Identification des gènes impliqués dans le développement stomatique par notation du phénotype épidermique

Résumé

Cet article décrit deux méthodes de phénotypage sans l’utilisation de peelings épidermiques pour caractériser les gènes contrôlant le développement stomatique. La première méthode montre comment analyser un phénotype stomatique à l’aide d’un épiderme végétal coloré au bleu de toluidine O. La deuxième méthode décrit comment identifier les ligands stomatiques et surveiller leurs activités biologiques.

Résumé

Les stomates sont de petits pores à la surface des plantes terrestres qui sont impliqués dans les échanges gazeux et la libération de vapeur d’eau, et leur fonction est essentielle à la productivité et à la survie des plantes. En tant que tel, la compréhension des mécanismes par lesquels les stomates se développent et se modèlent a une valeur agronomique énorme. Cet article décrit deux méthodes phénotypiques utilisant des cotylédons d’Arabidopsis qui peuvent être utilisées pour caractériser les gènes contrôlant le développement stomatique et la structuration. Les procédures d’analyse des phénotypes stomatiques à l’aide de cotylédons colorés au bleu de toluidine sont présentées en premier. Cette méthode est rapide et fiable et ne nécessite pas l’utilisation de peelings épidermiques, qui sont largement utilisés pour les analyses phénotypiques mais nécessitent une formation spécialisée. En raison de la présence de multiples résidus de cystéine, l’identification et la génération de peptides EPF bioactifs qui jouent un rôle dans le développement stomatique ont été difficiles. Ainsi, présenté en second est une procédure utilisée pour identifier les ligands stomatiques et surveiller leur activité biologique par des essais biologiques. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle produit des données reproductibles relativement facilement tout en réduisant la quantité de solution peptidique et le temps nécessaire pour caractériser le rôle des peptides dans le contrôle de la structuration et du développement stomatiques. Dans l’ensemble, ces protocoles bien conçus améliorent l’efficacité de l’étude des régulateurs stomatiques potentiels, y compris les peptides sécrétoires riches en cystéine, qui nécessitent des structures très complexes pour leur activité.

Introduction

Une structuration et une différenciation appropriées des stomates des plantes sont essentielles à leur fonction dans deux processus biologiques fondamentaux, la photosynthèse et la transpiration, et sont renforcées par les voies de signalisation des peptides EPF. Chez Arabidopsis, trois peptides riches en cystéine sécrétés, EPF1, EPF2 et STOMAGEN/EPFL9, contrôlent différents aspects du développement stomatique et sont perçus par les composants récepteurs de surface cellulaire, y compris les kinases des récepteurs de la famille ERECTA (ER, ERL1 et ERL2), les SERK et TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Cette reconnaissance conduit alors à la régulation négative des facteurs de transcription qui favorisent la différenciation stomatique par un processus dépendant du MAPK¹¹. La découverte de ces gènes stomatiques centraux est principalement réalisée par le criblage phénotypique de mutants présentant des défauts épidermiques. Cet article présente des méthodes de phénotypage relativement simples et efficaces pour visualiser les stomates et autres cellules épidermiques, qui sont nécessaires pour identifier et caractériser les gènes potentiels contrôlant la structuration et la différenciation stomatiques.

L’observation des détails de l’épiderme de la plante a généralement été réalisée en utilisant des peelings épidermiques avec ou sans coloration avec un colorant tel que le bleu de toluidine O (TBO) ou la safranine^12,13,14. Cependant, le principal défi de ces méthodes est qu’elles nécessitent une formation spécialisée pour peler l’épiderme foliaire sans déchirer les tissus et pour observer et analyser attentivement les données de motifs tout en évitant les images prises à partir de différentes parties de la feuille. Les traitements chimiques visant à nettoyer les échantillons de tissus avec des réactifs tels que les solutions d’élimination à base d’hydrate de chloral ont également été largement utilisés pour diverses gammes de matières biologiques ^8,15; Ces traitements génèrent beaucoup d’informations phénotypiques en fournissant des images de haute qualité, mais nécessitent également l’utilisation de produits chimiques dangereux (par exemple, le formaldéhyde, l’hydrate de chloral). Cet article présente d’abord une méthode de phénotypage relativement simple et pratique qui produit des images suffisantes pour l’analyse quantitative, mais ne nécessite pas l’utilisation de produits chimiques dangereux et de pelures de feuilles épidermiques pour la préparation de l’échantillon. Un épiderme de cotylédon coloré au TBO est également idéal pour l’étude du développement stomatique car l’absence de trichomes et le gradient de développement plus petit chez les cotylédons permettent une interprétation simple et traitable des phénotypes épidermiques.

Les peptides EPF stomatiques appartiennent au groupe des peptides riches en cystéine spécifiques aux plantes qui ont des tailles matures relativement grandes et des liaisons disulfures intramoléculaires entre les résidus de cystéine conservés. Un repliement conformationnel correct est essentiel pour leur fonction biologique, mais les peptides riches en cystéine, qui sont produits par synthèse chimique ou par un système de recombinaison hétérologue, peuvent être inactifs et sont un mélange de peptides correctement repliés et dépliés ^3,7,16. Ainsi, le criblage des peptides bioactifs qui jouent un rôle dans le contrôle du développement stomatique a été une tâche très difficile. Ce manuscrit décrit en outre un essai biologique pour une meilleure identification et caractérisation des peptides stomatiques bioactifs. Dans cette méthode, les plantules d’Arabidopsis sont cultivées dans une plaque multipuits contenant des milieux avec et sans peptides potentiels pendant 6-7 jours. Ensuite, l’épiderme cotylédon est visualisé à l’aide d’un microscope confocal. En général, pour visualiser clairement l’activité biologique des peptides potentiels dans le développement stomatique, les génotypes qui produisent plus ou moins de cellules de lignée stomatiques, tels que le mutant epf2, qui produit plus de cellules épidermiques, et la lignée STOMAGEN-ami, qui confère une densité cellulaire épidermique réduite ^2,4,5, sont utilisés en plus du contrôle Arabidopsis de type sauvage (Col-0) pour les essais biologiques.

Dans l’ensemble, les deux protocoles présentés ici peuvent être utilisés pour l’évaluation rapide et efficace de divers phénotypes épidermiques et pour le criblage de petits peptides et hormones qui jouent un rôle dans le contrôle de la structuration et du développement stomatiques.

Protocole

1. Coloration des cotylédons d’Arabidopsis avec TBO

1. Stérilisation des semences et conditions de croissance
   1. Stériliser ~30 graines d’Arabidopsis par génotype dans un tube microcentrifuge en ajoutant 1 mL d’une solution de stérilisation des graines (33 % d’eau de Javel commerciale, 0,1 % de Triton X-100) et bercer doucement pendant 10 à 12 minutes à température ambiante (RT).
      REMARQUE : Stériliser ~30 graines de l’accession Columbia (Col-0) d’Arabidopsis de type sauvage et/ou ~60 graines de plantes transgéniques portant un gène chimiquement inductible (p. ex., Est::EPF2⁷) pour utiliser des semis transgéniques cultivés sur 1/2 plaques de Murashige et de Skoog (MS) (2,16 g/L contenant 0,8 % de gélose [p/v]) sans inducteur (p. ex. β-estradiol) comme témoins (figure 1 et figure 2).
   2. Retirez la solution de stérilisation, lavez les graines quatre fois avec 1 mL d’eau stérile dans une hotte à flux laminaire et remettez-les en suspension dans ~200 μL de gélose stérile à 0,1%.
   3. Semez ~30 graines par génotype sur des plaques de gélose 1/2 MS ou 1/2 plaques de gélose MS contenant un inducteur (p. ex., 10 μM β-estradiol) pour l’induction chimique du transgène (p. ex., Est::EPF2⁷) à l’aide d’une pipette, et scellez avec du ruban microporeux.
      REMARQUE: Les graines doivent être réparties uniformément sur l’assiette pour éviter de les placer à proximité, car cela empêcherait les plantules de pousser uniformément.
   4. Stratifier les graines en plaçant les plaques à 4 °C sans lumière pendant 3 à 5 jours pour synchroniser la germination.
   5. Après stratification, incuber les plaques dans une chambre de croissance à 22 °C sous 120 μmol·m−²·s⁻¹ lumière avec une photopériode de 16 h de lumière et 8 h d’obscurité pendant 10 jours.
2. Échantillonnage et coloration TBO des cotylédons d’Arabidopsis
   1. 10 jours après la germination, sélectionner et découper soigneusement l’un des cotylédons des plantules individuelles qui poussent uniformément avec les autres plantules dans l’assiette pour limiter la variabilité.
      NOTE: Les cotylédons sont échantillonnés à partir de plantules âgées de 10 jours parce qu’ils n’ont pas de trichomes et de cellules épidermiques immatures, ce qui simplifie l’interprétation des phénotypes épidermiques.
   2. Placer chaque cotylédon dans un tube à microcentrifugation contenant 1 mL d’une solution de fixation (éthanol 9:1 pour acide acétique) à l’aide d’une pince, et laisser l’échantillon dans la solution de fixation pendant la nuit, au moins et à température ambiante.
      REMARQUE: Les échantillons peuvent ensuite être stockés jusqu’à quelques années dans cet état. L’image Figure 2E a été prise à partir d’un échantillon de cotylédon qui a été stocké dans une solution de fixation pendant plus de 3 ans. Il est important de conserver le cotylédon dans une solution de fixation immédiatement après la coupe et de ne pas placer plus de cinq cotylédons dans chaque tube microcentrifuge pour une préparation homogène de l’échantillon par la suite.
   3. Retirer la solution fixatrice et ajouter 1 mL d’éthanol à 70 %. Après avoir retourné le tube plusieurs fois, laissez le tube contenant les échantillons à TA pendant ~ 30 min.
   4. Répétez l’étape 1.2.3 en utilisant 1 mL d’éthanol à 50 %, puis 20 % d’éthanol.
   5. Remplacez le 1 mL d’éthanol à 20 % par 1 mL d’eau distillée, puis laissez le tube contenant les échantillons de cotylédon pendant ~30 minutes après avoir retourné le tube plusieurs fois.
      NOTE: Les échantillons peuvent rester dans de l’eau distillée pendant plus de 24 heures, mais cela n’est pas recommandé pour obtenir des images de bonne qualité (images bien colorées pour différents types de cellules épidermiques) pour une analyse quantitative.
   6. Retirez toute l’eau distillée du tube. Ensuite, ajouter immédiatement ~200 μL de solution de coloration TBO (0,5% TBO dans_H2O, filtré) pendant ~2 min.
      REMARQUE: Assurez-vous que chaque échantillon de cotylédon est exposé uniformément à la solution de TBO en agitant doucement les tubes pendant l’incubation. Pour éviter la surcoloration avec TBO (le moment de la coloration est essentiel et peut être variable pour chaque génotype), ne traitez pas plus de six tubes contenant des échantillons à la fois.
   7. Retirez la solution de coloration TBO aussi soigneusement que possible, puis lavez immédiatement les échantillons plusieurs fois en ajoutant 1 mL d’eau distillée fraîche.
3. Imagerie et analyse de données
   1. Prenez une lame de microscope et ajoutez une goutte de glycérol à 15% (~ 50 μL). Placez le cotylédon avec la face abaxiale vers le haut dans 15% de glycérol sur la lame à l’aide d’une pince fine. Ensuite, couvrez-le délicatement avec une lamelle de couverture afin que les bulles d’air formées puissent être éliminées de l’échantillon.
   2. Imagez la face abaxiale de l’épiderme du cotylédon à l’aide d’un microscope à fond clair (Figure 1 et Figure 2), puis examinez le phénotype épidermique en comptant le nombre de stomates et d’autres types de cellules épidermiques.
   3. Pour chaque génotype, calculer le phénotype épidermique à l’aide des formules suivantes décrites par Jangra et ^coll.17 :
      Indice stomatique (%) = (Nombre de stomates/Nombre total de cellules épidermiques) × 100
      Densité stomatique (mm⁻²) = Nombre de stomates/surface (mm²)
      REMARQUE : Imager au moins huit cotylédons (N = 8) pour chaque génotype, et documenter le phénotype épidermique de chaque génotype en le comparant au phénotype de la plante de type sauvage et/ou des plantes transgéniques exprimant un transgène chimiquement inductible cultivé sans inducteur.

2. Bioessais pour les peptides stomatiques

REMARQUE : La procédure pour les essais biologiques est illustrée à la figure 3.

1. Stérilisation des semences et conditions de croissance
   1. Stériliser ~25 graines pour chaque traitement comme ci-dessus, et semer environ la moitié des graines sur chacune des deux plaques de gélose 1/2 MS dans une hotte à flux laminaire.
      REMARQUE : Utiliser le génotype avec des cellules épidermiques hautes et/ou basses (p. ex., epf2²) au lieu d’utiliser un fond de type sauvage (p. ex., Col-0) pour détecter facilement les activités biologiques des peptides sur la structuration et la différenciation des cellules épidermiques (Figure 4).
   2. Stratifier les graines pendant 3 jours à 4 °C dans l’obscurité.
   3. Sortir chacune des deux plaques à ~10 h d’intervalle, et incuber les graines sur des plaques à 22 °C sous 120 μmol·m−²·s⁻¹ lumière avec une photopériode de 16 h de lumière et 8 h d’obscurité pendant 1 jour.
2. Traitement peptidique et imagerie
   1. Dans une hotte à flux laminaire, transplanter soigneusement 10 à 12 plantules d’Arabidopsis âgées d’un jour de chacune des deux plaques préparées dans une plaque de 24 puits contenant 1,5 ml de milieu liquide 1/2 MS dans chaque puits (~20 plantules par puits).
      REMARQUE: Le moment du traitement peptidique pour les plantules est essentiel aux résultats phénotypiques du traitement peptidique, alors préparez les graines sur deux plaques distinctes pour obtenir deux stades de développement différents des plantules pour le traitement.
   2. Ajouter soit un tampon seul (50 mM Tris-HCl [pH 8,0]) ou deux concentrations différentes du peptide (généralement, 1 μM et 2,5 μM peptide dans 50 mM Tris-HCl [pH 8,0]) à chaque puits contenant ~20 plantules d’Arabidopsis d’un jour germées sur des plaques de gélose 1/2 MS.
      REMARQUE: Retirez les aliquotes de la solution peptidique d’un congélateur et conservez-les à TA pendant quelques minutes avant le traitement. Les peptides conservés dans un congélateur à −80 °C sont stables pendant quelques années, mais les cycles de congélation-dégel doivent être évités en stockant la solution peptidique dans de petites aliquotes.
   3. Après avoir mélangé délicatement les plantules avec un tampon seul ou une solution peptidique à l’aide d’une pipette, scellez la plaque avec du ruban microporeux. Incuber la plaque d’essai dans des conditions de longue journée (photopériode de 16 h, 120 μmol·m−2·s⁻¹ lumière) pendant 5-7 jours à ²² °C.
      REMARQUE: Empêcher les plantules de pousser trop près les unes des autres pour permettre à chaque plantule d’avoir une exposition uniforme à la solution peptidique. Tournez doucement la plaque pendant 2-3 h avant d’incuber la plaque dans une chambre de croissance pour augmenter l’aération.
   4. Transférer chaque plantule du puits contenant soit du tampon seul, soit du peptide sur une lame de couverture, et disséquer le cotylédon de la plantule. Placez la face abaxiale du cotylédon à l’aide d’une pince et coupez-la en petits morceaux.
   5. Prenez une autre lame de microscope propre et placez-y une goutte de solution d’iodure de propidium (~25 μL, 2 mg/mL dans_H2O).
   6. Placer l’un des petits morceaux de cotylédon dans une goutte de solution d’iodure de propidium à l’aide d’une pince et placer délicatement le couvercle. Appliquer une solution supplémentaire d’iodure de propidium sur le bord de la lamelle de couverture pour éliminer les bulles d’air qui se sont formées.
   7. Imagez la face abaxiale du cotylédon à l’aide d’un microscope confocal et comparez les images avec les images des plantules cultivées dans un milieu 1/2 MS contenant uniquement un tampon.
      NOTE: Les images présentées à la figure 4 ont été prises à partir de plantules de type sauvage Col-0 ou epf2^2,5 qui ont été traitées avec un tampon uniquement (Figure 4A, B) ou deux lots de solution peptidique EPF2 (Figure 4C-F) et ont été stockées à -80 °C pendant 1 an.

Résultats

Diverses plantes et mutants stomatiques transgéniques connus pour avoir une densité stomatique et un regroupement inférieurs ou supérieurs (epf2 2,5, epf1 epf2 ^2,5, tmm^12, une lignée 4 silencieuse STOMAGEN, et des ^lignées transgéniques portant la surexpression estradiol-inductible Est::EPF1 ou Est::EPF2 construction...

Discussion

Les deux méthodes d’analyse phénotypique pour identifier et caractériser les gènes contrôlant la structuration et la différenciation stomatiques présentées ici sont des tests pratiques et fiables puisque les protocoles ne nécessitent pas l’utilisation de peelings épidermiques et d’équipement spécialisé (qui prennent beaucoup de temps et nécessitent une formation spéciale pour la préparation des échantillons) mais produisent des images de haute qualité pour l’analyse quantitative des phénotypes ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 mm x 18 mm cover slip	VWR	16004-326
24-well sterile plates with lid	VWR	CA62406-183
3M Micropore surgical tape	Fisher Scientific	19-027-761	Microporous surgical paper tape used to seal MS plates
76 x 26 mm Microscope slide	TLG	GEW90-2575-03
Acetic acid, ≥99.8%	Fisher Scientific	A38-212
Agar	BioShop	AGR001.1
Bleech	Household bleach (e.g., Clorox)
Confocal microscope	Nikon		Nikon C2 operated by NIS-Elements
Ethanol	Greenfield	P210EAAN
FIJI	Open-srouce	(Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j	Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/
Forceps	Sigma-Aldrich	F6521
Gamborg's vitamin mixture	Cassson Labs	GBL01-100ML	Store at 4 °C
Glycerol	Fisher Scientific	G33-4
Growth chambers	Conviron, model E15		16h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1.
Lights	HD Supply	25272	Fluorescent  lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K
Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	14-222-155	Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization
Microscope	Nikon		Nikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera
Murashige and Skoog basal salts	Cassson Labs	MSP01-1LT	Store at 4 °C
Petri Dish 100 mm x 20 mm	Fisher Scientific	08-757-11Z	Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana
Propidium Iodide	VWR	39139-064
Scalpel	Fisher Scientific	08-916-5A
Sucrose	BioShop	SUC700.5
Toluidine blue O	Sigma-Aldrich	T3260-5G
Tris base	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-100ML
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758