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요약

이 논문은 기공 발달을 제어하는 유전자를 특성화하기 위해 표피 껍질을 사용하지 않는 두 가지 표현형 방법을 설명합니다. 첫 번째 방법은 톨루이딘 블루 O-염색 식물 표피를 사용하여 기공 표현형을 분석하는 방법을 보여줍니다. 두 번째 방법은 기공 리간드를 식별하고 생물학적 활성을 모니터링하는 방법을 설명합니다.

초록

기공은 가스 교환 및 수증기 방출에 관여하는 육상 식물 표면의 작은 구멍이며 그 기능은 식물의 생산성과 생존에 매우 중요합니다. 따라서 기공이 발달하고 패턴화되는 메커니즘을 이해하는 것은 엄청난 농업적 가치를 가지고 있습니다. 이 논문은 기공 발달 및 패턴화를 제어하는 유전자를 특성화하는 데 사용할 수 있는 애기장 대 자엽을 사용하는 두 가지 표현형 방법을 설명합니다. 먼저 톨루이딘 블루 O-염색 자엽을 사용하여 기공 표현형을 분석하는 절차가 제시됩니다. 이 방법은 빠르고 안정적이며 표현형 분석에 널리 사용되지만 전문 교육이 필요한 표피 필링을 사용할 필요가 없습니다. 여러 시스테인 잔기의 존재로 인해 기공 발달에 역할을 하는 생리활성 EPF 펩타이드의 식별 및 생성이 어려웠습니다. 따라서 두 번째로 제시된 절차는 기공 리간드를 식별하고 생물학적 분석에 의해 생물학적 활성을 모니터링하는 데 사용되는 절차입니다. 이 방법의 주요 장점은 펩타이드 용액의 양과 기공 패턴 및 발달을 제어하는 데 있어 펩타이드의 역할을 특성화하는 데 필요한 시간을 줄이면서 재현 가능한 데이터를 비교적 쉽게 생성한다는 것입니다. 전반적으로, 이러한 잘 설계된 프로토콜은 활성을 위해 매우 복잡한 구조가 필요한 시스테인이 풍부한 분비 펩타이드를 포함한 잠재적인 기공 조절자를 연구하는 효율성을 향상시킵니다.

서문

식물 기공의 적절한 패턴화와 분화는 광합성과 증산이라는 두 가지 기본적인 생물학적 과정에서의 기능에 매우 중요하며 EPF 펩타이드 신호 전달 경로에 의해 시행됩니다. 애기장대에서 분비된 세 가지 시스테인이 풍부한 펩타이드인 EPF1, EPF2 및 STOMAGEN/EPFL9는 기공 발달의 다양한 측면을 제어하고 ERECTA 계열 수용체 키나아제(ER, ERL1 및 ERL2), SERK 및 TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . 이러한 인식은 MAPK-의존적 과정(11)에 의한 기공 분화를 촉진하는 전사 인자의 하향 조절로 이어진다. 이러한 핵심 기공 유전자의 발견은 주로 표피 결함을 나타내는 돌연변이체의 표현형 스크리닝에 의해 달성됩니다. 이 논문은 기공 패턴 및 분화를 제어하는 잠재적 유전자를 식별하고 특성화하는 데 필요한 기공 및 기타 표피 세포를 시각화하기 위한 비교적 간단하고 효율적인 표현형 분석 방법을 제시합니다.

식물 표피의 세부 사항에 대한 관찰은 일반적으로 톨루이딘 블루 O(TBO) 또는 사프라닌12,13,14과 같은 염료로 염색하거나 염색하지 않고 표피 껍질을 사용하여 달성되었습니다. 그러나 이러한 방법의 주요 과제는 조직을 찢지 않고 잎 표피를 벗겨내고 잎의 다른 부분에서 촬영한 이미지를 피하면서 패턴 데이터를 주의 깊게 관찰하고 분석하기 위한 전문 교육이 필요하다는 것입니다. 클로랄 수화물 기반 투명화 용액과 같은 시약으로 조직 샘플을 투명화하는 화학적 처리는 또한 다양한 범위의 생물학적 물질에 널리 사용되었습니다 8,15; 이러한 처리는 고품질 이미지를 제공하여 많은 표현형 정보를 생성하지만 위험한 화학 물질(예: 포름알데히드, 염소 수화물)의 사용도 필요합니다. 이 논문은 먼저 정량 분석에 충분한 이미지를 생성하지만 샘플 준비를 위해 위험한 화학 물질과 표피 잎 껍질을 사용할 필요가 없는 비교적 쉽고 편리한 표현형 분석 방법을 제시합니다. TBO 염색 자엽 표피는 또한 trichomes의 부족과 자엽의 더 작은 발달 구배가 표피 표현형의 간단하고 다루기 쉬운 해석을 허용하기 때문에 기공 발달 연구에 이상적입니다.

기공 EPF 펩타이드는 상대적으로 큰 성숙 크기와 보존된 시스테인 잔기 사이의 분자내 이황화 결합을 갖는 식물 특이적 시스테인이 풍부한 펩타이드 그룹에 속합니다. 올바른 구조적 폴딩은 생물학적 기능에 매우 중요하지만, 화학 합성 또는 이종 재조합 시스템에 의해 생성되는 시스테인이 풍부한 펩타이드는 비활성일 수 있으며 적절하게 폴딩된 펩타이드와 풀린 펩타이드모두의 혼합물입니다 3,7,16. 따라서 기공 발달을 조절하는 역할을 하는 생리활성 펩타이드의 스크리닝은 매우 어려운 작업이었습니다. 이 원고는 생리활성 기공 펩타이드의 더 나은 식별 및 특성화를 위한 생물학적 분석을 추가로 설명합니다. 이 방법에서, 애기장대 묘목은 6-7일 동안 잠재적인 펩티드가 있거나 없는 배지를 포함하는 다중 웰 플레이트에서 성장합니다. 그런 다음 자엽 표피를 컨포칼 현미경을 사용하여 시각화합니다. 일반적으로, 기공 발달에서 잠재적인 펩타이드의 생물학적 활성을 명확하게 시각화하기 위해, 더 많은 표피 세포를 생성하는 epf2 돌연변이 및 감소된 표피 세포 밀도 2,4,5를 부여하는 STOMAGEN-ami 라인과 같이 더 많거나 적은 기공 계통 세포를 생성하는 유전자형이 생물학적 분석을 위해 야생형 애기장대 대조군(Col-0)에 추가로 사용됩니다.

전반적으로, 여기에 제시된 두 가지 프로토콜은 다양한 표피 표현형의 빠르고 효율적인 평가와 기공 패턴 및 발달을 제어하는 역할을 하는 작은 펩타이드 및 호르몬을 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1. TBO로 애기장 대 자엽 염색

  1. 종자 살균 및 성장 조건
    1. 종자 살균 용액 1mL(상업용 표백제 33%, Triton X-100% 33%)를 추가하여 미세원심분리기 튜브에서 유전자형당 ~30개의 애기장대 종자를 소독하고 실온(RT)에서 10-12분 동안 부드럽게 흔들어줍니다.
      참고: 야생형 애기장대 수탁 컬럼비아(Col-0)의 ~30개 종자 및/또는 화학적으로 유도성 유전자(예: Est::EPF27)를 운반하는 형질전환 식물의 ~60개 종자를 살균하여 1/2 Murashige 및 Skoog(MS) 플레이트(2.16g/L 함유 0.8% 한천[w/v]) 유도제(예: β-에스트라디올)를 대조군으로 사용하지 않습니다(그림 1 및 그림 2).
    2. 멸균 용액을 제거하고 층류 후드에서 1mL의 멸균수로 종자를 4회 세척한 다음 ~200μL의 멸균 0.1% 한천에 재현탁합니다.
    3. 이식유전자(예: Est::EPF27)의 화학적 유도를 위한 유도제(예: 10μM β-에스트라디올)가 포함된 1/2 MS 한천 플레이트 또는 1/2 MS 한천 플레이트에 유전자형당 ~30개의 종자를 뿌리고 피펫을 사용하여 미세 기공 테이프로 밀봉합니다.
      알림: 씨앗은 묘목이 균일하게 자라는 것을 방지하기 위해 가까운 곳에 두지 않도록 접시에 고르게 분포되어야 합니다.
    4. 발아를 동기화하기 위해 플레이트를 빛없이 4 °C에서 3-5 일 동안 두어 씨앗을 층화합니다.
    5. 성층화 후, 플레이트를 22 ° C의 성장 챔버에서 120 μmol · m-2 · s-1 빛 하에서 10 일 동안 16 시간의 빛과 8 시간의 어둠으로 배양합니다.
  2. 애기장대 자엽의 샘플링 및 TBO 염색
    1. 발아 후 10 일이 지나면 변동성을 제한하기 위해 접시에 다른 묘목과 균일하게 자라는 개별 묘목에서 자엽 중 하나를 신중하게 선택하고 잘라냅니다.
      참고: 자엽은 10일 된 묘목에서 채취하는데, 그 이유는 모세포와 미성숙 표피 세포가 없기 때문에 표피 표현형의 해석을 단순화합니다.
    2. 집게를 사용하여 고정 용액 (9 : 1 에탄올에서 아세트산) 1mL가 들어있는 미세 원심 분리 튜브에 각 자엽을 넣고 샘플을 고정 용액에 밤새, 최소 및 실온에 두십시오.
      알림: 그런 다음 샘플을 이 조건에서 최대 2년 동안 보관할 수 있습니다. 이미지 그림 2E 는 3년 이상 고정 용액에 보관된 자엽 샘플에서 가져온 것입니다. 절단 직후 자엽을 고정 용액에 보관하고 나중에 균일한 시료 준비를 위해 각 미세 원심분리기 튜브에 자엽을 5개 이하로 배치하는 것이 중요합니다.
    3. 고정 용액을 제거하고, 70% 에탄올 1 mL를 첨가한다. 튜브를 몇 번 뒤집은 후 샘플이 들어 있는 튜브를 ~ 30분 동안 RT에 둡니다.
    4. 50% 에탄올 1mL를 사용한 다음 20% 에탄올을 사용하여 1.2.3단계를 반복합니다.
    5. 20% 에탄올 1mL를 증류수 1mL로 교체한 다음 튜브를 몇 번 뒤집은 후 자엽 샘플이 들어 있는 튜브를 ~30분 동안 그대로 둡니다.
      참고: 샘플은 증류수에 24시간 이상 머무를 수 있지만 정량 분석을 위해 양질의 이미지(다양한 표피 세포 유형에 대해 잘 염색된 이미지)를 얻는 데는 권장되지 않습니다.
    6. 튜브에서 증류수를 모두 제거합니다. 그런 다음 즉시 ~200μL의 TBO 염색 용액(H2O중 0.5% TBO, 여과됨)을 ~2분 동안 추가합니다.
      알림: 각 자엽 샘플이 배양 중에 튜브를 부드럽게 튕겨 TBO 용액에 고르게 노출되었는지 확인하십시오. TBO로 과염색을 방지하려면(염색 시기는 필수적이며 각 유전자형에 따라 다를 수 있음) 한 번에 샘플이 들어 있는 튜브를 6개 이상 처리하지 마십시오.
    7. TBO 염색 용액을 가능한 한 철저하게 제거한 다음 신선한 증류수 1mL를 첨가하여 샘플을 즉시 몇 번 세척하십시오.
  3. 이미징 및 데이터 분석
    1. 현미경 슬라이드를 가지고 15% 글리세롤(~50μL)을 한 방울 떨어뜨립니다. 미세 집게를 사용하여 슬라이드의 축면이 위로 향하게 하여 자엽을 15% 글리세롤에 넣습니다. 그런 다음 형성된 기포가 샘플에서 제거될 수 있도록 커버슬립으로 부드럽게 덮습니다.
    2. 명시야 현미경(그림 1 및 그림 2)을 사용하여 자엽 표피의 축변을 이미지화한 다음 기공 및 기타 표피 세포 유형의 수를 계산하여 표피 표현형을 검사합니다.
    3. 각 유전자형에 대해 Jangra et al.17에 의해 설명된 다음 공식을 사용하여 표피 표현형을 계산합니다.
      구내지수(%) = (기공의 수/표피세포의 총수) × 100
      구내밀도(mm−2) = 기공의 수/면적(mm2)
      참고: 각 유전자형에 대해 최소 8개의 자엽(N = 8)을 이미지화하고 유도제 없이 성장한 화학적으로 유도성 이식유전자를 발현하는 야생형 식물 및/또는 형질전환 식물의 표현형과 비교하여 각 유전자형의 표피 표현형을 문서화합니다.

2. 기공 펩타이드에 대한 생물학적 분석

참고: 생물학적 분석 절차는 그림 3에 나와 있습니다.

  1. 종자 살균 및 성장 조건
    1. 위와 같이 각 처리에 대해 ~ 25 개의 종자를 살균하고 층류 후드에있는 2 개의 1/2 MS 한천 플레이트 각각에 종자의 약 절반을 뿌립니다.
      참고: 야생형 배경(예: Col-0)을 사용하는 대신 상피 세포(예: epf22)가 높은 유전자형을 사용하여 표피 세포 패터닝 및 분화에 대한 펩타이드의 생물학적 활성을 쉽게 검출할 수 있습니다(그림 4).
    2. 종자를 어둠 속에서 4°C에서 3일 동안 성층화한다.
    3. ~10시간 간격으로 두 개의 플레이트를 각각 꺼내고 120μmol·m-2·s-1 빛 아래에서 16시간의 빛과 8시간의 어둠으로 1 일 동안 22°C의 플레이트에 씨앗을 배양합니다.
  2. 펩타이드 처리 및 이미징
    1. 층류 후드에서 준비된 두 개의 플레이트 각각에서 10-12 일 된 애기장대 묘목을 각 웰 (웰 당 ~ 20 개의 묘목)에 1.5mL의 1/2 MS 액체 배지가 들어있는 24 웰 플레이트에 조심스럽게 이식합니다.
      참고: 묘목에 대한 펩타이드 처리의 시기는 펩타이드 처리의 표현형 결과에 매우 중요하므로 두 개의 별도 플레이트에 씨앗을 준비하여 처리를 위한 두 가지 다른 묘목 발달 단계를 얻습니다.
    2. 완충액 단독(50mM Tris-HCl[pH 8.0]) 또는 두 가지 다른 농도의 펩타이드(일반적으로 50mM Tris-HCl[pH 8.0]에서 1μM 및 2.5μM 펩타이드)를 ~20개의 1/2MS 한천 플레이트에서 발아된 ~20개의 1일 된 애기장대 묘목을 포함하는 각 웰에 추가합니다.
      참고: 냉동실에서 펩타이드 용액 분취량을 제거하고 치료 전에 몇 분 동안 RT에 보관하십시오. -80°C의 냉동고에 보관된 펩타이드는 몇 년 동안 안정적이지만 펩타이드 용액을 작은 분취량으로 보관하여 동결-해동 주기를 피해야 합니다.
    3. 묘목을 완충액 단독 또는 피펫을 사용하여 펩타이드 용액과 부드럽게 혼합한 후 미세 기공 테이프로 플레이트를 밀봉합니다. 22°C에서 5-7일 동안 장일 조건(16시간 광주기, 120μmol·m-2·s-1 광)에서 분석 플레이트를 배양합니다.
      알림: 묘목이 너무 가깝게 자라서 각 묘목이 펩타이드 용액에 고르게 노출되는 것을 방지하십시오. 통기를 증가시키기 위해 성장 챔버에서 플레이트를 배양하기 전에 플레이트를 2-3시간 동안 부드럽게 회전시킵니다.
    4. 완충액 단독 또는 펩타이드가 들어 있는 우물에서 각 묘목을 덮개 슬라이드에 옮기고 묘목의 자엽을 해부합니다. 집게를 사용하여 자엽의 아축 쪽을 위로 올리고 작은 조각으로 자릅니다.
    5. 또 다른 깨끗한 현미경 슬라이드를 가져다가 요오드화 프로피듐 용액(~25μL, H 2O에서2mg/mL)을 한 방울 떨어뜨립니다.
    6. 집게를 사용하여 자엽의 작은 조각 중 하나를 프로피듐 요오드화물 용액 한 방울에 넣고 커버슬립을 부드럽게 놓습니다. 커버슬립 가장자리에 요오드화 프로피듐 용액을 추가로 도포하여 형성된 기포를 제거합니다.
    7. 컨포칼 현미경을 사용하여 자엽의 축방향 면을 이미지화하고 버퍼만 포함된 1/2 MS 배지에서 자란 묘목의 이미지와 이미지를 비교합니다.
      참고: 그림 4에 제시된 이미지는 완충액만(그림 0A, B) 또는 EPF2 펩타이드 용액의 두 배치(그림 4C-F)로 처리된 야생형 Col-2 또는 epf2 2,5 묘목에서 촬영되었으며 1년 동안 -80°C에서 보관되었습니다.

결과

더 낮거나 더 많은 기공 밀도 및 클러스터링을 갖는 것으로 알려진 다양한 기공 형질전환 식물 및 돌연변이체(epf2 2,5, epf1 epf2 2,5, tmm12, STOMAGEN-침묵 라인4 및 에스트라디올 유도성 Est::EPF1 또는 Est::EPF2 과발현 구조체 7을 운반하는 ...

토론

여기에 제시된 기공 패턴 및 분화를 제어하는 유전자를 식별하고 특성화하기 위한 두 가지 표현형 분석 방법은 프로토콜이 표피 박리 및 특수 장비(시간이 많이 걸리고 샘플 준비를 위한 특별 교육이 필요함)를 사용할 필요가 없지만 표피 표현형의 정량적 분석을 위한 고품질 이미지를 생성하기 때문에 편리하고 신뢰할 수 있는 분석입니다.

TBO 염색 애기장대 자엽을 사...

공개

이해 상충은 선언되지 않았습니다.

감사의 말

이 연구는 캐나다 천연 자원 및 공학 연구위원회 (NSERC) 디스커버리 프로그램과 Concordia University를 통해 자금을 지원받았습니다. K.B.는 인도의 National Overseas Scholarship의 지원을 받습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
18 mm x 18 mm cover slipVWR16004-326
24-well sterile plates with lidVWRCA62406-183
3M Micropore surgical tapeFisher Scientific19-027-761Microporous surgical paper tape used to seal MS plates
76 x 26 mm Microscope slideTLGGEW90-2575-03
Acetic acid, ≥99.8% Fisher ScientificA38-212
AgarBioShopAGR001.1
BleechHousehold bleach (e.g., Clorox)
Confocal microscope Nikon Nikon C2 operated by NIS-Elements 
EthanolGreenfieldP210EAAN
FIJIOpen-srouce(Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3jDownloaded from https://imagej.net/software/fiji/
ForcepsSigma-AldrichF6521 
Gamborg's vitamin mixtureCassson LabsGBL01-100MLStore at 4 °C
GlycerolFisher ScientificG33-4
Growth chambersConviron, model E1516h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1.
LightsHD Supply25272Fluorescent  lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K 
Microcentrifuge tubeFisher Scientific14-222-155Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization
Microscope NikonNikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera
Murashige and Skoog basal salts Cassson LabsMSP01-1LTStore at 4 °C
Petri Dish 100 mm x 20 mm Fisher Scientific08-757-11ZPetri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana
Propidium Iodide VWR39139-064
ScalpelFisher Scientific08-916-5A
SucroseBioShopSUC700.5
Toluidine blue OSigma-AldrichT3260-5G
Tris baseSigma-AldrichT1503
Triton X-100Sigma-AldrichT8787-100ML
β-EstradiolSigma-AldrichE2758

참고문헌

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