JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной работе описаны два метода фенотипирования без использования эпидермального пилинга для характеристики генов, контролирующих развитие устьиц. Первый метод демонстрирует, как анализировать фенотип устьиц с использованием эпидермиса растений, окрашенного толуидиновым синим О. Второй метод описывает, как идентифицировать устьичные лиганды и контролировать их биологическую активность.

Аннотация

Устьица — это небольшие поры на поверхности наземных растений, которые участвуют в газообмене и выделении водяного пара, и их функция имеет решающее значение для продуктивности и выживания растений. Таким образом, понимание механизмов, с помощью которых развиваются устьица, имеет огромное агрономическое значение. В этой статье описываются два фенотипических метода с использованием семядолей Arabidopsis , которые могут быть использованы для характеристики генов, контролирующих развитие устьиц и формирование паттернов. Сначала представлены процедуры анализа фенотипов устьиц с использованием толуидиновых О-окрашенных семядолей. Этот метод является быстрым и надежным и не требует использования эпидермальных пилингов, которые широко используются для фенотипических анализов, но требуют специальной подготовки. Из-за наличия множественных остатков цистеина идентификация и генерация биологически активных пептидов EPF, которые играют роль в развитии устьиц, были сложными. Таким образом, представленная вторая процедура используется для идентификации устьичных лигандов и мониторинга их биологической активности с помощью биопроб. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он относительно легко дает воспроизводимые данные при одновременном уменьшении количества раствора пептида и времени, необходимого для характеристики роли пептидов в контроле устьичного паттерна и развития. В целом, эти хорошо разработанные протоколы повышают эффективность изучения потенциальных устьичных регуляторов, включая богатые цистеином секреторные пептиды, которые требуют очень сложных структур для своей активности.

Введение

Правильное структурирование и дифференцировка устьиц растений имеют решающее значение для их функции в двух фундаментальных биологических процессах, фотосинтезе и транспирации, и обеспечиваются сигнальными путями пептида EPF. У Arabidopsis три секретируемых пептида, богатых цистеином, EPF1, EPF2 и STOMAGEN/EPFL9, контролируют различные аспекты развития устьиц и воспринимаются компонентами рецепторов клеточной поверхности, включая рецепторные киназы семейства ERECTA (ER, ERL1 и ERL2), SERK и TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Это распознавание затем приводит к подавлению транскрипционных факторов, которые способствуют дифференцировке устьиц с помощью MAPK-зависимого процесса11. Открытие этих основных генов устьиц в первую очередь достигается путем фенотипического скрининга мутантов с дефектами эпидермиса. В данной работе представлены относительно простые и эффективные методы фенотипирования для визуализации устьиц и других клеток эпидермиса, которые необходимы для идентификации и характеристики потенциальных генов, контролирующих паттерн и дифференцировку устьиц.

Наблюдение за деталями эпидермиса растений обычно достигалось с помощью эпидермальных пилингов с окрашиванием или без окрашивания красителем, таким как толуидиновый синий O (TBO) или сафранин12,13,14. Однако основная проблема этих методов заключается в том, что они требуют специальной подготовки для отшелушивания эпидермиса листа без разрыва тканей, а также для тщательного наблюдения и анализа данных рисунка, избегая изображений, сделанных из разных частей листа. Химическая обработка образцов тканей реагентами, такими как очищающие растворы на основе хлоралгидрата, также широко используется для различных биологических материалов 8,15; Эти методы лечения генерируют большой объем фенотипической информации, предоставляя высококачественные изображения, но также требуют использования опасных химических веществ (например, формальдегида, хлоралгидрата). В этой статье впервые представлен относительно простой и удобный метод фенотипирования, который дает изображения, достаточные для количественного анализа, но не требует использования опасных химических веществ и эпидермальных пилингов листьев для подготовки образца. Окрашенный в ТБО семядольный эпидермис также идеально подходит для изучения развития устьиц, поскольку отсутствие трихом и меньший градиент развития семядолей позволяют легко и легко интерпретировать фенотипы эпидермиса.

Устьичные пептиды EPF относятся к группе растительно-специфических, богатых цистеином пептидов, которые имеют относительно большие зрелые размеры и внутримолекулярные дисульфидные связи между консервативными остатками цистеина. Правильное конформационное сворачивание имеет решающее значение для их биологической функции, но богатые цистеином пептиды, которые продуцируются либо химическим синтезом, либо гетерологичной системой рекомбинации, могут быть неактивными и представлять собой смесь как правильно свернутых, так и развернутых пептидов 3,7,16. Таким образом, скрининг биологически активных пептидов, которые играют роль в контроле развития устьиц, был очень сложной задачей. В этой рукописи дополнительно описан биоанализ для лучшей идентификации и характеристики биологически активных устьичных пептидов. В этом методе проростки арабидопсиса выращивают в многолуночной тарелке, содержащей среду с потенциальными пептидами и без них, в течение 6-7 дней. Затем семядольный эпидермис визуализируется с помощью конфокального микроскопа. В целом, чтобы четко визуализировать биологическую активность потенциальных пептидов в развитии устьиц, генотипы, которые продуцируют больше и/или меньше клеток устьичной линии, такие как мутант epf2, который продуцирует больше клеток эпидермиса, и линия STOMAGEN-ami, которая обеспечивает пониженную плотность эпидермальных клеток 2,4,5, используются в дополнение к контролю Arabidopsis дикого типа (Col-0) для биоанализов.

В целом, два протокола, представленные здесь, могут быть использованы для быстрой и эффективной оценки различных фенотипов эпидермиса и для скрининга малых пептидов и гормонов, которые играют роль в контроле структуры и развития устьиц.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Окрашивание семядолей арабидопсиса с помощью TBO

  1. Стерилизация семян и условия роста
    1. Стерилизуйте ~ 30 семян арабидопсиса на генотип в микроцентрифужной пробирке, добавив 1 мл раствора для стерилизации семян (33% коммерческого отбеливателя, 0,1% Triton X-100), и осторожно качайте в течение 10-12 минут при комнатной температуре (RT).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стерилизуйте ~ 30 семян дикого типа Arabidopsis присоединения Columbia (Col-0) и / или ~ 60 семян трансгенных растений, несущих химически индуцируемый ген (например, Est::EPF27), чтобы использовать трансгенные проростки, выращенные на 1/2 планшетах Murashige и Skoog (MS) (2,16 г / л, содержащих 0,8% агара [мас./ об]) без индуктора (например, β-эстрадиола) в качестве контроля (рис. 1 и рис. 2).
    2. Удалите стерилизационный раствор, четыре раза промойте семена 1 мл стерильной воды в ламинарном колпаке и ресуспендируйте их в ~ 200 мкл стерильного 0,1% агара.
    3. Посейте ~ 30 семян на генотип на 1/2 агаровых пластин MS или 1/2 агаровых пластин MS, содержащих индуктор (например, 10 мкМ β-эстрадиола) для химической индукции трансгена (например, Est::EPF27) с помощью пипетки и запечатайте микропористой лентой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Семена нужно равномерно распределить на тарелке, чтобы не размещать их в непосредственной близости, так как это не позволит рассаде расти равномерно.
    4. Стратифицировате семена, поместив пластины при температуре 4 °C без света на 3-5 дней, чтобы синхронизировать прорастание.
    5. После стратификации пластины инкубируют в ростовой камере при 22 °C при освещении 120 мкмоль·м−2·с−1 с фотопериодом 16 ч света и 8 ч темноты в течение 10 дней.
  2. Отбор проб и окрашивание семядолей Arabidopsis и TBO
    1. Через 10 дней после появления всходов тщательно выберите и вырежьте одну из семядолей из отдельных сеянцев, которые равномерно растут вместе с другими саженцами на тарелке, чтобы ограничить изменчивость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Семядоли отбираются из 10-дневных сеянцев, потому что у них нет трихом и незрелых клеток эпидермиса, что упрощает интерпретацию фенотипов эпидермиса.
    2. Поместите каждый семядоль в микроцентрифужную пробирку, содержащую 1 мл фиксирующего раствора (9: 1 этанол до уксусной кислоты) с помощью щипцов, и оставьте образец в фиксирующем растворе на ночь, как минимум, и при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Затем образцы могут храниться до нескольких лет в этом состоянии. Изображение на рисунке 2E было взято из образца семядолей, который хранился в фиксирующем растворе более 3 лет. Важно держать семядоль в фиксирующем растворе сразу после резки и помещать не более пяти семядолей в каждую микроцентрифужную пробирку для последующей однородной пробоподготовки.
    3. Удалите фиксирующий раствор и добавьте 1 мл 70% этанола. После повторного переворачивания пробирки оставьте пробирку с образцами при РТ на ~ 30 мин.
    4. Повторите шаг 1.2.3, используя 1 мл 50% этанола, а затем 20% этанола.
    5. Замените 1 мл 20% этанола 1 мл дистиллированной воды, а затем оставьте пробирку с образцами семядолей на ~ 30 мин после нескольких инвертированных пробирок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут оставаться в дистиллированной воде более 24 часов, но это не рекомендуется для получения изображений хорошего качества (хорошо окрашенных изображений для различных типов клеток эпидермиса) для количественного анализа.
    6. Удалите всю дистиллированную воду из трубки. Затем немедленно добавьте ~ 200 мкл раствора для окрашивания TBO (0,5% TBO в H 2 O, отфильтрованный) в течение ~2мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что каждый образец семядольных элементов равномерно подвергается воздействию раствора TBO, осторожно щелкая пробирками во время инкубации. Чтобы предотвратить переокрашивание TBO (время окрашивания имеет важное значение и может варьироваться для каждого генотипа), не обрабатывайте более шести пробирок с образцами одновременно.
    7. Удалите раствор для окрашивания TBO как можно тщательнее, а затем сразу же промойте образцы пару раз, добавив 1 мл свежей дистиллированной воды.
  3. Визуализация и анализ данных
    1. Возьмите предметное стекло микроскопа и добавьте каплю 15% глицерина (~ 50 мкл). Поместите семядоль абаксиальной стороной вверх в 15% глицерин на предметное стекло с помощью тонких щипцов. Затем аккуратно накройте его покровным стеклом, чтобы из образца можно было удалить образовавшиеся пузырьки воздуха.
    2. Сфотографируйте абаксиальную сторону семядольного эпидермиса с помощью светлопольного микроскопа (рис. 1 и рис. 2), а затем исследуйте фенотип эпидермиса, подсчитав количество устьиц и других типов клеток эпидермиса.
    3. Для каждого генотипа рассчитайте эпидермальный фенотип, используя следующие формулы, описанные Jangra et al.17:
      Устьичный индекс (%) = (Количество устьиц/Общее количество клеток эпидермиса) × 100
      Плотность устьиц (мм−2) = Количество устьиц/площадь (мм2)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изобразите не менее восьми семядолей (N = 8) для каждого генотипа и задокументируйте эпидермальный фенотип каждого генотипа, сравнив его с фенотипом растения дикого типа и/или трансгенных растений, экспрессирующих химически индуцируемый трансген, выращенный без индуктора.

2. Биотесты на устьичные пептиды

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура проведения биопроб показана на рисунке 3.

  1. Стерилизация семян и условия роста
    1. Стерилизуйте ~ 25 семян для каждой обработки, как указано выше, и посейте примерно половину семян на каждую из двух агаровых пластин 1/2 мс в колпаке с ламинарным потоком.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте генотип с высокими и/или низкими эпидермальными клетками (например, epf22) вместо фона дикого типа (например, Col-0), чтобы легко обнаружить биологическую активность пептидов в паттерне и дифференцировке эпидермальных клеток (рис. 4).
    2. Стратифицировать семена в течение 3 дней при температуре 4 °C в темноте.
    3. Выньте каждую из двух пластин с интервалом ~ 10 ч и инкубируйте семена на пластинах при 22 ° C при освещении 120 мкмоль · м − 2 · с − 1 с фотопериодом 16 ч света и 8 ч темноты в течение 1 дня.
  2. Пептидная обработка и визуализация
    1. В ламинарный колпак осторожно пересадите 10-12 однодневных саженцев арабидопсиса с каждой из двух подготовленных пластин в 24-луночную тарелку, содержащую 1,5 мл жидкой среды 1/2 MS в каждой лунке (~ 20 саженцев на лунку).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время обработки проростков пептидами имеет решающее значение для фенотипических результатов пептидной обработки, поэтому подготовьте семена на двух отдельных пластинах, чтобы получить две разные стадии развития проростков для обработки.
    2. Добавьте либо один буфер (50 мМ Tris-HCl [рН 8,0]), либо две разные концентрации пептида (обычно 1 мкМ и 2,5 мкМ пептида в 50 мМ трис-HCl [рН 8,0]) в каждую лунку, содержащую ~ 20 однодневных проростков арабидопсиса , проросших на агаровых пластинах 1/2 мс.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Извлеките аликвоты из раствора пептидов из морозильной камеры и держите их при температуре RT в течение нескольких минут перед обработкой. Пептиды, хранящиеся в морозильной камере при температуре -80 °C, стабильны в течение нескольких лет, но следует избегать циклов замораживания-оттаивания, храня пептидный раствор в небольших аликвотах.
    3. Аккуратно перемешав рассаду с одним буфером или пептидным раствором с помощью пипетки, заклейте пластину микропористой лентой. Инкубируйте пробирную пластину в условиях длительного дня (фотопериод 16 ч, свет 120 мкмоль·м−2·с−1) в течение 5–7 дней при 22 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте, чтобы саженцы росли слишком близко друг к другу, чтобы каждый саженец мог равномерно подвергаться воздействию раствора пептидов. Осторожно вращайте пластину в течение 2-3 часов перед инкубацией пластины в камере роста, чтобы увеличить аэрацию.
    4. Перенесите каждый саженец из лунки, содержащей только буфер или пептид, на покровное стекло и рассеките семядоли саженца. Поместите абаксиальную сторону семядольного пуха вверх с помощью щипцов и разрежьте его на мелкие кусочки.
    5. Возьмите еще одно чистое предметное стекло микроскопа и поместите на него каплю раствора йодида пропидия (~ 25 мкл, 2 мг / мл в H2O).
    6. Поместите один из небольших кусочков семядоли в каплю раствора йодида пропидия с помощью щипцов и аккуратно поместите покровное стекло. Нанесите дополнительный раствор йодида пропидия на край покровного стекла, чтобы удалить образовавшиеся пузырьки воздуха.
    7. Сфотографируйте абаксиальную сторону семядольной области с помощью конфокального микроскопа и сравните изображения с изображениями сеянцев, выращенных в среде 1/2 мс, содержащей только буфер.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения, представленные на рисунке 4, были взяты из проростков дикого типа Col-0 или epf22,5, которые обрабатывали только буфером (рис. 4A, B) или двумя партиями раствора пептида EPF2 (рис. 4C-F) и хранили при -80 ° C в течение 1 года.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Известно, что различные устьичные трансгенные растения и мутанты имеют меньшую или большую плотность устьиц и кластеризацию (epf2 2,5, epf1 epf2 2,5, tmm12, STOMAGEN-молчаливая линия 4 и трансгенные линии<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Представленные здесь два метода фенотипического анализа для идентификации и характеристики генов, контролирующих паттерн и дифференцировку устьиц, являются удобными и надежными анализами, поскольку протоколы не требуют использования эпидермальных пилингов и специализированного о?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

О конфликте интересов не было заявлено.

Благодарности

Это исследование финансировалось в рамках программы Discovery Совета по природным ресурсам и инженерным исследованиям Канады (NSERC) и Университета Конкордия. К.Б. поддерживается Национальной зарубежной стипендией Индии.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
18 mm x 18 mm cover slipVWR16004-326
24-well sterile plates with lidVWRCA62406-183
3M Micropore surgical tapeFisher Scientific19-027-761Microporous surgical paper tape used to seal MS plates
76 x 26 mm Microscope slideTLGGEW90-2575-03
Acetic acid, ≥99.8% Fisher ScientificA38-212
AgarBioShopAGR001.1
BleechHousehold bleach (e.g., Clorox)
Confocal microscope Nikon Nikon C2 operated by NIS-Elements 
EthanolGreenfieldP210EAAN
FIJIOpen-srouce(Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3jDownloaded from https://imagej.net/software/fiji/
ForcepsSigma-AldrichF6521 
Gamborg's vitamin mixtureCassson LabsGBL01-100MLStore at 4 °C
GlycerolFisher ScientificG33-4
Growth chambersConviron, model E1516h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1.
LightsHD Supply25272Fluorescent  lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K 
Microcentrifuge tubeFisher Scientific14-222-155Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization
Microscope NikonNikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera
Murashige and Skoog basal salts Cassson LabsMSP01-1LTStore at 4 °C
Petri Dish 100 mm x 20 mm Fisher Scientific08-757-11ZPetri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana
Propidium Iodide VWR39139-064
ScalpelFisher Scientific08-916-5A
SucroseBioShopSUC700.5
Toluidine blue OSigma-AldrichT3260-5G
Tris baseSigma-AldrichT1503
Triton X-100Sigma-AldrichT8787-100ML
β-EstradiolSigma-AldrichE2758

Ссылки

  1. Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule. Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).
  2. Hara, K., et al. Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves. Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).
  3. Kondo, T., et al. Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule. Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).
  4. Sugano, S. S., et al. Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis. Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).
  5. Hunt, L., Gray, J. E. The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development. Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).
  6. Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development. New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).
  7. Lee, J. S., et al. Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning. Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).
  8. Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases. Science. 309 (5732), 290-293 (2005).
  9. Nadeau, J. A., Sack, F. D. Control of stomatal distribution on the Arabidopsis leaf surface. Science. 296 (5573), 1697-1700 (2002).
  10. Meng, X., et al. Differential function of Arabidopsis SERK family receptor-like kinases in stomatal patterning. Current Biology. 25 (18), 2361-2372 (2015).
  11. Lampard, G. R., Macalister, C. A., Bergmann, D. C. Arabidopsis stomatal initiation is controlled by MAPK-mediated regulation of the bHLH SPEECHLESS. Science. 322 (5904), 1113-1116 (2008).
  12. Yang, M., Sack, F. D. The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis. The Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).
  13. Theunissen, J. D. An improved method for studying grass leaf epidermis. Stain Technology. 64 (5), 239-242 (1989).
  14. Venkata, B. P., et al. crw1--A novel maize mutant highly susceptible to foliar damage by the western corn rootworm beetle. PLoS One. 8 (8), 71296(2013).
  15. Tucker, M. R., et al. Somatic small RNA pathways promote the mitotic events of megagametogenesis during female reproductive development in Arabidopsis. Development. 139 (8), 1399-1404 (2012).
  16. Ohki, S., Takeuchi, M., Mori, M. The NMR structure of stomagen reveals the basis of stomatal density regulation by plant peptide hormones. Nature Communications. 2, 512(2011).
  17. Jangra, R., et al. Duplicated antagonistic EPF peptides optimize grass stomatal initiation. Development. 148 (16), (2021).
  18. Zhao, C., Craig, J. C., Petzold, H. E., Dickerman, A. W., Beers, E. P. The xylem and phloem transcriptomes from secondary tissues of the Arabidopsis root-hypocotyl. Plant Physiology. 138 (2), 803-818 (2005).
  19. Uchida, N., et al. Regulation of inflorescence architecture by intertissue layer ligand-receptor communication between endodermis and phloem. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (16), 6337-6342 (2012).
  20. Tameshige, T., et al. A secreted peptide and its receptors shape the auxin response pattern and leaf margin morphogenesis. Current Biology. 26 (18), 2478-2485 (2016).
  21. Abrash, E. B., Davies, K. A., Bergmann, D. C. Generation of signaling specificity in Arabidopsis by spatially restricted buffering of ligand-receptor interactions. The Plant Cell. 23 (8), 2864-2879 (2011).
  22. Uchida, N., Tasaka, M. Regulation of plant vascular stem cells by endodermis-derived EPFL-family peptide hormones and phloem-expressed ERECTA-family receptor kinases. Journal of Experimental Botany. 64 (17), 5335-5343 (2013).
  23. Kosentka, P. Z., Overholt, A., Maradiaga, R., Mitoubsi, O., Shpak, E. D. EPFL Signals in the boundary region of the SAM restrict its size and promote leaf initiation. Plant Physiology. 179 (1), 265-279 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

191

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены