通过表皮表型评分 鉴定 参与气孔发育的基因

摘要

本文描述了两种不使用表皮剥皮的表型方法来表征控制气孔发育的基因。第一种方法演示了如何使用甲苯胺蓝O染色植物表皮分析气孔表型。第二种方法描述了如何识别气孔配体并监测其生物活性。

摘要

气孔是陆地植物表面的小孔，参与气体交换和水蒸气释放，其功能对植物生产力和生存至关重要。因此，了解气孔发育和模式的机制具有巨大的农艺价值。本文描述了两种使用 拟南芥 子叶的表型方法，可用于表征控制气孔发育和模式化的基因。首先介绍使用甲苯胺蓝O染色子叶分析气孔表型的程序。该方法快速可靠，不需要使用表皮剥皮，表皮果皮广泛用于表型分析，但需要专门的培训。由于存在多个半胱氨酸残基，鉴定和生成在气孔发育中起作用的生物活性EPF肽一直具有挑战性。因此，第二呈现的是用于鉴定气孔配体并通过生物测定监测其生物活性的程序。该方法的主要优点是它相对容易地产生可重复的数据，同时减少了肽溶液的量和表征肽在控制气孔模式和发育中的作用所需的时间。总体而言，这些精心设计的方案提高了研究潜在气孔调节因子的效率，包括富含半胱氨酸的分泌肽，这些肽需要高度复杂的结构才能发挥其活性。

引言

植物气孔的正确图案化和分化对于它们在光合作用和蒸腾这两个基本生物过程中的功能至关重要，并且由EPF肽信号通路强制执行。在拟南芥中，三种分泌的富含半胱氨酸的肽 EPF1、EPF2 和气孔/EPFL9 控制气孔发育的不同方面，并被细胞表面受体成分感知，包括直立家族受体激酶（ER、ERL1 和 ERL2）、SERK 和 TMM¹、²、³、⁴、⁵、⁶、⁷、⁸、^9、10.然后，这种识别导致通过MAPK依赖性过程促进气孔分化的转录因子的下调¹¹。这些核心气孔基因的发现主要是通过对表现出表皮缺陷的突变体进行表型筛选来实现的。本文提出了相对简单有效的表型方法，用于可视化气孔和其他表皮细胞，这是识别和表征控制气孔模式和分化的潜在基因所必需的。

植物表皮细节的观察通常是通过使用表皮果皮来实现的，有或没有用甲苯胺蓝O（TBO）或safranin^12，13，14等染料染色。然而，这些方法的主要挑战是它们需要专门的培训来剥离叶子表皮而不撕裂组织，并仔细观察和分析图案数据，同时避免从叶子的不同部分拍摄的图像。使用水合氯醛基澄清溶液等试剂清除组织样品的化学处理也已广泛用于各种生物材料^8，15;这些处理确实通过提供高质量的图像产生大量的表型信息，但也需要使用危险化学品（例如甲醛、水合氯醛）。本文首先提出了一种相对简单方便的表型分析方法，该方法产生的图像足以进行定量分析，但不需要使用危险化学品和表皮叶皮进行样品制备。TBO染色的子叶表皮也是研究气孔发育的理想选择，因为子叶中缺乏毛状体和较小的发育梯度允许对表皮表型进行简单易处理的解释。

气孔EPF肽属于植物特异性，富含半胱氨酸的肽组，具有相对较大的成熟尺寸和保守半胱氨酸残基之间的分子内二硫键。正确的构象折叠对其生物学功能至关重要，但通过化学合成或异源重组系统产生的富含半胱氨酸的肽可能是无活性的，并且是正确折叠和未折叠肽的混合物3，^7，16。因此，筛选在控制气孔发育方面起作用的生物活性肽是一项非常具有挑战性的任务。本手稿还描述了一种生物测定方法，用于更好地鉴定和表征生物活性气孔肽。在该方法中，拟南芥幼苗在含有和没有潜在肽的培养基的多孔板中生长6-7天。然后，使用共聚焦显微镜观察子叶表皮。一般来说，为了清楚地看到气孔发育中潜在肽的生物活性，除了用于生物测定的野生型拟南芥对照 （Col-0） 外，还使用了产生更多和/或更少气孔谱系细胞的基因型，例如产生更多表皮细胞的 epf2 突变体和赋予降低表皮细胞密度²，^4，5 的 stomagen-ami 系。

总体而言，此处介绍的两个方案可用于快速有效地评估各种表皮表型，并用于筛选在控制气孔模式和发育方面起作用的小肽和激素。

研究方案

1. 用TBO染色 拟南芥 子叶

1. 种子灭菌和生长条件
   1. 通过加入 1 mL 种子灭菌溶液（33% 商业漂白剂，0.1% Triton X-100），在微量离心管中对每个基因型的拟 南芥 种子进行灭菌，并在室温 （RT） 下轻轻摇动 10-12 分钟。
      注意:灭菌~30粒野生型 拟南芥 加入哥伦比亚（Col-0）种子和/或~60粒携带化学诱导基因（例如， Est::EPF2⁷）的转基因植物种子，以使用在1/2 Murashige和Skoog（MS）平板上生长的转基因幼苗（2.16g / L含有0.8%琼脂[w / v]），而不使用诱导剂（例如β-雌二醇）作为对照（图1 和 图2）。
   2. 取出灭菌溶液，在层流罩中用 1 mL 无菌水洗涤种子四次，然后将它们重悬于 ~200 μL 无菌 0.1% 琼脂中。
   3. 在含有诱导剂（例如，10μM β-雌二醇）的 1/2 MS 琼脂平板或 1/2 MS 琼脂平板上播种每个基因型 ~30 粒种子，用于化学诱导转基因（例如， Est::EPF2⁷），并用微孔胶带密封。
      注意:种子需要均匀分布在盘子上，以避免将它们放在很近的地方，因为这会阻止幼苗均匀生长。
   4. 通过将板置于4°C无光下3-5天来分层种子以同步发芽。
   5. 分层后，将板在22°C的生长室中在120μmol·m−²·s⁻¹ 光下孵育，光周期为16小时光照和8小时黑暗10天。
2. 拟南芥子叶的取样和TBO染色
   1. 在发芽后10天，仔细选择并从单个幼苗中切出一个子叶，这些子叶与盘子上的其他幼苗均匀生长，以限制变异性。
      注意:子叶取自10日龄幼苗，因为它们没有毛状体和未成熟的表皮细胞，这简化了表皮表型的解释。
   2. 使用镊子将每个子叶放入含有 1 mL 固定溶液（9:1 乙醇至乙酸）的微量离心管中，并将样品至少在室温下在固定溶液中过夜。
      注意:在这种情况下，样品可以保存长达几年。 图像图2E 取自在固定溶液中储存超过3年的子叶样品。重要的是在切割后立即将子叶保持在固定溶液中，并在每个微量离心管中放置不超过五个子叶，以便以后进行均匀的样品制备。
   3. 取出固定溶液，加入 1 mL 70% 乙醇。倒置试管几次后，将装有样品的试管置于室温~30分钟。
   4. 使用1 mL的50%乙醇和20%乙醇重复步骤1.2.3。
   5. 用 1 mL 蒸馏水替换 1 mL 20% 乙醇，然后在倒置试管几次后将装有子叶样品的管放置 ~30 分钟。
      注意:样品可以在蒸馏水中停留超过24小时，但不建议这样做以获得高质量的图像（不同表皮细胞类型的染色良好的图像）进行定量分析。
   6. 从管中取出所有蒸馏水。然后，立即加入~200μLTBO染色溶液（H₂O中的0.5%TBO，过滤）~2分钟。
      注意:通过在孵育期间轻轻轻弹试管，确保每个子叶样品均匀地暴露于TBO溶液中。为防止TBO过度染色（染色时间至关重要，并且每个基因型都可以变化），一次不要处理超过六个含有样品的试管。
   7. 尽可能彻底地去除TBO染色溶液，然后立即加入1 mL新鲜蒸馏水洗涤样品几次。
3. 成像和数据分析
   1. 取显微镜载玻片，加入一滴15%甘油（~50μL）。使用细镊子将子叶与远轴面朝上放入载玻片上的15%甘油中。然后，用盖玻片轻轻盖住它，以便从样品中去除形成的任何气泡。
   2. 使用明场显微镜对子叶表皮的远轴侧进行成像（图1 和 图2），然后通过计数气孔和其他表皮细胞类型的数量来检查表皮表型。
   3. 对于每种基因型，使用Jangra等人描述的以下公式计算表皮表型¹⁷:
      造口指数（%）=（造口数/表皮细胞总数）×100
      气孔密度 （mm⁻²） = 气孔数/面积 （mm²）
      注意:为每个基因型至少八个子叶（N = 8）成像，并通过将其与野生型植物和/或表达化学诱导转基因的转基因的表型进行比较来记录每个基因型的表皮表型没有诱导剂生长。

2. 气孔肽的生物测定

注意:生物测定的程序如图 3所示。

1. 种子灭菌和生长条件
   1. 如上所述，每次处理灭菌~25粒种子，并将大约一半的种子播种到层流罩中的两个1/2 MS琼脂平板上。
      注意:使用具有高和/或低表皮细胞的基因型（例如， epf2²）而不是使用野生型背景（例如，Col-0）来轻松检测肽对表皮细胞模式和分化的生物活性（图4）。
   2. 在黑暗中将种子在4°C下分层3天。
   3. 以~10小时间隔取出两个平板中的每一个，并将种子在22°C的平板上在120μmol·m⁻²·^s-1 光下孵育，光周期为16小时光照和8小时黑暗1天。
2. 肽处理和成像
   1. 在层流罩中，小心地将两个制备的平板中的每一个的10-12个一日龄 拟南芥 幼苗移植到每个孔中含有1.5mL 1/2MS液体培养基的24孔板中（每孔~20个幼苗）。
      注意:幼苗肽处理的时机对于肽处理的表型结果至关重要，因此在两个单独的板上准备种子以获得两个不同的幼苗发育阶段进行处理。
   2. 单独加入缓冲液（50 mM Tris-HCl [pH 8.0]）或两种不同浓度的肽（通常，50 mM Tris-HCl [pH 8.0]中的 1 μM 和 2.5 μM 肽）到含有 ~20 个在 1/2 MS 琼脂平板上发芽的一日龄 拟南芥 幼苗的孔中。
      注意:从冰箱中取出肽溶液等分试样，并在治疗前将其在室温下保持几分钟。储存在-80°C冰箱中的肽可以稳定保存几年，但应通过将肽溶液以小等分试样储存来避免冻融循环。
   3. 将幼苗单独与缓冲液或使用移液管的肽溶液轻轻混合后，用微孔胶带密封板。将测定板在长日照条件下（16小时光周期，120μmol·m⁻²·s-1光）在22°C孵育^5-7 天。
      注意:防止幼苗生长得太近，以使每个幼苗均匀地暴露于肽溶液中。轻轻旋转板2-3小时，然后将板在生长室中孵育以增加通气。
   4. 将每个幼苗从含有单独缓冲液或肽的孔中转移到盖玻片上，并解剖幼苗的子叶。用镊子将子叶的远轴侧向上放置，并将其切成小块。
   5. 取另一张干净的显微镜载玻片，在其上滴一滴碘化丙啶溶液（~25μL，2mg / mL在H₂O中）。
   6. 用镊子将一小块子叶放入一滴碘化丙啶溶液中，然后轻轻放置盖玻片。在盖玻片的边缘涂上额外的碘化丙啶溶液，以去除已形成的任何气泡。
   7. 使用共聚焦显微镜对子叶的远轴侧进行成像，并将图像与仅在含有缓冲液的1/2MS培养基中生长的幼苗的图像进行比较。
      注意:图4中显示的图像取自仅用缓冲液（图4A，B）或两批EPF2肽溶液（图4C-F）处理的野生型Col-0或epf2²，⁵幼苗，并在-80°C下储存1年。

结果

已知具有较少或更多气孔密度和聚集的各种气孔转基因植物和突变体（epf2 2，5、epf1 epf2 ^2，5、tmm¹²、气孔沉默系⁴ 和携带雌二醇诱导的 Est::EPF1 或 Est::EPF2 过表达构建体⁷ 的转基因系）用于证明此处介绍的两种表型分?...

讨论

这里介绍的用于鉴定和表征控制气孔模式和分化的基因的两种表型分析方法是方便可靠的测定，因为该方案不需要使用表皮剥离和专用设备（这很耗时并且需要特殊的样品制备培训），但确实可以产生高质量的图像用于表皮表型的定量分析。

该技术使用TBO染色拟 南芥 子叶进行表型分析的局限性在于，获得不同表皮细胞类型的具有视觉对比度的高质量图像取决于染色时...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 mm x 18 mm cover slip	VWR	16004-326
24-well sterile plates with lid	VWR	CA62406-183
3M Micropore surgical tape	Fisher Scientific	19-027-761	Microporous surgical paper tape used to seal MS plates
76 x 26 mm Microscope slide	TLG	GEW90-2575-03
Acetic acid, ≥99.8%	Fisher Scientific	A38-212
Agar	BioShop	AGR001.1
Bleech	Household bleach (e.g., Clorox)
Confocal microscope	Nikon		Nikon C2 operated by NIS-Elements
Ethanol	Greenfield	P210EAAN
FIJI	Open-srouce	(Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j	Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/
Forceps	Sigma-Aldrich	F6521
Gamborg's vitamin mixture	Cassson Labs	GBL01-100ML	Store at 4 °C
Glycerol	Fisher Scientific	G33-4
Growth chambers	Conviron, model E15		16h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1.
Lights	HD Supply	25272	Fluorescent  lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K
Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	14-222-155	Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization
Microscope	Nikon		Nikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera
Murashige and Skoog basal salts	Cassson Labs	MSP01-1LT	Store at 4 °C
Petri Dish 100 mm x 20 mm	Fisher Scientific	08-757-11Z	Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana
Propidium Iodide	VWR	39139-064
Scalpel	Fisher Scientific	08-916-5A
Sucrose	BioShop	SUC700.5
Toluidine blue O	Sigma-Aldrich	T3260-5G
Tris base	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-100ML
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758