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Resumo

Este protocolo apresenta um sistema otimizado de bioensaio foliar destacado para avaliar a eficácia de fungos entomopatogênicos (FPE) contra o pulgão mostarda (Lipaphis erysimi (Kalt.)), um inseto partenogenético. O método descreve o processo de coleta de dados durante os experimentos com placas de Petri, permitindo que os pesquisadores meçam consistentemente a virulência do PFE contra pulgões da mostarda e outros insetos partenogenéticos.

Resumo

O pulgão da mostarda (L. erysimi) é uma praga que infesta várias culturas crucíferas e transmite vírus de plantas. Para alcançar o manejo ecológico de pragas, fungos entomopatogênicos (FPE) são potenciais agentes de controle microbiano para o controle dessa praga. Portanto, a triagem de virulência de isolados de PFE em condições de placa de Petri é necessária antes da aplicação em campo. No entanto, o pulgão da mostarda é um inseto partenogenético, dificultando o registro de dados durante experimentos com placas de Petri. Um sistema modificado para bioensaios de folhas destacadas foi desenvolvido para resolver essa questão, usando um micropulverizador para inocular conídios em pulgões e prevenir o afogamento, facilitando a secagem ao ar após a suspensão dos esporos. O sistema manteve alta umidade relativa durante todo o período de observação, e o disco foliar permaneceu fresco por mais de dez dias, permitindo a reprodução partenogenética dos pulgões. Para evitar o acúmulo de filhotes, foi implementado um processo de remoção diária com pincel de pintura. Este protocolo demonstra um sistema estável para avaliar a virulência de isolados de PFE contra pulgões mostarda ou outros afídeos, possibilitando a seleção de potenciais isolados para o controle de afídeos.

Introdução

O pulgão-mostarda (L. erysimi) é uma notória praga que infesta uma variedade de culturas crucíferas, causando perdas econômicas significativas1. Embora vários inseticidas sistemáticos tenham sido recomendados para combater infestações por afídeos, o uso frequente desses inseticidas levanta preocupações sobre a resistência a pesticidas 2,3. Portanto, em termos de manejo ecológico de pragas, os fungos entomopatogênicos (PFE) podem servir como uma estratégia alternativa de controle adequada. O PFE é um inseto patógeno com capacidade de infectar hospedeiros penetrando em suas cutíc....

Protocolo

NOTA: O fluxograma completo é mostrado na Figura 1.

1. Coleta e manutenção de pulgões de mostarda

  1. Coleção de pulgões de mostarda
    1. Vire as folhas e verifique visualmente se há infestação de pulgões de mostarda em culturas crucíferas no campo.
    2. Registre as informações do local de amostragem (ou seja, GPS) e a(s) planta(s) hospedeira(s) e confirme o histórico de aplicações de inseticidas com os agricultores.
    3. Use um aspirador de insetos ou um pincel de pintura fina (ver Tabela de Materiais) para coletar cerca de 50 pulgões de mostarda e....

Resultados Representativos

O fluxograma apresentado ilustra a condição estável dos pulgões da mostarda desde a coleta de campo até a triagem de virulência. A manutenção dos pulgões a partir da coleta no campo garantiu um aumento estável de colônias de afídeos com um suprimento alimentar adequado. Os pulgões coletados em campo foram confirmados como pulgões mostarda através do uso de marcadores moleculares, incluindo tamanho do amplicon por PCR e sequenciamento de LeCO1. A triagem de virulência, realizada pelo método das folhas des.......

Discussão

As crucíferas, um grupo de vegetais, são frequentemente infestadas por várias espécies de afídeos, incluindo o pulgão da mostarda (L. erysimi) e o pulgão do repolho (Brevicoryne brassicae)26. Ambas as espécies foram relatadas em Taiwan27, e é possível que coexistam no local de coleta. Para distinguir espécies de afídeos estreitamente relacionadas, este estudo empregou uma técnica de identificação molecular usando um conjunto de primers multi.......

Divulgações

Os autores declaram não haver conflito de interesses envolvidos neste trabalho.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi financiada pelo 109-2313-B-005 -048 -MY3 do Ministério da Ciência e Tecnologia (MOST).

....

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
10 μL Inoculating LoopNEST Scientific718201
100 bp DNA Ladder IIIGeneaidDL007
2x SuperRed PCR Master MixBiotoolsTE-SR01
50 mL centrifuge tubeBioman ScientificET5050-12
6 cm Petri dishAlpha Plus Scientific16021
6 mm insect aspiratorMegaView ScienceBA6001
70 mm filter paper NO.1Toyo Roshi Kaisha
70% ethanol
9 cm Petri dishAlpha Plus Scientific16001
AgarBioman ScientificAGR001.1Microbiology grade
AgaroseBioman ScientificPB1200
BioGreen Safe DNA Gel BufferBioman ScientificSDB001T
ChromasTechnelysium
GeneDoc
GenepHlow Gel/PCR KitGeneaidDFH300https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf
Gene-Spin Genomic DNA Isolation KitProtech TechnologyPT-GD112-V3http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf
HemocytometerPaul Marienfeld640030
Komatsuna leaves (Brassica rapa var. perviridis)Tai Cheng Farm1-010-300410
Microsprayer
MiniAmp Thermal CyclerThermo Fisher ScientificA37834
Mustard aphid (Lipaphis erysimi)
Painting brushTian Cheng brush company4716608400352
Parafilm MBemisPM-996
Pellet pestleBioman ScientificGT100R
Sabouraud Dextrose BrothHiMediaMH033-500G
SPSS StatisticsIBM
TAE buffer 50xBioman ScientificTAE501000
Tween 80PanReac AppliChem142050.1661

Referências

  1. Ghosh, S., Roy, A., Chatterjee, A., Sikdar, S. R. Effect of regional wind circulation and meteorological factors on long-range migration of mustard aphids over indo-gangetic plain. Scientific Reports. 9, 5626 (2019).
  2. Dhillon, M. K., Singh, N., Yadava, D. K.

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