זיהוי הגנים המעורבים בהתפתחות סטומאטלית באמצעות ניקוד פנוטיפ אפידרמלי

Summary

מאמר זה מתאר שתי שיטות פנוטיפ ללא שימוש בקליפות אפידרמיס כדי לאפיין את הגנים השולטים בהתפתחות הסטומטלית. השיטה הראשונה מדגימה כיצד לנתח פנוטיפ סטומטלי באמצעות אפידרמיס צמחי מוכתם O כחול טולוידין. השיטה השנייה מתארת כיצד לזהות ליגנדות סטומטיות ולנטר את פעילותן הביולוגית.

Abstract

סטומטות הן נקבוביות קטנות על פני השטח של צמחי יבשה המעורבות בחילופי גזים ובשחרור אדי מים, ותפקידן קריטי לפריון הצמח ולהישרדותו. ככזו, להבנת המנגנונים שבאמצעותם מתפתחות ותבניות הפיוניות יש ערך אגרונומי עצום. מאמר זה מתאר שתי שיטות פנוטיפיות המשתמשות בקוטילדונים Arabidopsis שניתן להשתמש בהן כדי לאפיין את הגנים השולטים בהתפתחות ובתבניות סטומטליות. תחילה מוצגים נהלים לניתוח הפנוטיפים הסטומאטליים באמצעות cotyledons מוכתמים O כחול toluidine. שיטה זו מהירה ואמינה ואינה דורשת שימוש בקליפות אפידרמיס, הנמצאות בשימוש נרחב לניתוחים פנוטיפיים אך דורשות הכשרה מיוחדת. בשל נוכחותן של שאריות ציסטאין מרובות, הזיהוי והייצור של פפטידים ביו-אקטיביים מסוג EPF שיש להם תפקיד בהתפתחות סטומטלית היו מאתגרים. לפיכך, השני הוא הליך המשמש לזיהוי ליגנדות stomatal וניטור הפעילות הביולוגית שלהם על ידי bioassays. יתרונה העיקרי של שיטה זו הוא בכך שהיא מפיקה נתונים הניתנים לשחזור בקלות יחסית, תוך הפחתת כמות תמיסת הפפטיד והזמן הנדרש לאפיון תפקידם של הפפטידים בשליטה על דפוס סטומטלי והתפתחותו. בסך הכל, פרוטוקולים מתוכננים היטב אלה משפרים את היעילות של לימוד הרגולטורים הסטומאטליים הפוטנציאליים, כולל פפטידים מפרישים עשירים בציסטאין, הדורשים מבנים מורכבים ביותר לפעילותם.

Introduction

דפוסים והתמיינות נכונים של הפיוניות של הצמח הם קריטיים לתפקודם בשני תהליכים ביולוגיים בסיסיים, פוטוסינתזה וטרנספירציה, והם נאכפים על ידי מסלולי איתות פפטידים EPF. בארבידופסיס, שלושה פפטידים עשירים בציסטאין המופרשים, EPF1, EPF2 ו-STOMAGEN/EPFL9, שולטים בהיבטים שונים של התפתחות סטומטית ונתפסים על ידי רכיבי קולטן פני השטח של התא, כולל קינאזות קולטן ממשפחת ERECTA (ER, ERL1 ו-ERL2), SERK ו-TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . הכרה זו מובילה לאחר מכן להפחתת הרגולציה של גורמי השעתוק המקדמים התמיינות סטומטית בתהליך תלוי MAPK¹¹. הגילוי של גנים סטומטיים מרכזיים אלה מושג בעיקר על ידי סינון פנוטיפי של מוטנטים המציגים פגמים אפידרמיסים. מאמר זה מציג שיטות פנוטיפ פשוטות ויעילות יחסית להדמיית הפיוניות ותאי אפידרמיס אחרים, הנדרשות כדי לזהות ולאפיין את הגנים הפוטנציאליים השולטים בתבניות ובהתמיינות הסטומטלית.

התצפית על פרטי האפידרמיס של הצמח הושגה בדרך כלל באמצעות קליפות אפידרמיס עם או בלי כתמים בצבע כגון toluidine blue O (TBO) או ספרנין^12,13,14. עם זאת, האתגר העיקרי של שיטות אלה הוא שהן דורשות הכשרה מיוחדת כדי לקלף את אפידרמיס העלה מבלי לקרוע את הרקמות ולהתבונן ולנתח בקפידה את נתוני הדפוסים תוך הימנעות מתמונות שצולמו מחלקים שונים של העלה. טיפולים כימיים לניקוי דגימות הרקמה באמצעות ריאגנטים כגון תמיסות ניקוי מבוססות כלורל הידרט היו בשימוש נרחב גם עבור מגוון רחב של חומרים ביולוגיים ^8,15; טיפולים אלה אכן מייצרים מידע פנוטיפי רב על ידי מתן תמונות באיכות גבוהה, אך גם דורשים שימוש בכימיקלים מסוכנים (למשל, פורמלדהיד, כלורל הידרט). מאמר זה מציג תחילה שיטת פנוטיפ קלה ונוחה יחסית, המפיקה תמונות המספיקות לניתוח כמותי, אך אינה דורשת שימוש בכימיקלים מסוכנים ובקליפות עלי אפידרמיס להכנת הדגימה. אפידרמיס cotyledon מוכתם TBO הוא גם אידיאלי לחקר התפתחות stomatal כי חוסר טריכומות ואת שיפוע התפתחותי קטן יותר cotyledons לאפשר פרשנות פשוטה ו tractable של פנוטיפים האפידרמיס.

פפטידים סטומאטליים EPF שייכים לקבוצה של פפטידים ספציפיים לצמחים, עשירים בציסטאין, בעלי גדלים בוגרים גדולים יחסית וקשרים דיסולפידים תוך-מולקולריים בין שאריות ציסטאין משומרות. קיפול קונפורמטיבי נכון הוא קריטי לתפקודם הביולוגי, אך פפטידים עשירים בציסטאין, המיוצרים על ידי סינתזה כימית או מערכת רקומבינציה הטרולוגית, יכולים להיות לא פעילים והם תערובת של פפטידים מקופלים כראוי ולא מקופלים ^3,7,16. לפיכך, סינון של פפטידים ביו-אקטיביים שיש להם תפקיד בבקרת התפתחות סטומטית היה משימה מאתגרת מאוד. כתב יד זה מתאר בנוסף בדיקה ביולוגית לזיהוי ואפיון טוב יותר של פפטידים סטומאטליים ביו-אקטיביים. בשיטה זו, שתילי Arabidopsis גדלים בצלחת רב באר המכילה מדיה עם וללא פפטידים פוטנציאליים במשך 6-7 ימים. לאחר מכן, אפידרמיס cotyledon הוא דמיינו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. באופן כללי, כדי להמחיש בבירור את הפעילות הביולוגית של פפטידים פוטנציאליים בהתפתחות סטומטלית, הגנוטיפים המייצרים יותר ו / או פחות תאי שושלת סטומטלית, כגון מוטנט epf2, המייצר יותר תאי אפידרמיס, וקו STOMAGEN-ami, המקנה צפיפות תאי אפידרמיס מופחתת ^2,4,5, משמשים בנוסף לבקרת Arabidopsis מסוג פראי (Col-0) עבור bioassays.

בסך הכל, שני הפרוטוקולים המוצגים כאן יכולים לשמש להערכה מהירה ויעילה של פנוטיפים אפידרמליים שונים ולסינון פפטידים קטנים והורמונים שיש להם תפקיד בבקרת דפוס סטומטלי והתפתחות.

Protocol

1. צביעת ארבידופסיס קוטילדונים עם TBO

1. עיקור זרעים ותנאי גידול
   1. יש לעקר ~30 זרעי Arabidopsis לכל גנוטיפ בצינור מיקרוצנטריפוגה על ידי הוספת 1 מ"ל של תמיסת עיקור זרעים (33% אקונומיקה מסחרית, 0.1% Triton X-100), ולנענע בעדינות במשך 10-12 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
      הערה: יש לעקר ~30 זרעים של ה-Arabidopsis Columbia (Col-0) ו/או ~60 זרעים של צמחים טרנסגניים הנושאים גן כימי (לדוגמה, Est::EPF2⁷) כדי להשתמש בשתילים טרנסגניים שגדלו על 1/2 לוחות Murashige ו-Skoog (MS) (2.16 גרם/ליטר המכילים 0.8% אגר [w/v]) ללא השראה (למשל, β-אסטרדיול) כביקורת (איור 1 ואיור 2).
   2. הסר את תמיסת העיקור, שטוף את הזרעים ארבע פעמים עם 1 מ"ל של מים סטריליים במכסה מנוע זרימה למינרית, והשהה אותם מחדש ב~ 200 מיקרוליטר של אגר סטרילי 0.1%.
   3. זרעו ~ 30 זרעים לכל גנוטיפ על 1/2 לוחות אגר MS או 1/2 לוחות אגר MS המכילים משרה (למשל, 10 מיקרומטר β-אסטרדיול) להשראות כימית של הטרנסגן (למשל, Est::EPF2⁷) באמצעות פיפטה, ואטמו עם סרט מיקרו-נקבוביות.
      הערה: הזרעים צריכים להיות מפוזרים באופן שווה על הצלחת כדי למנוע הצבתם בקרבה, שכן זה ימנע מהשתילים לגדול באופן אחיד.
   4. לרבד את הזרעים על ידי הצבת הצלחות ב 4 ° C ללא אור במשך 3-5 ימים כדי לסנכרן את הנביטה.
   5. לאחר הריבוד, יש לדגור על הלוחות בתא גידול בטמפרטורה של 22°C מתחת ל-120 μmol·m−²·s⁻¹ אור עם פוטו-תקופה של 16 שעות אור ו-8 שעות חושך למשך 10 ימים.
2. דגימה וצביעת TBO של Arabidopsis cotyledons
   1. ב 10 ימים לאחר הנביטה, בזהירות לבחור ולחתוך אחד cotyledons מן שתילים בודדים כי הם גדלים באופן אחיד עם שתילים אחרים על הצלחת כדי להגביל את השונות.
      הערה: Cotyledons נדגמים שתילים בני 10 ימים כי אין להם טריכומות ותאי אפידרמיס לא בוגרים, אשר מפשט את הפרשנות של פנוטיפים האפידרמיס.
   2. הכניסו כל קוטילדון לצינור מיקרוצנטריפוגה המכיל 1 מ"ל של תמיסת קיבוע (אתנול 9:1 לחומצה אצטית) באמצעות מלקחיים, והשאירו את הדגימה בתמיסת הקיבוע למשך הלילה, לכל הפחות ובטמפרטורת החדר.
      הערה: לאחר מכן ניתן לאחסן את הדגימות עד כמה שנים במצב זה. התמונה איור 2E נלקחה מדגימת קוטילדון שאוחסנה בתמיסת קיבוע במשך יותר מ-3 שנים. חשוב לשמור את הקוטילדון בתמיסת קיבוע מיד לאחר החיתוך ולהניח לא יותר מחמישה קוטילדונים בכל צינור מיקרוצנטריפוגה להכנת דגימה הומוגנית מאוחר יותר.
   3. הסר את פתרון הקיבוע, ולהוסיף 1 מ"ל של 70% אתנול. לאחר היפוך הצינור כמה פעמים, השאר את הצינור המכיל את הדגימות ב- RT למשך ~ 30 דקות.
   4. חזור על שלב 1.2.3 באמצעות 1 מ"ל של 50% אתנול ולאחר מכן 20% אתנול.
   5. החלף את 1 מ"ל של אתנול 20% עם 1 מ"ל של מים מזוקקים, ולאחר מכן להשאיר את הצינור המכיל את דגימות cotyledon במשך ~ 30 דקות לאחר היפוך הצינור כמה פעמים.
      הערה: הדגימות עשויות להישאר במים מזוקקים במשך יותר מ -24 שעות, אך זה לא מומלץ לקבלת תמונות באיכות טובה (תמונות מוכתמות היטב עבור סוגים שונים של תאי אפידרמיס) לניתוח כמותי.
   6. מוציאים את כל המים המזוקקים מהצינור. לאחר מכן, הוסף מיד ~ 200 μL של תמיסת צביעת TBO (0.5% TBO ב- H₂O, מסונן) למשך ~2 דקות.
      הערה: ודא שכל דגימת קוטילדון נחשפת באופן שווה לתמיסת TBO על ידי תנועה עדינה של הצינורות במהלך הדגירה. כדי למנוע הכתמת יתר עם TBO (תזמון הצביעה חיוני ויכול להיות משתנה עבור כל גנוטיפ), אין לעבד יותר משש מבחנות המכילות דגימות בכל פעם.
   7. הסר את תמיסת צביעת TBO ביסודיות ככל האפשר, ולאחר מכן מיד לשטוף את הדגימות כמה פעמים על ידי הוספת 1 מ"ל של מים מזוקקים טריים.
3. הדמיה וניתוח נתונים
   1. קח שקופית מיקרוסקופ, והוסף טיפה של 15% גליצרול (~ 50 μL). מניחים את הקוטילדון עם הצד האבקסיאלי כלפי מעלה ל-15% גליצרול על המגלשה בעזרת מלקחיים עדינים. לאחר מכן, כסו אותו בעדינות עם כיסוי כך שניתן יהיה להסיר את כל בועות האוויר שנוצרו מהדגימה.
   2. דמיינו את הצד האבקסיאלי של אפידרמיס הקוטילדון באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר (איור 1 ואיור 2), ולאחר מכן בחנו את הפנוטיפ של האפידרמיס על-ידי ספירת מספר הפיוניות וסוגי תאי אפידרמיס אחרים.
   3. עבור כל גנוטיפ, חשב את הפנוטיפ האפידרמלי באמצעות הנוסחאות הבאות המתוארות על ידי Jangra et ^al.17:
      אינדקס סטומטלי (%) = (מספר הפיוניות/המספר הכולל של תאי האפידרמיס) × 100
      צפיפות סטומטית (mm⁻²) = מספר הפיוניות/שטח (מ"מ²)
      הערה: צלם לפחות שמונה קוטילדונים (N = 8) עבור כל גנוטיפ, ותעד את הפנוטיפ האפידרמלי של כל גנוטיפ על ידי השוואתו לפנוטיפ של צמח מסוג בר ו / או צמחים טרנסגניים המבטאים טרנסגן המושרה כימית שגדל ללא השראה.

2. בדיקות ביולוגיות לפפטידים סטומאטליים

הערה: הליך הבדיקות הביולוגיות מוצג באיור 3.

1. עיקור זרעים ותנאי גידול
   1. יש לעקר ~25 זרעים לכל טיפול כנ"ל, ולזרוע כמחצית מהזרעים על כל אחת משתי צלחות אגר 1/2 MS במכסה מנוע זרימה למינרית.
      הערה: השתמשו בגנוטיפ עם תאי אפידרמיס גבוהים ו/או נמוכים (למשל, epf2²) במקום להשתמש ברקע פראי (למשל, Col-0) כדי לזהות בקלות את הפעילות הביולוגית של הפפטידים על התבנית וההתמיינות של תאי האפידרמיס (איור 4).
   2. לרבד את הזרעים במשך 3 ימים ב 4 °C (75 °F) בחושך.
   3. הוציאו כל אחת משתי הצלחות במרווחים של ~10 שעות, ודגרו על הזרעים על צלחות בטמפרטורה של 22°C מתחת ל-120 μmol·m−²·s⁻¹ אור עם תקופת צילום של 16 שעות אור ו-8 שעות חושך למשך יום אחד.
2. טיפול והדמיית פפטיד
   1. במכסה מנוע זרימה למינרית, השתילו בזהירות 10-12 שתילי ארבידופסיס בני יום אחד מכל אחת משתי הצלחות המוכנות לצלחת בת 24 בארות המכילה 1.5 מ"ל של 1/2 מדיום נוזלי MS בכל באר (~ 20 שתילים לבאר).
      הערה: עיתוי הטיפול בפפטיד עבור השתילים הוא קריטי לתוצאות הפנוטיפיות של הטיפול בפפטידים, לכן הכינו את הזרעים בשתי צלחות נפרדות כדי לקבל שני שלבי התפתחות שתילים שונים לטיפול.
   2. הוסף חיץ בלבד (50 mM Tris-HCl [pH 8.0]) או שני ריכוזים שונים של הפפטיד (בדרך כלל, 1 μM ו- 2.5 μM פפטיד ב- 50 mM Tris-HCl [pH 8.0]) לכל באר המכילה ~ 20 שתילי Arabidopsis בני יום אחד שנבטו על 1/2 צלחות אגר MS.
      הערה: הוציאו את תמיסת הפפטיד מהמקפיא, ושמרו אותם ב-RT למשך מספר דקות לפני הטיפול. פפטידים המאוחסנים במקפיא בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס יציבים למשך מספר שנים, אך יש להימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה על ידי אחסון תמיסת הפפטיד באליציטוטים קטנים.
   3. לאחר ערבוב עדין של השתילים עם חיץ בלבד או תמיסת פפטיד באמצעות פיפטה, אטמו את הצלחת בסרט מיקרו-נקבוביות. לדגור על צלחת הבדיקה בתנאים של יום ארוך (16 שעות פוטופריוד, 120 μmol·m−2·s⁻¹ אור) במשך 5-7 ימים ב ²² ° C.
      הערה: מנעו מהשתילים לגדול קרוב מדי זה לזה כדי לאפשר לכל שתיל חשיפה אחידה לתמיסת הפפטידים. סובבו בעדינות את הצלחת במשך 2-3 שעות לפני הדגירה על הצלחת בתא גדילה כדי להגביר את האוורור.
   4. מעבירים כל שתיל מהבאר המכילה חיץ בלבד או פפטיד על שקופית כיסוי, ומנתחים את הקוטילדון של השתיל. מניחים את הצד האבקסיאלי של הקוטילדון בעזרת מלקחיים, וחותכים אותו לחתיכות קטנות.
   5. קחו עוד שקופית מיקרוסקופ נקייה, והניחו עליה טיפה של תמיסת יודיד פרופידיום (~25 μL, 2 מ"ג/מ"ל ב-H₂O).
   6. מניחים את אחת החתיכות הקטנות של קוטילדון לתוך טיפה של תמיסת יודיד פרופידיום באמצעות מלקחיים, ומניחים בעדינות את הכיסוי. יש למרוח תמיסת פרופידיום יודיד נוספת על קצה הכיסוי כדי להסיר בועות אוויר שנוצרו.
   7. דמיינו את הצד האבקסיאלי של הקוטילדון באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, והשוו את התמונות לתמונות משתילים שגדלו בתווך של 1/2 MS המכיל חיץ בלבד.
      הערה: התמונות שהוצגו באיור 4 נלקחו משתילי Col-0 או epf2^2,5 מסוג בר שטופלו בחיץ בלבד (איור 4A, B) או בשתי אצוות של תמיסת פפטיד EPF2 (איור 4C-F) ואוחסנו בטמפרטורה של -80°C במשך שנה אחת.

תוצאות

צמחים טרנסגניים סטומטיים שונים ומוטנטים הידועים כבעלי צפיפות סטומטית ואשכולות נמוכים או יותר (epf2 2,5, epf1 epf2^2,5, tmm^{12, קו 4} מושתק STOMAGEN, וקווים טרנסגניים הנושאים את מבנה ביטוי היתר Est::E...

Discussion

שתי שיטות הניתוח הפנוטיפיות לזיהוי ואפיון הגנים השולטים בתבניות ובהתמיינות הסטומטית המוצגות כאן הן בדיקות נוחות ואמינות, שכן הפרוטוקולים אינם דורשים שימוש בקליפות אפידרמיס ובציוד ייעודי (הגוזלים זמן רב ודורשים הכשרה מיוחדת להכנת דגימות) אך כן מפיקים תמונות איכותיות לניתוח כמותי של פנו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 mm x 18 mm cover slip	VWR	16004-326
24-well sterile plates with lid	VWR	CA62406-183
3M Micropore surgical tape	Fisher Scientific	19-027-761	Microporous surgical paper tape used to seal MS plates
76 x 26 mm Microscope slide	TLG	GEW90-2575-03
Acetic acid, ≥99.8%	Fisher Scientific	A38-212
Agar	BioShop	AGR001.1
Bleech	Household bleach (e.g., Clorox)
Confocal microscope	Nikon		Nikon C2 operated by NIS-Elements
Ethanol	Greenfield	P210EAAN
FIJI	Open-srouce	(Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j	Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/
Forceps	Sigma-Aldrich	F6521
Gamborg's vitamin mixture	Cassson Labs	GBL01-100ML	Store at 4 °C
Glycerol	Fisher Scientific	G33-4
Growth chambers	Conviron, model E15		16h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1.
Lights	HD Supply	25272	Fluorescent  lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K
Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	14-222-155	Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization
Microscope	Nikon		Nikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera
Murashige and Skoog basal salts	Cassson Labs	MSP01-1LT	Store at 4 °C
Petri Dish 100 mm x 20 mm	Fisher Scientific	08-757-11Z	Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana
Propidium Iodide	VWR	39139-064
Scalpel	Fisher Scientific	08-916-5A
Sucrose	BioShop	SUC700.5
Toluidine blue O	Sigma-Aldrich	T3260-5G
Tris base	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-100ML
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758