JoVE Logo
Autores
Contáctenos

Iniciar sesión

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este protocolo presenta un sistema optimizado de bioensayo de hojas sueltas para evaluar la efectividad de hongos entomopatógenos (EPF) contra el pulgón de la mostaza (Lipaphis erysimi (Kalt.)), un insecto partenogenético. El método describe el proceso de recopilación de datos durante los experimentos con placas de Petri, lo que permite a los investigadores medir de manera consistente la virulencia de EPF contra pulgones de la mostaza y otros insectos partenogenéticos.

Resumen

El pulgón de la mostaza (L. erysimi) es una plaga que infesta varios cultivos crucíferos y transmite virus de plantas. Para lograr un manejo ecológico de plagas, los hongos entomopatógenos (EPF) son agentes potenciales de control microbiano para controlar esta plaga. Por lo tanto, es necesario realizar un cribado de virulencia de los aislados de EPF en condiciones de placa de Petri antes de la aplicación en campo. Sin embargo, el pulgón de la mostaza es un insecto partenogenético, lo que dificulta el registro de datos durante los experimentos con placas de Petri. Para abordar este problema, se desarrolló un sistema modificado para bioensayos de hojas separadas, utilizando un micropulverizador para inocular conidios en pulgones y evitar ahogamientos al facilitar el secado al aire después de la suspensión de esporas. El sistema mantuvo una alta humedad relativa durante todo el período de observación, y el disco foliar permaneció fresco durante más de diez días, lo que permitió la reproducción partenogenética de los pulgones. Para evitar la acumulación de crías, se implementó un proceso de eliminación diaria con un pincel para pintar. Este protocolo demuestra un sistema estable para evaluar la virulencia de los aislados de EPF contra pulgones de la mostaza u otros pulgones, lo que permite la selección de aislados potenciales para el control de pulgones.

Introducción

El pulgón de la mostaza (L. erysimi) es una plaga notoria que infesta una variedad de cultivos crucíferos, causando importantes pérdidas económicas1. Si bien se han recomendado varios insecticidas sistemáticos para combatir las infestaciones de pulgones, el uso frecuente de estos insecticidas plantea preocupaciones sobre la resistencia a los plaguicidas 2,3. Por lo tanto, en términos de manejo ecológico de plagas, los hongos entomopatógenos (EPF) podrían servir como una estrategia de control alternativa adecuada. El EPF es un patógeno de insectos con la capacidad de infectar a los huéspedes al penetrar en sus cutículas, lo que lo convierte en un potente agente para controlar pulgones y otros insectos chupadores de plantas4. Además, la EPF ha demostrado ser una técnica de manejo de plagas factible y sostenible, que ofrece beneficios como el antagonismo entre patógenos de plantas y la promoción del crecimiento de las plantas5.

El EPF puede obtenerse mediante cebos de suelo de insectos o aislado de cadáveres de insectos en el campo 6,7. Sin embargo, antes de seguir utilizando aislados de hongos, es necesario realizar un cribado de la patogenicidad. Se han realizado varios estudios sobre la eficacia de la EPF contra los pulgones, que son plagas importantes de los cultivos que pueden causar daños graves 8,9. Los pulgones de la mostaza, entre varias especies de pulgones, han sido probados para determinar su susceptibilidad a varias cepas de Beauveria spp., Metarhizium spp., Lecanicillium spp., Paecilomyces spp., e incluso Alternaria, que se conoce principalmente como un hongo saprófito y fitopatógeno, pero ha mostrado algunos efectos letales contra los pulgones de la mostaza10,11,12.

Para evaluar la eficacia de la EPF contra los pulgones en condiciones de laboratorio, los bioensayos pueden dividirse en dos partes principales: la cámara de inoculación y la inoculación fúngica. El protocolo actual describe la construcción de una cámara de inoculación, donde los pulgones pueden mantenerse utilizando varios métodos, como una hoja extirpada con un pecíolo envuelto en algodón húmedo, un disco de hoja extirpado con una placa de Petri forrada con papel de filtro humedecido, el mantenimiento directo en plantas en maceta o un disco de hoja extirpado incrustado en agar agua dentro de una placa de Petri o recipiente10. 11,13. Los métodos comunes para la inoculación de hongos incluyen la fumigación de conidios, la inmersión de pulgones en una suspensión de conidios, la inmersión de hojas en una suspensión de conidios y la inoculación de endófitos de plantas11,14,15,16. Si bien existen varios métodos de inoculación, los bioensayos deben simular las condiciones de aplicación en el campo. Por ejemplo, en el caso del método de inmersión foliar12,17, se puede evaluar la eficiencia de la EPF, pero dado que los pulgones infestan las hojas cargadas de hongos, el lado dorsal del pulgón, que es un sitio de penetración preferencial, generalmente no se expone al hongo.

Para evaluar el efecto afidicida de la FEP en condiciones de laboratorio, este protocolo sugiere utilizar el método de hojas separadas descrito por Yokomi y Gottwald18 con algunas modificaciones, seguido de la inoculación de conidios con un microaspersor. Este método mantiene aproximadamente el 100% de humedad en la cámara de bioensayo durante al menos siete días sin requerir reposición adicional de agua18,19. Además, confinar a los pulgones a una superficie asegura su exposición a la fumigación de conidios y facilita las observaciones20. Sin embargo, los pulgones pueden atascarse en la superficie expuesta del agar mientras se mueven dentro de la cámara de inoculación. Además, el registro de datos en el experimento de la placa de Petri con pulgones de la mostaza, que son insectos partenogenéticos, puede ser un desafío debido a su rápido desarrollo y reproducción. Es difícil distinguir entre los adultos inoculados y su progenie sin extirpación. Los detalles de cómo proceder con este paso rara vez se mencionan, y algunos factores inconsistentes, como el área de consumo de hojas, deben optimizarse.

Este protocolo demuestra un sistema estable para el cribado de la virulencia de los aislados de EPF frente a los pulgones de la mostaza, lo que permite la selección de posibles aislados frente a varias especies de pulgones de una extensa biblioteca de EPF. Se pueden identificar pulgones recolectados en el campo y se puede establecer una población de laboratorio suficiente de pulgones de la mostaza para evaluar el efecto afidicida de varios aislados de hongos utilizando una metodología fácil y factible con resultados consistentes. Los pulgones han desarrollado múltiples mecanismos evolutivos en respuesta a las intensas y repetidas presiones antropogénicas en los agroecosistemas, lo que plantea desafíos para la seguridad alimentaria9. Por lo tanto, este método descrito podría extenderse para evaluar posibles aislados de EPF frente a varias especies de pulgones.

Protocolo

NOTA: El diagrama de flujo completo se muestra en la Figura 1.

1. Recolección y mantenimiento del pulgón de la mostaza

  1. Recolección de pulgones de la mostaza
    1. Voltee las hojas y verifique visualmente si hay infestación de pulgones de la mostaza en los cultivos crucíferos en el campo.
    2. Registre la información del sitio de muestreo (es decir, GPS) y la(s) planta(s) huésped(es), y confirme el historial de aplicaciones de insecticidas con los agricultores.
    3. Use un aspirador de insectos o un pincel fino para pintar (consulte la Tabla de materiales) para recolectar alrededor de 50 pulgones de mostaza en un tubo de centrífuga de 50 ml de cultivos crucíferos en el campo y lleve la muestra al laboratorio dentro de las 3 h.
    4. Prepare una placa de Petri de mantenimiento temporal con hojas crucíferas extirpadas y papel de filtro infiltrado de agua en la parte inferior.
    5. Coloque los cinco pulgones en la placa de Petri de mantenimiento temporal a temperatura ambiente (25 ± 2 °C) con una humedad relativa del 70% y fotoperiodo de 12:12 h (claro:oscuro) durante 14 días para confirmar que el pulgón no tiene enemigos naturales antes de seguir criando.
      NOTA: Para garantizar que los pulgones recolectados en el campo estén libres de enemigos naturales como avispas parasitoides u hongos entomopatógenos, es crucial confirmar la ausencia de estos organismos antes de continuar con la cría.
  2. Mantenimiento de pulgones de la mostaza
    NOTA: Para mantener los pulgones de la mostaza, use hojas crucíferas sin pesticidas (incluido el biopesticida).
    1. Proporcionar un suministro estable y suficiente de hojas crucíferas (unos 25cm2).
      NOTA: Obtenga las hojas de crucíferas en el mercado o cultive las plantas. Antes de la cría masiva a largo plazo de pulgones de la mostaza, se podían probar varios tipos diferentes de crucíferas para encontrar una crucífera adecuada. Una vez fijada la especie de la hoja crucífera, no la cambies. En este estudio se utilizó Komatsuna (Brassica rapa var. perviridis) en etapa de 6-7 hojas (ver Tabla de Materiales). Además, deseche las 2-3 hojas más viejas.
    2. Agregue agua antes de que el papel de filtro en la parte inferior esté completamente seco.
    3. Observe diariamente la densidad de población de los pulgones de la mostaza. La población debería crecer a 2-3 veces después de 7 días.
    4. Cuando aumente el número de pulgones, corte las hojas originalmente extirpadas con pulgones de mostaza en 4-6 trozos más pequeños y coloque cada trozo de hoja pequeña con pulgones de mostaza en una placa de Petri con hojas frescas extirpadas y papel de filtro infiltrado en agua.
    5. Colocar la placa de Petri en una incubadora a 25 °C con un fotoperiodo de 12:12 h (claro:oscuro) y observar diariamente la densidad de población de pulgones de la mostaza.
    6. Retire las hojas originales extirpadas después de que la mayoría de los pulgones migren a hojas frescas extirpadas antes de que las hojas originales se pudran.

2. Identificación molecular del pulgón de la mostaza

NOTA: Para confirmar la especie de pulgón de la mostaza recolectado en campo, se realizó la identificación molecular utilizando dos marcadores moleculares: la región amplificada caracterizada por secuencia (SCAR) basada en A05Le diseñada por Lu et al.21, y la región de la subunidad 1 (COI) de la citocromo oxidasa del pulgón de la mostaza del pulgón de la mostaza.

  1. Extracción de ADN genómico del pulgón de la mostaza
    1. Recoja aproximadamente 50 pulgones en un tubo de centrífuga de 1,5 ml.
      NOTA: Los pulgones utilizados para la identificación molecular deben ser descendientes de un solo pulgón, y también se pueden agrupar varias etapas en el mismo tubo para la extracción de ADN.
    2. Homogeneizar los pulgones con un mortero de pellets y extraer el ADN utilizando el kit de aislamiento de ADN genómico Gene-Spin siguiendo las instrucciones del fabricante (ver Tabla de materiales).
    3. Eluir el ADN genómico con 50 μL de agua precalentada libre de nucleasas.
  2. Amplificación por PCR y secuenciación de ADN
    1. Amplificar las secuencias de ADN diana a partir del ADN genómico de pulgones utilizando la mezcla maestra de PCR (2x) con pares de cebadores A05LeF/A05LeR y LeCO1F/LeCO1R (Tabla 1) con diferentes programas de PCR21.
      NOTA: La reacción de PCR con un volumen total de 20 μL se compone de 2 μL de plantilla de ADN genómico de pulgón, 1 μL de cebadores directos y 1 μL inversos, 10 μL de mezcla maestra de PCR (ver Tabla de materiales) y 6 μL ddH2O.
    2. Realizar la PCR en termociclador (ver Tabla de Materiales) con el siguiente programa: 94 °C durante 5 min, 25 ciclos de 94 °C durante 45 s, 61 °C (para A05LeF/A05LeR) y 58 °C (para LeCO1F/LeCO1R) durante 45 s, 72 °C durante 1 min, seguido de una extensión final de 72 °C durante 5 min.
    3. Analizar el producto de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% para confirmar la identidad del pulgón de la mostaza (Figura 2).
      NOTA: Si el par de cebadores A05LeF/A05LeR amplifica con éxito el tamaño correcto del fragmento de ADN, ha identificado de manera convincente el pulgón recolectado en el campo como pulgón mostaza21. Los pares de cebadores se enumeran en la Tabla 2.
    4. Purifique el producto de PCR del amplicón COI del pulgón de la mostaza utilizando un kit de gel/PCR disponible en el mercado siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales) y secuencie el producto de PCR utilizando un servicio de secuenciación comercial.
  3. Análisis de secuencias
    NOTA: De acuerdo con Lu et al.21, la flexión del ADN de A05Le es un fragmento de ADN específico del pulgón mostaza; por lo tanto, no es necesario secuenciar más el producto de PCR A05Le.
    1. Compruebe la calidad de lectura del software Chromas (consulte la Tabla de materiales) después de obtener la secuencia de LeCO1.
    2. Recorte las lecturas de baja calidad ascendentes y descendentes abriendo un archivo fasta (o txt) y eliminando directamente las lecturas de baja calidad.
    3. Envíe la secuencia recortada a NCBI web BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) utilizando los parámetros predeterminados.
      NOTA: Si los tamaños de amplicón de los conjuntos de cebadores A05Le y LeCO1 son correctos, teóricamente, la búsqueda de blastos de secuencia en las bases de datos estándar del NCBI debe coincidir con el pulgón mostaza.

3. Preparación de hongos entomopatógenos

NOTA: El EPF utilizado en este estudio se muestra en la Tabla 1.

  1. Recuperación de EPF a partir de una biblioteca fúngica
    1. Descongelar el stock de hongos conservados (conidios suspendidos en glicerina al 30%) del congelador a -80 °C.
    2. Transfiera una pequeña cantidad (aproximadamente 10 μL) de la suspensión de conidios a una placa de agar dextrosa Sabouraud (SDA) de 6 cm 1/4 (0,75 g de caldo de dextrosa Sabouraud con 1,5 g de agar por cada 100 ml ddH2O) y extiéndalo uniformemente utilizando un esparcidor celular en una campana de flujo laminar.
    3. Selle la placa de Petri con una película de parafina e incube en la oscuridad a 25 °C durante 10-14 días.
    4. Vuelva a cultivar los aislados de hongos rayando la masa fúngica en una placa de 1/4 de SDA e incubando los hongos en la oscuridad a 25 °C durante 10-14 días antes de cosechar los conidios22.
      NOTA: El cultivo de hongos debe usarse aproximadamente 10 días antes de inocular los pulgones. No se recomienda el uso de cultivos de EPF de más de 14 días de antigüedad en la prueba de virulencia.
  2. Preparación de suspensión de conidios
    1. Raspe los conidios del cultivo de hongos de 10-14 días de edad en una placa de 1/4 de SDA inoculando el asa después de agregar 2-3 mL 0.03% Tween 80 (ver Tabla de Materiales).
    2. Recoja la suspensión de hongos en un tubo de centrífuga.
    3. Agite la solución a la velocidad más alta, cuente el número de conidios con un hemocitómetro bajo un microscopio óptico y ajuste la concentración de la suspensión de conidios a 108 conidios/ml.
    4. Transfiera la suspensión de conidios a un microrociador esterilizado por UV.
      NOTA: Vuelva a colocar en vórtice la suspensión de los conidios antes de transferirla, ya que los conidios son propensos a precipitar. El micropulverizador debe exponerse a la radiación ultravioleta en una campana de flujo laminar durante 30 minutos antes de su uso.

4. Detección de virulencia contra el pulgón de la mostaza

  1. Preparación de adultos recién emergidos
    1. Mueva a los adultos ápteros (sin alas) y alados (alados) de la placa de Petri de cría a las hojas recién extirpadas para reproducir nuevas progenies de la misma edad. Retirar los adultos después de 24 h para evitar el hacinamiento y minimizar la producción de progenies aladas23,24. Solo se utilizarán adultos ápteros en experimentos posteriores.
    2. Cría progenies hasta la etapa adulta y elimina las progenies que no se desarrollan en la etapa adulta después de 48 h (Figura 3) para evitar la variación de edad entre pulgones para el experimento. Además, elimine a los adultos alados.
  2. Preparación de la cámara de inoculación
    NOTA: Se recomienda preparar primero hojas crucíferas de 9 cm de diámetro, para que el disco de la hoja pueda incrustarse en el agar agua antes de la solidificación.
    1. Limpie las hojas crucíferas con agua del grifo, elimine la suciedad y los residuos, y cualquier otro artrópodo si está presente.
    2. Limpie el exceso de agua con una toalla de papel y verifique si hay otros artrópodos en la superficie de las hojas crucíferas con un microscopio estereoscópico. Retira los artrópodos que estén presentes.
    3. Corta un disco de hoja de 9 cm de diámetro, ya sea presionando directamente la placa de Petri inferior sobre la hoja como un molde o usando unas tijeras.
      NOTA: Si las hojas tienen menos de 9 cm de diámetro, combine un par de hojas extirpadas.
    4. Prepare agar agua al 1,5% para cada placa de Petri calentando y disolviendo 450 mg de agar (ver Tabla de Materiales) en 30 mL ddH2O usando microondas.
      NOTA: La cantidad de agar agua al 1,5% se puede ajustar en función de la escala del experimento.
    5. Vierta 30 ml de agar agua al 1,5% en la placa de Petri de 9 cm antes de la solidificación en la campana de flujo laminar, y luego espere a que el agar se enfríe a ~ 40 °C hasta que la superficie del agar esté semisolidificada.
      NOTA: Compruebe si la superficie está semisolidificada agitando suavemente la placa de Petri horizontalmente.
    6. Coloque el disco de la hoja, con la superficie abaxial hacia arriba, encima del agar agua, incrustando el disco de la hoja en el agar.
      NOTA: Minimice la exposición de la superficie del agar.
    7. Después de que el agar agua se haya solidificado por completo, cierre la tapa de la placa de Petri.
      NOTA: Abra la tapa para que el agua se vaporice si se condensan muchas gotas en la cubierta inmediatamente.
    8. Coloque 20 adultos ápteros en el disco de la hoja.
      NOTA: Se recomienda operar bajo un microscopio estereoscópico para evitar daños en sus piezas bucales.
  3. Inoculación y observación de EPF
    1. Abra la tapa de la cámara de inoculación y rocíe 0,3 ml de suspensión de conidios (a partir del paso 3.2) directamente sobre los pulgones y el disco de la hoja desde unos 15 cm por encima del disco de la hoja.
      NOTA: Vuelva a colocar en vórtice la suspensión de conidios antes de rociar. Las áreas de pulverización deben probarse antes del experimento, ya que pueden variar entre los diferentes pulverizadores. En este caso, se recomienda 0,3 ml con una distancia de 15 cm. El área de pulverización debe cubrir todo el disco de la hoja y una capa delgada de suspensión de conidios debe cubrir el disco de la hoja. Si las gotitas convergen en el agua estancada de la hoja, se debe disminuir el volumen de inoculación. Limpie la mesa con etanol al 70% antes de la inoculación y entre el uso de diferentes aislados.
    2. Espere a que la suspensión de conidios se seque y luego cierre la tapa para evitar que los pulgones de la mostaza se ahoguen.
      NOTA: Los pulgones rara vez deambulan durante el experimento; Sin embargo, sigue siendo necesario asegurarse de que los pulgones no se escapen.
    3. Sellar la cámara de inoculación con una película de parafina para mantener una humedad relativa elevada y colocar la cámara de inoculación en una incubadora a 25 °C con fotoperiodo 12:12 h (claro:oscuro).
    4. Abra la tapa de la cámara de inoculación para contar la mortalidad bajo un microscopio estereoscópico cada 12 h durante 5 días.
    5. Limpie la melaza adherida a la cubierta con una toalla de papel y retire los pulgones recién emergidos con un pincel fino para pintar. Limpie la tapa con agua del grifo cada 24 h.
      NOTA: El período de observación puede variar para diferentes especies de pulgones en función de la longevidad adulta.
    6. Mantenga el cadáver en el disco de la hoja para la micosis para confirmar el éxito de la inoculación.
  4. Confirmación de la tasa de germinación de los conidios
    NOTA: Este paso es opcional. Confirmar la tasa de germinación de los conidios por pares al realizar el cribado de virulencia para asegurar la actividad de los conidios.
    1. Deje caer una gota de suspensión de conidios de 5 μL en 1/4 SDA para tres repeticiones.
    2. Después de 18 h, calcule la tasa de germinación con el microscopio óptico. Cuente al menos 100 esporas al azar en una sola gota para confirmar la tasa de germinación de hongos.
      NOTA: Normalmente, la tasa de germinación de los aislados utilizados en el experimento debe ser superior al 90%.

5. Bioensayo de aislados seleccionados de EPF

NOTA: Los aislados de EPF que mostraron alta virulencia, que se seleccionaron en el paso 4, se sometieron a un bioensayo contra pulgones de la mostaza utilizando cuatro concentraciones de suspensiones de conidios (que oscilaron entre 104 y 107 conidios/mL).

  1. Preparación de suspensión de conidios
    1. Repita el paso 3.1 para recuperar los aislados EPF seleccionados.
    2. Repita el paso 3.2 para preparar cuatro concentraciones de suspensión de conidios, incluyendo 104, 105,10 6 y 107 conidios/mL.
  2. Preparación de adultos recién emergidos
    1. Repita el paso 4.1 para preparar a los adultos recién emergidos.
  3. Preparación de la cámara de inoculación
    1. Repita el paso 4.1. para preparar la cámara de inoculación.
  4. Inoculación y observación de EPF
    1. Repita el paso 4.3. para realizar la inoculación y observación de EPF con las cuatro concentraciones de suspensión de conidios, respectivamente.

6. Análisis estadístico

  1. Cálculo de la mortalidad corregida
    1. Calcule la mortalidad corregida utilizando la fórmula25 de Abbott, como se muestra a continuación:
      Mortalidad corregida (%) = [(MT− M C) × 100%] / (100− MC)
      MT representa la mortalidad del grupo de tratamiento y MC representa la mortalidad del grupo de control.
      NOTA: La mortalidad del grupo control no debe ser superior al 20%.
    2. Abra la plataforma de software SPSS (ver Tabla de Materiales), cree variables que incluyan "tratamiento" y "cor_mor" (que representan la mortalidad corregida) e ingrese los resultados calculados para la inoculación de diferentes aislados en el mismo punto de tiempo con la misma concentración inoculada.
    3. Seleccione Analizar, Comparar medias y proporciones, Prueba T de muestras independientes en SPSS para un análisis de prueba t independiente.
    4. En SPSS, introduzca el tratamiento en el cuadro "Variable de agrupación" y cor_mor en "Variable(s) de prueba". Defina grupos por diferentes aislados de hongos. Presione OK para analizar.
  2. Cálculo de la mediana del tiempo letal (LT 50) y de la mediana de la concentración letal (LC50)
    1. Abra el SPSS, cree las variables "total", "respuesta" y "duración"/"concentración", e introduzca el resultado registrado en la hoja de cálculo.
    2. Seleccione Analizar, Regresión, Probit en SPSS para calcular LT 50 y/o LC50.
      NOTA: Si la mortalidad acumulada no supera el 50% eventualmente, no se puede estimar LT 50 y/o LC50.
    3. Ingrese el total en el cuadro "Total observado", la respuesta en el cuadro "Frecuencia de respuesta ", la duración/concentración en el cuadro "Covariable(s)". Presione OK para analizar.
      NOTA: Por lo general, presione Opciones y establezca el "Nivel de significación para el uso del factor de heterogeneidad" en 0.05.

Resultados

El diagrama de flujo presentado ilustra la condición estable de los pulgones de la mostaza desde la recolección en el campo hasta el cribado de virulencia. El mantenimiento de pulgones procedentes de la recolección en campo garantizó un aumento estable de las colonias de pulgones con un suministro adecuado de alimentos. Los pulgones recolectados en el campo se confirmaron como pulgones de la mostaza mediante el uso de marcadores moleculares, incluido el tamaño del amplicón de PCR y la secuenciación de LeCO1. El cr...

Discusión

Las crucíferas, un grupo de hortalizas, suelen estar infestadas por múltiples especies de pulgones, como el pulgón de la mostaza (L. erysimi) y el pulgón de la col (Brevicoryne brassicae)26. Ambas especies han sido reportadas en Taiwán27, y es posible que coexistan en el sitio de recolección. Para distinguir especies de pulgones estrechamente relacionadas, este estudio empleó una técnica de identificación molecular utilizando un juego de cebadores...

Divulgaciones

Los autores declaran que no existe ningún conflicto de intereses en este trabajo.

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada por 109-2313-B-005-048-MY3 del Ministerio de Ciencia y Tecnología (MOST).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
10 μL Inoculating LoopNEST Scientific718201
100 bp DNA Ladder IIIGeneaidDL007
2x SuperRed PCR Master MixBiotoolsTE-SR01
50 mL centrifuge tubeBioman ScientificET5050-12
6 cm Petri dishAlpha Plus Scientific16021
6 mm insect aspiratorMegaView ScienceBA6001
70 mm filter paper NO.1Toyo Roshi Kaisha
70% ethanol
9 cm Petri dishAlpha Plus Scientific16001
AgarBioman ScientificAGR001.1Microbiology grade
AgaroseBioman ScientificPB1200
BioGreen Safe DNA Gel BufferBioman ScientificSDB001T
ChromasTechnelysium
GeneDoc
GenepHlow Gel/PCR KitGeneaidDFH300https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf
Gene-Spin Genomic DNA Isolation KitProtech TechnologyPT-GD112-V3http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf
HemocytometerPaul Marienfeld640030
Komatsuna leaves (Brassica rapa var. perviridis)Tai Cheng Farm1-010-300410
Microsprayer
MiniAmp Thermal CyclerThermo Fisher ScientificA37834
Mustard aphid (Lipaphis erysimi)
Painting brushTian Cheng brush company4716608400352
Parafilm MBemisPM-996
Pellet pestleBioman ScientificGT100R
Sabouraud Dextrose BrothHiMediaMH033-500G
SPSS StatisticsIBM
TAE buffer 50xBioman ScientificTAE501000
Tween 80PanReac AppliChem142050.1661

Referencias

  1. Ghosh, S., Roy, A., Chatterjee, A., Sikdar, S. R. Effect of regional wind circulation and meteorological factors on long-range migration of mustard aphids over indo-gangetic plain. Scientific Reports. 9, 5626 (2019).
  2. Dhillon, M. K., Singh, N., Yadava, D. K. Preventable yield losses and management of mustard aphid, Lipaphis erysimi (Kaltenbach) in different cultivars of Brassica juncea(L.) Czern & Coss. Crop Protection. 161, 106070 (2022).
  3. Huang, F., Hao, Z., Yan, F. Influence of oilseed rape seed treatment with imidacloprid on survival, feeding behavior, and detoxifying enzymes of mustard aphid, lipaphis erysimi. Insects. 10 (5), 144 (2019).
  4. Mannino, M. C., Huarte-Bonnet, C., Davyt-Colo, B., Pedrini, N. Is the insect cuticle the only entry gate for fungal infection? insights into alternative modes of action of entomopathogenic fungi. Journal of Fungi. 5 (2), 33 (2019).
  5. Bamisile, B. S., Akutse, K. S., Siddiqui, J. A., Xu, Y. Model application of entomopathogenic fungi as alternatives to chemical pesticides: prospects, challenges, and insights for next-generation sustainable agriculture. Frontiers in Plant Science. 12, 741804 (2021).
  6. Scorsetti, A. C., Humber, R. A., Garcia, J. J., Lopez Lastra, C. C. Natural occurrence of entomopathogenic fungi (Zygomycetes: Entomophthorales) of aphid (Hemiptera: Aphididae) pests of horticultural crops in Argentina. Biocontrol. 52, 641-655 (2007).
  7. Liu, Y. C., Ni, N. T., Chang, J. C., Li, Y. H., Lee, M. R., Kim, J. S., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
  8. Francis, F., Fingu-Mabola, J. C., Fekih, I. B. Direct and endophytic effects of fungal entomopathogens for sustainable aphid control: a review. Agriculture. 12 (12), 2081 (2022).
  9. Simon, J., Peccoud, J. Rapid evolution of aphid pests in agricultural environments. Current Opinion in Insect Science. 26, 17-24 (2018).
  10. Ujjan, A. A., Shahzad, S. Use of Entomopathogenic Fungi for the Control of Mustard Aphid (Lipaphis erysimi) on canola (Brassica napus L). Pakistan Journal of Botany. 44 (6), 2081-2086 (2012).
  11. Sajid, M., Bashir, N. H., Batool, Q., Munir, I., Bilal, M., Jamal, M. A., et al. In-vitro evaluation of biopesticides (Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Bacillus thuringiensis) against mustard aphid Lipaphis erysimi kalt. (Hemiptera: Aphididae). Journal of Entomology and Zoology Studies. 5 (6), 331-335 (2017).
  12. Paschapur, A. U., Subbanna, A. R. N. S., Singh, A. K., Jeevan, B., Stanley, J., Rajashekara, H., Mishra, K. K., Koti, P. S., Kant, L., Pattanayak, A. Alternaria alternata strain VLH1: a potential entomopathogenic fungus native to North Western Indian Himalayas. Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 138 (2022).
  13. Miohammed, A. A. Lecanicillium muscarium and Adalia bipunctata combination for the control of black bean aphid, Aphis fabae. Biocontrol. 63, 277-287 (2018).
  14. Thaochan, N., Ngampongsai, A., Prabhakar, C. S., Hu, Q. Beauveria bassiana PSUB01 simultaneously displays biocontrol activity against Lipaphis erysimi (Kalt.) (Hemiptera: Aphididae) and promotes plant growth in Chinese kale under hydroponic growing conditions. Biocontrol Science and Technology. 31 (10), 997-1015 (2021).
  15. Mseddi, J., Farhat-Touzri, D. B., Azzouz, H. Selection and characterization of thermotolerant Beauveria bassiana isolates and with insecticidal activity against the cotton-melon aphid Aphis gossypii (Glover) (Hemiptera: Aphididae). Pest Management Science. 78 (6), 2183-2195 (2022).
  16. Butt, T. M., Ibrahim, L., Clark, S. J., Beckett, A. The germination behaviour of Metarhizium anisopliae on the surface of aphid and flea beetle cuticles. Mycological Research. 99 (8), 945-950 (1995).
  17. Ullah, S., Raza, A. B. M., Alkafafy, M., Sayed, S., Hamid, M. I., Majeed, M. Z., Riaz, M. A., Gaber, N. M., Asim, M. Isolation, identification and virulence of indigenous entomopathogenic fungal strains against the peach-potato aphid, Myzus persicae Sulzer (Hemiptera: Aphididae), and the fall armyworm, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae). Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 2 (2022).
  18. Yokomi, R. K., Gottwald, T. R. Virulence of Verticillium lecanii Isolates in Aphids Determined by Detached-leaf Bioassay. Journal of Inbertebrate Pathology. 51, 250-258 (1988).
  19. Vu, V. H., Hong, S. I., Kim, K. Selection of entomopathogenic fungi for aphid control. Journal of Bioscience and Bioengineering. 104 (6), 498-505 (2007).
  20. Vandenberg, J. D. Standardized bioassay and screening of beauveria bassiana and paecilomyces fumosoroseus against the russian wheat aphid (homoptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 89 (6), 1418-1423 (1996).
  21. Lu, W. N., Wu, Y. T., Kuo, M. H. Development of species-specific primers for the identification of aphids in Taiwan. Applied Entomology and Zoology. 43 (1), 91-96 (2008).
  22. Liu, Y. C., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
  23. Menger, J., Beauzay, P., Chirumamilla, A., Dierks, C., Gavloski, J., Glogoza, P., et al. Implementation of a diagnostic-concentration bioassay for detection of susceptibility to pyrethroids in soybean aphid (hemiptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 113 (2), 932-939 (2020).
  24. Zhang, R., Chen, J., Jiang, L., Qiao, G. The genes expression difference between winged and wingless bird cherry-oat aphid Rhopalosiphum padi based on transcriptomic data. Scientific Reports. 9, 4754 (2019).
  25. Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of Economic Entomology. 18, 265-267 (1925).
  26. Liu, T. X., Sparks, A. N. . Aphids on Cruciferous Crops: Identification and Management. , 9-11 (2001).
  27. Kuo, M., Chianglin, H. Temperature dependent life table of brevicoryne brassicae (l.)(hemiptera: aphididae) on radish. Formosan Entomologist. 27, 293-302 (2007).
  28. Im, Y., Park, S., Lee, S. Y., Kim, J., Kim, J. J. Early-Stage defense mechanism of the cotton aphid aphis gossypii against infection with the insect-killing fungus beauveria bassiana JEF-544. Frontiers in Immunology. 13, 907088 (2022).
  29. Kim, J. J., Roberts, D. W. The relationship between conidial dose, moulting and insect developmental stage on the susceptibility of cotton aphid, Aphis gossypii, to conidia of Lecanicillium attenuatum, an entomopathogenic fungus. Biocontrol Science and Technology. 22 (3), 319-331 (2012).
  30. Reingold, V., Kottakota, C., Birnbaum, N., Goldenberg, M., Lebedev, G., Ghanim, M., et al. Intraspecies variation ofMetarhiziumbrunneumagainst the green peach aphid,Myzus persicae, provides insight into thecomplexity of disease progression. Pest Management Science. 77, 2557-2567 (2021).
  31. Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Action on the Surface: entomopathogenic fungi versus the insect cuticle. Insects. 4, 357-374 (2013).
  32. Knodel, J. J., Beauzay, P., Boetel, M., Prochaska, T., Chirumamilla, A. . 2022 North Dakota Field Crop Insect Management Guide. , (2021).
  33. Yeo, H., Pell, J. K., Alderson, P. G., Clark, S. J., Pye, B. J. Laboratory evaluation of temperature effects on the germination and growth of entomopathogenic fungi and on their pathogenicity to two aphid species. Pest Management Science. 59 (2), 156-165 (2003).
  34. Erdos, Z., Chandler, D., Bass, C., Raymond, B. Controlling insecticide resistant clones of the aphid, Myzus persicae, using the entomopathogenic fungus Akanthomyces muscarius: fitness cost of resistance under pathogen challenge. Pest Management Science. 77 (11), 5286-5293 (2021).

Reimpresiones y Permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos

Solicitar permiso

Explorar más artículos

Efecto AfidicidaHongos Entomopat genosPulg n de la MostazaLipaphis ErysimiManejo Ecol gico de PlagasAgentes de Control MicrobianoDetecci n de VirulenciaExperimentos con Placa de PetriInsecto partenogen ticoBioensayos de hojas separadasMicro pulverizadorSuspensi n de esporasHumedad relativaPer odo de observaci nReproducci n partenogen ticaAcumulaci n de descendenciaEvaluaci n de virulenciaAislados de EPF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Contáctenos

RECOMIENDE A LA BIBLIOTECA

BOLETINES de JoVE

Investigación

Educación

Autores

Bibliotecarios

ACERCA DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados