Identifizierung der Gene, die an der Entwicklung der Stomata beteiligt sind, mittels epidermalem Phänotyp-Scoring

Zusammenfassung

In dieser Arbeit werden zwei Phänotypisierungsmethoden ohne die Verwendung von epidermalen Peelings beschrieben, um die Gene zu charakterisieren, die die Entwicklung der Stomata steuern. Die erste Methode zeigt, wie ein stomataler Phänotyp unter Verwendung einer Toluidinblau-O-gefärbten Pflanzenepidermis analysiert werden kann. Die zweite Methode beschreibt, wie man stomatale Liganden identifiziert und ihre biologischen Aktivitäten überwacht.

Zusammenfassung

Stomata sind kleine Poren auf der Oberfläche von Landpflanzen, die am Gasaustausch und der Freisetzung von Wasserdampf beteiligt sind, und ihre Funktion ist entscheidend für die Produktivität und das Überleben von Pflanzen. Daher hat das Verständnis der Mechanismen, durch die sich Stomata entwickeln und mustern, einen enormen agronomischen Wert. In dieser Arbeit werden zwei phänotypische Methoden unter Verwendung von Arabidopsis-Keimblättern beschrieben, die zur Charakterisierung der Gene verwendet werden können, die die Entwicklung und Musterung der Stomata steuern. Zunächst werden Verfahren zur Analyse der stomatalen Phänotypen unter Verwendung von Toluidinblau O-gefärbten Keimblättern vorgestellt. Diese Methode ist schnell und zuverlässig und erfordert keine Verwendung von epidermalen Peelings, die häufig für phänotypische Analysen verwendet werden, aber eine spezielle Schulung erfordern. Aufgrund des Vorhandenseins mehrerer Cysteinreste war die Identifizierung und Erzeugung von bioaktiven EPF-Peptiden, die eine Rolle bei der Entwicklung der Stomata spielen, eine Herausforderung. Als zweites wird ein Verfahren vorgestellt, das zur Identifizierung von stomatalen Liganden und zur Überwachung ihrer biologischen Aktivität durch Bioassays verwendet wird. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie relativ einfach reproduzierbare Daten liefert und gleichzeitig die Menge an Peptidlösung und die Zeit reduziert, die erforderlich ist, um die Rolle der Peptide bei der Kontrolle der stomatalen Musterung und Entwicklung zu charakterisieren. Insgesamt verbessern diese gut konzipierten Protokolle die Effizienz bei der Untersuchung der potenziellen stomatalen Regulatoren, einschließlich Cystein-reicher sekretorischer Peptide, die für ihre Aktivität hochkomplexe Strukturen benötigen.

Einleitung

Die richtige Strukturierung und Differenzierung der pflanzlichen Stomata ist entscheidend für ihre Funktion in zwei grundlegenden biologischen Prozessen, Photosynthese und Transpiration, und wird durch EPF-Peptid-Signalwege verstärkt. In Arabidopsis kontrollieren drei sezernierte Cystein-reiche Peptide, EPF1, EPF2 und STOMAGEN/EPFL9, verschiedene Aspekte der stomatalen Entwicklung und werden von Zelloberflächenrezeptorkomponenten wahrgenommen, einschließlich Rezeptorkinasen der ERECTA-Familie (ER, ERL1 und ERL2), SERKs und TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Diese Erkennung führt dann zur Herunterregulierung der Transkriptionsfaktoren, die die stomatale Differenzierung durch einen MAPK-abhängigen Prozess fördern¹¹. Die Entdeckung dieser stomatalen Kerngene wird in erster Linie durch das phänotypische Screening von Mutanten mit epidermalen Defekten erreicht. In dieser Arbeit werden relativ einfache und effiziente Phänotypisierungsmethoden zur Visualisierung der Stomata und anderer Epidermiszellen vorgestellt, die zur Identifizierung und Charakterisierung der potenziellen Gene erforderlich sind, die die stomatale Musterung und Differenzierung steuern.

Die Beobachtung der Details der Pflanzenepidermis wurde typischerweise durch die Verwendung von Epidermisschalen mit oder ohne Färbung mit einem Farbstoff wie Toluidinblau O (TBO) oder Safranin^12,13,14 erreicht. Die größte Herausforderung dieser Methoden besteht jedoch darin, dass sie ein spezielles Training erfordern, um die Blattepidermis zu schälen, ohne das Gewebe zu zerreißen, und um die Musterdaten sorgfältig zu beobachten und zu analysieren, während die Bilder vermieden werden, die von verschiedenen Teilen des Blattes aufgenommen wurden. Chemische Behandlungen zur Reinigung der Gewebeproben mit Reagenzien wie Chloralhydrat-basierten Reinigungslösungen wurden auch häufig für eine Vielzahl von biologischen Materialien verwendet ^8,15; Diese Behandlungen erzeugen zwar viele phänotypische Informationen, indem sie qualitativ hochwertige Bilder liefern, erfordern aber auch den Einsatz gefährlicher Chemikalien (z. B. Formaldehyd, Chloralhydrat). In diesem Artikel wird zunächst eine relativ einfache und bequeme Phänotypisierungsmethode vorgestellt, die Bilder erzeugt, die für eine quantitative Analyse ausreichen, aber nicht die Verwendung gefährlicher Chemikalien und epidermaler Blattschalen für die Probenvorbereitung erfordert. Eine TBO-gefärbte Keimblattepidermis ist auch ideal für die Untersuchung der stomatalen Entwicklung, da das Fehlen von Trichomen und der geringere Entwicklungsgradient in Keimblättern eine einfache und handhabbare Interpretation der epidermalen Phänotypen ermöglichen.

Stomatale EPF-Peptide gehören zur Gruppe der pflanzenspezifischen, cysteinreichen Peptide, die relativ große reife Größen und intramolekulare Disulfidbindungen zwischen konservierten Cysteinresten aufweisen. Die korrekte Konformationsfaltung ist entscheidend für ihre biologische Funktion, aber Cystein-reiche Peptide, die entweder durch chemische Synthese oder ein heterologes Rekombinationssystem hergestellt werden, können inaktiv sein und sind eine Mischung aus richtig gefalteten und ungefalteten Peptiden ^3,7,16. Daher war das Screening von bioaktiven Peptiden, die eine Rolle bei der Kontrolle der stomatalen Entwicklung spielen, eine sehr herausfordernde Aufgabe. Dieses Manuskript beschreibt zusätzlich einen Bioassay zur besseren Identifizierung und Charakterisierung von bioaktiven stomatalen Peptiden. Bei dieser Methode werden Arabidopsis-Sämlinge 6-7 Tage lang in einer Multi-Well-Platte gezüchtet, die Medien mit und ohne potenzielle Peptide enthält. Dann wird die Keimblattepidermis mit einem konfokalen Mikroskop sichtbar gemacht. Um die biologische Aktivität potenzieller Peptide in der Entwicklung der Stomata deutlich sichtbar zu machen, werden im Allgemeinen zusätzlich zur Wildtyp-Arabidopsis-Kontrolle (Col-0) zusätzlich zur Wildtyp-Arabidopsis-Kontrolle (Col-0) die Wildtyp-Arabidopsis-Kontrolle (Col-0) verwendet, die mehr Epidermiszellen produziert.

Insgesamt können die beiden hier vorgestellten Protokolle für die schnelle und effiziente Beurteilung verschiedener epidermaler Phänotypen und für das Screening kleiner Peptide und Hormone verwendet werden, die eine Rolle bei der Kontrolle der stomatalen Musterung und Entwicklung spielen.

Protokoll

1. Färbung von Arabidopsis-Keimblättern mit TBO

1. Saatgutsterilisation und Wachstumsbedingungen
   1. Sterilisieren Sie ~ 30 Arabidopsis-Samen pro Genotyp in einem Mikrozentrifugenröhrchen, indem Sie 1 ml einer Samensterilisationslösung (33% handelsübliches Bleichmittel, 0,1% Triton X-100) hinzufügen und 10-12 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) vorsichtig schaukeln.
      HINWEIS: Sterilisieren Sie ~ 30 Samen des Wildtyp-Arabidopsis-Beitritts Columbia (Col-0) und/oder ~ 60 Samen transgener Pflanzen, die ein chemisch induzierbares Gen (z. B. Est::EPF2⁷) tragen, um transgene Sämlinge zu verwenden, die auf 1/2 Murashige- und Skoog (MS)-Platten (2,16 g/L mit 0,8% Agar [w/v]) ohne Induktor (z. B. β-Östradiol) als Kontrollen gezüchtet wurden (Abbildung 1 und Abbildung 2).
   2. Entfernen Sie die Sterilisationslösung, waschen Sie die Samen viermal mit 1 ml sterilem Wasser in einer Laminar-Flow-Haube und resuspendieren Sie sie in ~200 μl sterilem 0,1%igem Agar.
   3. Säen Sie ~30 Samen pro Genotyp auf 1/2 MS-Agarplatten oder 1/2 MS-Agarplatten, die einen Induktor (z. B. 10 μM β-Östradiol) für die chemische Induktion des Transgens (z. B. Est::EPF2⁷) mit einer Pipette enthalten, und versiegeln Sie sie mit Mikroporenband.
      HINWEIS: Die Samen müssen gleichmäßig auf dem Teller verteilt werden, um zu vermeiden, dass sie in unmittelbarer Nähe platziert werden, da dies verhindert, dass die Sämlinge gleichmäßig wachsen.
   4. Schichten Sie die Samen, indem Sie die Platten 3-5 Tage lang bei 4 °C ohne Licht platzieren, um die Keimung zu synchronisieren.
   5. Nach der Schichtung werden die Platten in einer Wachstumskammer bei 22 °C unter 120 μmol·m⁻²·s⁻¹ Licht mit einer Photoperiode von 16 h Licht und 8 h Dunkelheit für 10 Tage inkubiert.
2. Probenahme und TBO-Färbung von Arabidopsis-Keimblättern
   1. Wählen Sie 10 Tage nach der Keimung sorgfältig eines der Keimblätter aus den einzelnen Sämlingen aus und schneiden Sie sie aus, die gleichmäßig mit anderen Sämlingen auf dem Teller wachsen, um die Variabilität zu begrenzen.
      HINWEIS: Keimblätter werden von 10 Tage alten Sämlingen entnommen, da sie keine Trichome und unreife Epidermiszellen aufweisen, was die Interpretation der epidermalen Phänotypen vereinfacht.
   2. Jedes Keimblatt wird mit einer Pinzette in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, das 1 ml einer Fixierlösung (9:1 Ethanol zu Essigsäure) enthält, und die Probe mindestens über Nacht und bei Raumtemperatur in der Fixierlösung belassen.
      HINWEIS: In diesem Zustand können die Proben dann bis zu einigen Jahren gelagert werden. Das Bild Abbildung 2E wurde aus einer Keimblattprobe entnommen, die über 3 Jahre in Fixierlösung gelagert wurde. Es ist wichtig, das Keimblatt unmittelbar nach dem Schneiden in einer Fixierlösung aufzubewahren und nicht mehr als fünf Keimblätter in jedes Mikrozentrifugenröhrchen zu legen, um später eine homogene Probenvorbereitung zu gewährleisten.
   3. Entfernen Sie die Fixierlösung und fügen Sie 1 ml 70% Ethanol hinzu. Nachdem Sie das Röhrchen ein paar Mal umgedreht haben, lassen Sie das Röhrchen mit den Proben ~ 30 Minuten lang bei RT.
   4. Wiederholen Sie Schritt 1.2.3 mit 1 ml 50% Ethanol und dann 20% Ethanol.
   5. Ersetzen Sie die 1 ml 20% Ethanol durch 1 ml destilliertes Wasser und lassen Sie dann das Röhrchen mit den Keimblattproben für ~ 30 Minuten stehen, nachdem Sie das Röhrchen einige Male umgedreht haben.
      HINWEIS: Die Proben können länger als 24 Stunden in destilliertem Wasser verbleiben, dies wird jedoch nicht empfohlen, um qualitativ hochwertige Bilder (gut gefärbte Bilder für verschiedene epidermale Zelltypen) für die quantitative Analyse zu erhalten.
   6. Entfernen Sie das gesamte destillierte Wasser aus dem Röhrchen. Fügen Sie dann sofort ~200 μl TBO-Färbelösung (0,5% TBO in H 2 O, filtriert) für ~₂min hinzu.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass jede Keimblattprobe gleichmäßig der TBO-Lösung ausgesetzt ist, indem Sie die Röhrchen während der Inkubation vorsichtig schnippen. Um eine Überfärbung mit TBO zu vermeiden (der Zeitpunkt der Färbung ist wichtig und kann für jeden Genotyp variabel sein), verarbeiten Sie nicht mehr als sechs Röhrchen mit Proben gleichzeitig.
   7. Entfernen Sie die TBO-Färbelösung so gründlich wie möglich und waschen Sie die Proben dann sofort einige Male, indem Sie 1 ml frisches destilliertes Wasser hinzufügen.
3. Bildgebung und Datenanalyse
   1. Nehmen Sie einen Objektträger und fügen Sie einen Tropfen 15% Glycerin (~50 μl) hinzu. Legen Sie das Keimblatt mit der abaxialen Seite nach oben mit einer feinen Pinzette in 15% Glycerin auf den Objektträger. Decken Sie es dann vorsichtig mit einem Deckglas ab, damit gebildete Luftblasen aus der Probe entfernt werden können.
   2. Stellen Sie die abaxiale Seite der Keimblattepidermis mit einem Hellfeldmikroskop dar (Abbildung 1 und Abbildung 2) und untersuchen Sie dann den epidermalen Phänotyp, indem Sie die Anzahl der Stomata und anderer epidermaler Zelltypen zählen.
   3. Berechnen Sie für jeden Genotyp den epidermalen Phänotyp mit den folgenden Formeln, die von Jangra et ^al.17 beschrieben werden:
      Stomataindex (%) = (Anzahl der Stomata/Gesamtzahl der Epidermiszellen) × 100
      Stomatadichte (mm⁻²) = Anzahl der Stomata/Fläche (^{mm 2})
      ANMERKUNG: Stellen Sie mindestens acht Keimblätter (N = 8) für jeden Genotyp dar und dokumentieren Sie den epidermalen Phänotyp jedes Genotyps, indem Sie ihn mit dem Phänotyp der Wildtyppflanze und/oder transgenen Pflanzen vergleichen, die ein chemisch induzierbares Transgen exprimieren, das ohne Induktor gezüchtet wurde.

2. Bioassays für stomatale Peptide

HINWEIS: Das Verfahren für Bioassays ist in Abbildung 3 dargestellt.

1. Saatgutsterilisation und Wachstumsbedingungen
   1. Sterilisieren Sie ~ 25 Samen für jede Behandlung wie oben beschrieben und säen Sie ungefähr die Hälfte der Samen auf jede der zwei 1/2 MS-Agarplatten in einer Laminar-Flow-Haube.
      HINWEIS: Verwenden Sie den Genotyp mit hohen und/oder niedrigen Epidermiszellen (z. B. epf2²), anstatt einen Wildtyp-Hintergrund (z. B. Col-0) zu verwenden, um die biologischen Aktivitäten der Peptide auf die epidermale Zellstrukturierung und -differenzierung leicht zu erkennen (Abbildung 4).
   2. Die Samen 3 Tage bei 4 °C im Dunkeln schichten.
   3. Nehmen Sie jede der beiden Platten in Abständen von ~10 h heraus und inkubieren Sie die Samen auf Platten bei 22 °C unter 120 μmol·m⁻²·s⁻¹ Licht mit einer Photoperiode von 16 h Licht und 8 h Dunkelheit für 1 Tag.
2. Peptidbehandlung und Bildgebung
   1. Verpflanzen Sie in einer Laminar-Flow-Haube vorsichtig 10-12 einen Tag alte Arabidopsis-Sämlinge von jeder der beiden vorbereiteten Platten in eine 24-Well-Platte, die 1,5 ml 1/2 MS flüssiges Medium in jeder Vertiefung enthält (~ 20 Sämlinge pro Vertiefung).
      HINWEIS: Der Zeitpunkt der Peptidbehandlung für die Sämlinge ist entscheidend für die phänotypischen Ergebnisse der Peptidbehandlung, also bereiten Sie die Samen auf zwei separaten Tellern vor, um zwei verschiedene Entwicklungsstadien der Sämlinge für die Behandlung zu erhalten.
   2. Geben Sie entweder einen Puffer allein (50 mM Tris-HCl [pH 8,0]) oder zwei verschiedene Konzentrationen des Peptids (typischerweise 1 μM und 2,5 μM Peptid in 50 mM Tris-HCl [pH 8,0]) in jede Vertiefung, die ~20 einen Tag alte Arabidopsis-Sämlinge enthält, die auf 1/2 MS-Agarplatten gekeimt wurden.
      HINWEIS: Nehmen Sie die Peptidlösungsaliquote aus einem Gefrierschrank und bewahren Sie sie vor der Behandlung einige Minuten lang auf RT auf. Peptide, die in einem Gefrierschrank bei -80 °C gelagert werden, sind einige Jahre lang stabil, aber Frost-Tau-Zyklen sollten vermieden werden, indem die Peptidlösung in kleinen Aliquoten gelagert wird.
   3. Nachdem Sie die Sämlinge vorsichtig mit einem Puffer allein oder einer Peptidlösung mit einer Pipette gemischt haben, verschließen Sie die Platte mit Mikroporenband. Inkubation der Assay-Platte unter Langzeitbedingungen (16 h Photoperiode, 120 μmol·m−2·s⁻¹ Licht) für 5-7 Tage bei ²² °C.
      HINWEIS: Verhindern Sie, dass die Sämlinge zu nahe beieinander wachsen, damit jeder Sämling der Peptidlösung ausgesetzt ist. Drehen Sie die Platte vorsichtig für 2-3 Stunden, bevor Sie die Platte in einer Wachstumskammer inkubieren, um die Belüftung zu erhöhen.
   4. Übertragen Sie jeden Sämling aus der Vertiefung, die entweder Puffer allein oder Peptid enthält, auf einen Objektträger und sezieren Sie das Keimblatt des Sämlings. Legen Sie die abaxiale Seite des Keimblatts mit einer Pinzette nach oben und schneiden Sie sie in kleine Stücke.
   5. Nehmen Sie einen weiteren sauberen Objektträger und geben Sie einen Tropfen Propidiumiodidlösung (~25 μl, 2 mg/ml in H₂O) darauf.
   6. Legen Sie eines der kleinen Keimblattstücke mit einer Pinzette in einen Tropfen Propidiumiodidlösung und legen Sie das Deckglas vorsichtig auf. Tragen Sie zusätzliche Propidiumiodidlösung auf den Rand des Deckglases auf, um gebildete Luftblasen zu entfernen.
   7. Bilden Sie die abaxiale Seite des Keimblatts mit einem konfokalen Mikroskop ab und vergleichen Sie die Bilder mit den Bildern von Sämlingen, die in 1/2 MS-Medium gezüchtet wurden, das nur Puffer enthält.
      HINWEIS: Die in Abbildung 4 dargestellten Bilder wurden von Wildtyp-Keimlingen des Typs Col-0 oder epf2^2,5 aufgenommen, die nur mit Puffer (Abbildung 4A, B) oder zwei Chargen EPF2-Peptidlösung (Abbildung 4C-F) behandelt und bei -80 °C über 1 Jahr gelagert wurden.

Ergebnisse

Verschiedene stomatale transgene Pflanzen und Mutanten, von denen bekannt ist, dass sie weniger oder mehr stomatale Dichte und Clusterbildung aufweisen (epf2 2,5, epf1, epf2^2,5, tmm 12, eine STOMAGEN-stummgeschaltete Linie⁴, und transgene Linien^, die das Estradiol-induzierbare Est::EPF1- oder Est::EPF2-Überexpressionskonstrukt ^...

Diskussion

Die beiden hier vorgestellten phänotypischen Analysemethoden zur Identifizierung und Charakterisierung der Gene, die die stomatale Musterung und Differenzierung steuern, sind praktische und zuverlässige Assays, da die Protokolle nicht die Verwendung von epidermalen Peelings und speziellen Geräten erfordern (die zeitaufwändig sind und eine spezielle Schulung für die Probenvorbereitung erfordern), aber qualitativ hochwertige Bilder für die quantitative Analyse von epidermalen Phänotypen erzeugen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 mm x 18 mm cover slip	VWR	16004-326
24-well sterile plates with lid	VWR	CA62406-183
3M Micropore surgical tape	Fisher Scientific	19-027-761	Microporous surgical paper tape used to seal MS plates
76 x 26 mm Microscope slide	TLG	GEW90-2575-03
Acetic acid, ≥99.8%	Fisher Scientific	A38-212
Agar	BioShop	AGR001.1
Bleech	Household bleach (e.g., Clorox)
Confocal microscope	Nikon		Nikon C2 operated by NIS-Elements
Ethanol	Greenfield	P210EAAN
FIJI	Open-srouce	(Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j	Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/
Forceps	Sigma-Aldrich	F6521
Gamborg's vitamin mixture	Cassson Labs	GBL01-100ML	Store at 4 °C
Glycerol	Fisher Scientific	G33-4
Growth chambers	Conviron, model E15		16h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1.
Lights	HD Supply	25272	Fluorescent  lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K
Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	14-222-155	Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization
Microscope	Nikon		Nikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera
Murashige and Skoog basal salts	Cassson Labs	MSP01-1LT	Store at 4 °C
Petri Dish 100 mm x 20 mm	Fisher Scientific	08-757-11Z	Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana
Propidium Iodide	VWR	39139-064
Scalpel	Fisher Scientific	08-916-5A
Sucrose	BioShop	SUC700.5
Toluidine blue O	Sigma-Aldrich	T3260-5G
Tris base	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-100ML
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758