昆虫病原真菌对孤雌生殖昆虫、芥菜蚜虫、 Lipaphis erysimi （Kalt.） 的蚜虫作用评估

摘要

该协议提出了一种优化的分离叶生物测定系统，用于评估昆虫病原真菌（EPF）对孤雌生殖昆虫芥菜蚜虫（Lipaphis erysimi （Kalt.））的有效性。该方法概述了培养皿实验期间的数据收集过程，使研究人员能够始终如一地测量EPF对芥菜蚜虫和其他孤雌生殖昆虫的毒力。

摘要

芥菜蚜虫（L. erysimi）是一种害虫，会侵扰各种十字花科作物并传播植物病毒。为了实现环保的害虫管理，昆虫病原真菌（EPF）是控制这种害虫的潜在微生物控制剂。因此，在现场应用之前，有必要在培养皿条件下对EPF分离株进行毒力筛选。然而，芥菜蚜虫是一种孤雌生殖昆虫，因此在培养皿实验中很难记录数据。为了解决这个问题，开发了一种改进的分离叶生物测定系统，使用微型喷雾器将分生孢子接种到蚜虫上，并通过促进孢子悬浮后的空气干燥来防止溺水。在整个观察期间，该系统保持较高的相对湿度，叶盘保持新鲜十天以上，使蚜虫得以孤雌生殖繁殖。为了防止后代堆积，实施了每天使用画笔去除的过程。该方案展示了一种稳定的系统，用于评估EPF分离株对芥菜蚜虫或其他蚜虫的毒力，从而能够选择潜在的分离物进行蚜虫控制。

引言

芥菜蚜虫（L. erysimi）是一种臭名昭著的害虫，它侵扰各种十字花科作物，造成重大经济损失¹。虽然已经推荐了几种系统性杀虫剂来对抗蚜虫侵扰，但这些杀虫剂的频繁使用引起了人们对杀虫剂耐药性的担忧^2,3。因此，在环境友好型害虫管理方面，昆虫病原真菌（EPF）可以作为一种合适的替代防治策略。EPF 是一种昆虫病原体，能够通过穿透宿主的角质层来感染宿主，使其成为控制蚜虫和其他吸食植物的昆虫的有效药物⁴.此外，EPF 已被证明是一种可行且可持续的害虫管理技术，具有植物病原体拮抗和促进植物生长等益处⁵.

EPF可以通过昆虫土壤诱饵获得，也可以从野外的昆虫尸体中分离出来^6,7。然而，在进一步使用真菌分离株之前，有必要进行致病性筛查。已经对 EPF 对蚜虫的有效性进行了几项研究，蚜虫是可造成严重损害的重要作物害虫 ^8,9。芥菜蚜虫，在各种蚜虫中，已经测试了对几种菌株的易感性，包括<....

研究方案

注意： 完整的流程图如图 1 所示。

1.芥菜蚜虫的收集与维护

1. 芥菜蚜虫的收集
   1. 翻转叶子，目视检查田间十字花科作物上是否有芥菜蚜虫侵扰。
   2. 记录采样地点信息（即GPS）和寄主植物，并与农民确认使用杀虫剂的历史。
   3. 使用昆虫吸痰器或精细画笔（见 材料表）从田间十字花科作物中收集约50个芥菜蚜虫到50mL离心管中，并在3小时内将样品带到实验室。
   4. 准备一个临时维护培养皿，底部有切除的十字花科叶子和渗水的滤纸。
   5. 将五只蚜虫置于室温（25±2°C）下，相对湿度为70%，12：12小时（光：暗）光周期为14天，以确认蚜虫没有天敌，然后再进一步饲养。
      注意：为确保田间收集的蚜虫没有寄生蜂或昆虫病原真菌等天敌，在进行进一步饲养之前确认不存在这些生物至关重要。
2. 芥菜蚜虫的维护
   注意：要保持芥菜蚜虫，请使用不含农药（包括生物农药）的十字花科叶子。
   1. 提供稳定和充足的十字花科叶子供应（约 25 cm²）。
      注意：从市场上获得十字花科的叶子或种植植物。在长期大规模饲养芥菜蚜虫之前，可以测试几种不同种类的十字花科植物，以找到合适的十字花科植物。一旦....

讨论

十字花科植物是一组蔬菜，经常被多种蚜虫侵染，包括芥菜蚜（L. erysimi）和卷心菜蚜虫（Brevicoryne brassicae）²⁶。这两个物种在台湾^{已有报道 27}，它们有可能在采集地点共存。为了区分密切相关的蚜虫种类，本研究采用多重引物组²¹的分子鉴定技术。通过从芥菜蚜虫COI基因片段中设计分子标记，我们成功地鉴定了芥菜蚜虫，从而证?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 μL Inoculating Loop	NEST Scientific	718201
100 bp DNA Ladder III	Geneaid	DL007
2x SuperRed PCR Master Mix	Biotools	TE-SR01
50 mL centrifuge tube	Bioman Scientific	ET5050-12
6 cm Petri dish	Alpha Plus Scientific	16021
6 mm insect aspirator	MegaView Science	BA6001
70 mm filter paper NO.1	Toyo Roshi Kaisha
70% ethanol
9 cm Petri dish	Alpha Plus Scientific	16001
Agar	Bioman Scientific	AGR001.1	Microbiology grade
Agarose	Bioman Scientific	PB1200
BioGreen Safe DNA Gel Buffer	Bioman Scientific	SDB001T
Chromas	Technelysium
GeneDoc
GenepHlow Gel/PCR Kit	Geneaid	DFH300	https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf
Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit	Protech Technology	PT-GD112-V3	http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf
Hemocytometer	Paul Marienfeld	640030
Komatsuna leaves (Brassica rapa var. perviridis)	Tai Cheng Farm	1-010-300410
Microsprayer
MiniAmp Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	A37834
Mustard aphid (Lipaphis erysimi)
Painting brush	Tian Cheng brush company	4716608400352
Parafilm M	Bemis	PM-996
Pellet pestle	Bioman Scientific	GT100R
Sabouraud Dextrose Broth	HiMedia	MH033-500G
SPSS Statistics	IBM
TAE buffer 50x	Bioman Scientific	TAE501000
Tween 80	PanReac AppliChem	142050.1661