表皮表現型スコアリング による 気孔発生に関与する遺伝子の同定

要約

この論文では、気孔の発達を制御する遺伝子を特徴付けるために、表皮剥離を使用しない2つの表現型法について説明します。最初の方法は、トルイジンブルーO染色植物表皮を使用して気孔表現型を分析する方法を示しています。2番目の方法は、気孔リガンドを同定し、それらの生物学的活性を監視する方法を説明する。

要約

気孔は、陸上植物の表面にあるガス交換と水蒸気放出に関与する小さな細孔であり、その機能は植物の生産性と生存に不可欠です。このように、気孔が発達し、パターン化するメカニズムを理解することは、途方もない農学的価値があります。この論文では、気孔の発達とパターン形成を制御する遺伝子を特徴付けるために使用できる シロイヌナズナ子 葉を使用した2つの表現型法について説明します。最初に提示されるのは、トルイジンブルーO染色子葉を使用して気孔表現型を分析するための手順です。この方法は高速で信頼性が高く、表現型分析に広く使用されているが専門的なトレーニングを必要とする表皮剥離を使用する必要はありません。複数のシステイン残基が存在するため、気孔の発生に関与する生理活性EPFペプチドの同定と生成は困難でした。したがって、第2に提示されるのは、気孔リガンドを同定し、バイオアッセイによってそれらの生物学的活性をモニターするために使用される手順である。この方法の主な利点は、ペプチド溶液の量と気孔のパターン形成と発生の制御におけるペプチドの役割を特徴付けるのに必要な時間を削減しながら、比較的簡単に再現可能なデータを生成することです。全体として、これらの適切に設計されたプロトコルは、活性に非常に複雑な構造を必要とするシステインリッチ分泌ペプチドを含む潜在的な気孔調節因子の研究の効率を高めます。

概要

植物気孔の適切なパターン形成と分化は、光合成と蒸散という2つの基本的な生物学的プロセスにおけるそれらの機能にとって重要であり、EPFペプチドシグナル伝達経路によって実施されます。シロイヌナズナでは、3つの分泌されたシステインリッチペプチド、EPF1、EPF2、およびSTOMAGEN/EPFL9が気孔発生のさまざまな側面を制御し、ERECTAファミリー受容体キナーゼ(ER、ERL1、およびERL2)、SERK、および^TMM1、²、³、⁴、⁵、⁶、⁷、⁸、^9、10を含む細胞表面受容体成分によって知覚されます。.次いで、この認識は、MAPK依存性プロセス¹¹による気孔分化を促進する転写因子のダウンレギュレーションをもたらす。これらのコア気孔遺伝子の発見は、主に表皮欠損を示す変異体の表現型スクリーニングによって達成される。この論文は、気孔のパターン形成と分化を制御する潜在的な遺伝子を特定および特徴付けるために必要な気孔および他の表皮細胞を視覚化するための比較的簡単で効率的な表現型決定法を提示します。

植物表皮の詳細の観察は、典型的には、トルイジンブルーO(TBO)またはサフラニン^12、13、14などの染料で染色するまたは伴わない表皮皮を使用することによって達成された。しかし、これらの方法の主な課題は、組織を引き裂かずに葉の表皮を剥がし、葉のさまざまな部分から撮影された画像を避けながらパターンデータを注意深く観察および分析するための専門的なトレーニングが必要であることです。抱水クロラールベースの透明化溶液などの試薬で組織サンプルを透明化する化学処理も、さまざまな範囲の生物学的材料に広く使用されています^8,15;これらの処理は、高品質の画像を提供することにより、多くの表現型情報を生成しますが、危険な化学物質(ホルムアルデヒド、抱水クロラールなど)の使用も必要です。本稿ではまず、定量分析に十分な画像を生成するが、サンプル調製に危険な化学物質や表皮の葉の皮を使用する必要がない、比較的簡単で便利な表現型法を紹介します。TBO染色された子葉の表皮は、毛状突起の欠如と子葉の発達勾配が小さいため、表皮表現型の単純で扱いやすい解釈を可能にするため、気孔の発達の研究にも理想的です。

気孔EPFペプチドは、比較的大きな成熟サイズおよび保存されたシステイン残基間の分子内ジスルフィド結合を有する植物特異的なシステインリッチペプチドのグループに属する。正しい立体配座折り畳みはそれらの生物学的機能にとって重要であるが、化学合成または異種組換えシステムのいずれかによって産生されるシステインリッチペプチドは不活性であり得、適切に折り畳まれたペプチドと折り畳まれていないペプチドの両方の混合物である³、^7、16。このように、気孔の発達を制御する役割を持つ生理活性ペプチドのスクリーニングは非常に困難な課題でした。この原稿はさらに、生理活性気孔ペプチドのより良い同定と特性評価のためのバイオアッセイについて説明しています。この方法では、シロイヌナズナの苗木を、潜在的なペプチドの有無にかかわらず培地を含むマルチウェルプレートで6〜7日間増殖させる。次に、共焦点顕微鏡を用いて子葉の表皮を可視化する。一般に、気孔発生における潜在的なペプチドの生物学的活性を明確に視覚化するために、バイオアッセイには野生型シロイヌナズナ対照(Col-0)に加えて、より多くの表皮細胞を産生するepf2変異体や表皮^{細胞密度の低下2,4,5}を付与するSTOMAGEN-ami系統など、気孔系統細胞を多量またはまたは少なく産生する遺伝子型が使用されます。

全体として、ここに提示された2つのプロトコルは、さまざまな表皮表現型の迅速かつ効率的な評価、および気孔のパターン形成と発生を制御する役割を持つ小さなペプチドとホルモンのスクリーニングに使用できます。

プロトコル

1. シロイヌ ナズナの子葉をTBOで染色する

1. 種子の殺菌と成長条件
   1. 1mLの種子滅菌溶液(市販の漂白剤33%、Triton X-1000)を加えて、遺伝子型ごとに~30個の シロイヌナズナ 種子をマイクロ遠心チューブで滅菌し、室温(RT)で10〜12分間穏やかに揺り動かします。
      注:阻害剤(例:β-エストラジオール)をコントロールとして使用せずに、1/2ムラシゲおよびスクーグ(MS)プレート(0.8%寒天[w/v]を含む2.16 g / L)で成長させたトランスジェニック苗を使用して、野生型 シロイヌナズ ナアクセッションコロンビア(Col-0)の~30種子および/または化学的に誘導可能な遺伝子( Est::EPF2⁷など)を持つトランスジェニック植物の~60種子を滅菌します(図1 および 図2)。
   2. 滅菌液を取り出し、層流フード内の滅菌水1 mLで種子を4回洗浄し、~200 μLの滅菌0.1%寒天培地に再懸濁します。
   3. 導入遺伝子の化学的誘導のための誘導物質(例: Est::EPF2⁷)を含む1/2 MS寒天プレートまたは1/2 MS寒天プレート(例:10 μM β-エストラジオール)に、ピペットを使用して遺伝子型ごとに~30個の種子を播種し、マイクロポアテープで密封します。
      注:種子は、苗が均一に成長するのを妨げるため、種子を近くに配置しないように、プレート上に均等に分散させる必要があります。
   4. プレートを光なしで4°Cに3〜5日間置き、発芽を同期させて種子を層別化します。
   5. 成層後、プレートを成長チャンバー内で22°C、120 μmol・m⁻²・s⁻¹ 光、日長16時間、暗期8時間で10日間インキュベートします。
2. シロイヌナズナのサンプリングとTBO染色
   1. 発芽後10日目に、プレート上の他の苗と均一に成長している個々の苗から子葉の1つを慎重に選択して切り取り、変動性を制限します。
      注:子葉は、毛状突起や未熟な表皮細胞がないため、10日齢の苗からサンプリングされ、表皮表現型の解釈が簡単になります。
   2. 鉗子を使用して1 mLの固定溶液(9:1エタノールから酢酸)を含む微量遠心チューブに各子葉を入れ、サンプルを固定溶液に一晩、少なくとも室温で放置します。
      注:サンプルは、この状態で最大数年間保存できます。図 2E の画像は、固定液に3年以上保存した子葉サンプルから撮影したものです。切断直後は子葉を固定液に保持し、後で均質なサンプル調製のために各微量遠心チューブに子葉を5つ以下入れることが重要です。
   3. 固定液を取り出し、70%エタノール1mLを加える。チューブを数回反転させた後、サンプルを入れたチューブをRTで~30分間放置します。
   4. 1 mLの50%エタノールを使用してステップ1.2.3を繰り返し、次に20%エタノールを使用します。
   5. 1 mLの20%エタノールを1 mLの蒸留水と交換し、子葉サンプルを含むチューブを数回反転させた後、~30分間放置します。
      注:サンプルは蒸留水に24時間以上留まる場合がありますが、定量分析のために高品質の画像(さまざまな表皮細胞タイプのよく染色された画像)を取得するためにこれは推奨されません。
   6. チューブからすべての蒸留水を取り除きます。その後、直ちに~200 μLのTBO染色液(H2 O中の0.5%TBO、ろ過)を~₂分間加えます。
      注意: インキュベーション中にチューブをそっとフリックして、各子葉サンプルがTBO溶液に均一にさらされていることを確認してください。TBOによる過剰染色を防ぐために(染色のタイミングは不可欠であり、遺伝子型ごとに可変にすることができます)、一度にサンプルを含む6本を超えるチューブを処理しないでください。
   7. TBO染色液をできるだけ完全に除去し、すぐに1 mLの新鮮な蒸留水を加えてサンプルを数回洗浄します。
3. イメージングとデータ解析
   1. 顕微鏡スライドを取り、15%グリセロール(~50 μL)を滴下します。細い鉗子を使用して、軸側を上にして子葉をスライド上の15%グリセロールに置きます。次に、カバーガラスでそっと覆い、形成された気泡をサンプルから除去できるようにします。
   2. 明視野顕微鏡で子葉の表皮の腹軸側を画像化し(図1 、 図2)、気孔などの表皮細胞数を数えて表皮表現型を調べます。
   3. 各遺伝子型について、Jangraら¹⁷によって記述された以下の式を用いて表皮表現型を計算する:
      気孔指数(%)=(気孔数/表皮細胞総数)×100
      気孔密度(mm⁻2)=気孔数/面積(^mm2)
      注:各遺伝子型について少なくとも8つの子葉(N = 8)を画像化し、それを野生型植物および/または誘導剤なしで成長した化学的に誘導可能な導入遺伝子を発現するトランスジェニック植物の表現型と比較することにより、各遺伝子型の表皮表現型を文書化します。

2. 気孔ペプチドのバイオアッセイ

注:バイオアッセイの手順は 図3に示されています。

1. 種子の殺菌と成長条件
   1. 上記のように処理ごとに~25個の種子を滅菌し、種子の約半分を層流フード内の2枚の1/2MS寒天プレートのそれぞれに播種します。
      注:表皮細胞のパターン形成と分化におけるペプチドの生物学的活性を簡単に検出するには、野生型のバックグラウンド(Col-0など)を使用する代わりに、表皮細胞が高いおよび/または低い遺伝子型( epf2²など)を使用します(図4)。
   2. 種子を暗所で4°Cで3日間層別化する。
   3. 2枚のプレートをそれぞれ~10時間間隔で取り出し、120 μmol・m⁻²・s⁻¹ 光下で22°C、光16時間、暗8時間の日長で1日間、プレート上の種子をインキュベートします。
2. ペプチド処理とイメージング
   1. 層流フード内で、準備した2枚のプレートのそれぞれから1日齢の シロイヌナ ズナの苗木10〜12本を、各ウェルに1.5 mLの1/2 MS液体培地(1ウェルあたり~20本の苗)を含む24ウェルプレートに慎重に移植します。
      注:苗のペプチド処理のタイミングは、ペプチド処理の表現型の結果にとって重要であるため、2つの異なる苗の発達段階を得るために、2つの別々のプレートで種子を準備します。
   2. バッファー単独(50 mM Tris-HCl [pH 8.0])または2つの異なる濃度のペプチド(通常、50 mM Tris-HCl [pH 8.0]中の1 μMおよび2.5 μMペプチド)を、1/2 MS寒天プレート上で発芽させた~20本の1日齢 シロイヌ ナズナ苗を含む各ウェルに追加します。
      注:ペプチド溶液アリコートを冷凍庫から取り出し、処理前に数分間RTに保ちます。-80°Cの冷凍庫に保存されたペプチドは数年間安定ですが、ペプチド溶液を小さなアリコートで保存することで凍結融解サイクルを回避する必要があります。
   3. ピペットを用いて緩衝液単独またはペプチド溶液と苗を穏やかに混合した後、プレートをマイクロポアテープで密封する。アッセイプレートを長日条件(16時間日長、120 μmol・m−²・s⁻¹ 光)で22°Cで5〜7日間インキュベートします。
      注:苗が互いに接近して成長しすぎて、各苗がペプチド溶液に均一にさらされないようにします。プレートを2〜3時間ゆっくりと回転させてから、プレートを成長チャンバーでインキュベートして通気を増やします。
   4. バッファー単独またはカバースライド上のペプチドのいずれかを含むウェルから各苗を移し、苗の子葉を解剖する。子葉の腹軸側を鉗子で上に置き、細かく切ります。
   5. 別のきれいな顕微鏡スライドを取り、その上にヨウ化プロピジウム溶液(~25 μL、2 mg/mL H₂O溶液)を滴下します。
   6. 子葉の小片の1つを鉗子を使用してヨウ化プロピジウム溶液の滴に入れ、カバーガラスをそっと置きます。カバーガラスの端に追加のヨウ化プロピジウム溶液を塗布して、形成された気泡を取り除きます。
   7. 共焦点顕微鏡を用いて子葉の不軸側を撮像し、緩衝液のみを含む1/2MS培地で生育させた苗の画像と比較した。
      注:図4に示す画像は、バッファーのみで処理された野生型のCol-0またはepf2 ^2,5苗(図4A、B)またはEPF2ペプチド溶液の²つのバッチ(図4C-F)から取得され、-80°Cで1年間保存されました。

結果

気孔密度およびクラスタリングが少ないか多いことが知られている様々な気孔トランスジェニック植物および変異体(epf2 2,5、epf1 epf2 ^2,5、tmm¹²、STOMAGENサイレンスライン4、およびエストラジオール誘導性Est::EPF1またはEst::EPF2過剰発現

ディスカッション

ここで紹介する気孔のパターニングと分化を制御する遺伝子を同定および特性評価するための2つの表現型分析方法は、プロトコルが表皮剥離や特殊な機器(時間がかかり、サンプル調製のための特別なトレーニングが必要)の使用を必要としないため、便利で信頼性の高いアッセイですが、表皮表現型の定量分析のための高品質の画像を生成します。

TBO染色された シロ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 mm x 18 mm cover slip	VWR	16004-326
24-well sterile plates with lid	VWR	CA62406-183
3M Micropore surgical tape	Fisher Scientific	19-027-761	Microporous surgical paper tape used to seal MS plates
76 x 26 mm Microscope slide	TLG	GEW90-2575-03
Acetic acid, ≥99.8%	Fisher Scientific	A38-212
Agar	BioShop	AGR001.1
Bleech	Household bleach (e.g., Clorox)
Confocal microscope	Nikon		Nikon C2 operated by NIS-Elements
Ethanol	Greenfield	P210EAAN
FIJI	Open-srouce	(Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j	Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/
Forceps	Sigma-Aldrich	F6521
Gamborg's vitamin mixture	Cassson Labs	GBL01-100ML	Store at 4 °C
Glycerol	Fisher Scientific	G33-4
Growth chambers	Conviron, model E15		16h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1.
Lights	HD Supply	25272	Fluorescent  lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K
Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	14-222-155	Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization
Microscope	Nikon		Nikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera
Murashige and Skoog basal salts	Cassson Labs	MSP01-1LT	Store at 4 °C
Petri Dish 100 mm x 20 mm	Fisher Scientific	08-757-11Z	Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana
Propidium Iodide	VWR	39139-064
Scalpel	Fisher Scientific	08-916-5A
Sucrose	BioShop	SUC700.5
Toluidine blue O	Sigma-Aldrich	T3260-5G
Tris base	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-100ML
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758