десятилетия. Этот последний барьер может быть обнаружен в четырех желудочках головного мозга (рис. 1A, B) и характери....

протокол

Все эксперименты на животных, описанные в этом исследовании, были проведены в соответствии с национальным (Бельгийский закон 14/08/1986 и 22/12/2003, Бельгийский королевский указ 06/04/2010) и европейским законодательством (Директивы ЕС 2010/63/ЕС, 86/609/ЕЭС). Все эксперименты на мышах и животных были одобрены комитетом по этике Гентского университета (номера разрешений LA1400091 и EC 2017-026).

1. Подготовка

1. Анестетики: Приготовьте терминальный анестетик. Например, можно приготовить раствор пентобарбитала натрия (≥100 мг/кг) в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS).
2. Раствор для транскардиальн....

Результаты

Описанный протокол способствует эффективному выделению CP из бокового (рис. 2A-C) и четвертого (рис. 2D-F) желудочков головного мозга мыши. После изоляции всего мозга щипцы используются для сагиттальной гемисекции мозга и .......

Обсуждение

Здесь описан способ выделения сосудистого сплетения (ХП) из бокового желудочка и четвертого желудочка мозга мыши. Весь этот метод монтажа CP облегчает дальнейший анализ с использованием репертуара методов, чтобы получить полное представление о морфологии CP, клеточном составе, транскри.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
26G x 1/2 needle	Henke Sass Wolf	4710004512
Aluminium specimen mounts	EM Sciences	75220
Cacodylate buffer	EM Sciences	11652
Carbon steel surgial blades	Swann-Morton	0210	size: 0.45 mm x 12 mm
Carbon adhesive tabs -12 mm	EM Sciences	77825-12
Critical point dryer	Bal-Tec	CPD030
Crossbeam 540	Zeiss		SEM system
Forceps	Fine Science Tools GmbH	91197-00
Glutaraldehyde	EM Sciences	16220
Heparin	Sigma-Aldrich	H-3125
Ismatec Reglo ICC Digital Peristaltic pump 2-channel	Metrohm Belgium N.V	CPA-7800160
Osmium Tetroxide	EM Sciences	19170
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Phosphate buffered saline (PBS)	Lonza	BE17-516F
Platinum	Quorum	Q150T ES	PBS without Ca++ Mg++ or phenol red; sterile filtered
Sodium pentobarbital	Kela NV	514
Specimen Basket Stainless Steel	EM Sciences	70190-01
Stemi DV4 Stereo microscope	Zeiss
Surgical scissors	Fine Science Tools GmbH	91460-11