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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo presenta un sistema ottimizzato di biodosaggio a foglia staccata per valutare l'efficacia dei funghi entomopatogeni (EPF) contro l'afide della senape (Lipaphis erysimi (Kalt.)), un insetto partenogenetico. Il metodo delinea il processo di raccolta dei dati durante gli esperimenti con piastre di Petri, consentendo ai ricercatori di misurare costantemente la virulenza dell'EPF contro gli afidi della senape e altri insetti partenogenetici.

Abstract

L'afide della senape (L. erysimi) è un parassita che infesta varie colture crocifere e trasmette virus vegetali. Per ottenere una gestione ecologica dei parassiti, i funghi entomopatogeni (EPF) sono potenziali agenti di controllo microbico per il controllo di questo parassita. Pertanto, lo screening della virulenza degli isolati di EPF in condizioni di piastra di Petri è necessario prima dell'applicazione sul campo. Tuttavia, l'afide della senape è un insetto partenogenetico, il che rende difficile registrare i dati durante gli esperimenti con piastre di Petri. Per affrontare questo problema è stato sviluppato un sistema modificato per i saggi biologici delle foglie distaccate, utilizzando un microspruzzatore per inoculare i conidi sugli afidi e prevenire l'annegamento facilitando l'essiccazione all'aria dopo la sospensione delle spore. Il sistema ha mantenuto un'elevata umidità relativa per tutto il periodo di osservazione e il disco fogliare è rimasto fresco per oltre dieci giorni, consentendo la riproduzione partenogenetica degli afidi. Per prevenire l'accumulo di prole, è stato implementato un processo di rimozione quotidiana utilizzando un pennello da pittura. Questo protocollo dimostra un sistema stabile per valutare la virulenza degli isolati di EPF contro gli afidi della senape o altri afidi, consentendo la selezione di potenziali isolati per il controllo degli afidi.

Introduzione

L'afide della senape (L. erysimi) è un noto parassita che infesta una varietà di colture crocifere, causando notevoli perdite economiche1. Sebbene siano stati raccomandati diversi insetticidi sistematici per combattere le infestazioni di afidi, l'uso frequente di questi insetticidi solleva preoccupazioni sulla resistenza ai pesticidi 2,3. Pertanto, in termini di gestione ecologica dei parassiti, i funghi entomopatogeni (EPF) potrebbero fungere da adeguata strategia di controllo alternativa. L'EPF è un insetto patogeno con la capacità di infettare gli ospiti penetrando nelle loro cuticole, il che lo rende un potente agente per il controllo degli afidi e di altri insetti succhiatori delle piante4. Inoltre, l'EPF ha dimostrato di essere una tecnica di gestione dei parassiti fattibile e sostenibile, offrendo vantaggi come l'antagonismo dei patogeni delle piante e la promozione della crescita delle piante5.

L'EPF può essere ottenuto attraverso l'adescamento del suolo degli insetti o isolato dai cadaveri degli insetti nel campo 6,7. Tuttavia, prima di un ulteriore utilizzo di isolati fungini, è necessario uno screening della patogenicità. Sono stati condotti diversi studi sull'efficacia dell'EPF contro gli afidi, che sono importanti parassiti delle colture che possono causare gravi danni 8,9. Gli afidi della senape, tra le varie specie di afidi, sono stati testati per la suscettibilità a diversi ceppi di Beauveria spp., Metarhizium spp., Lecanicillium spp., Paecilomyces spp. e persino Alternaria, che è principalmente noto come fungo saprofita e patogeno delle piante, ma ha mostrato alcuni effetti letali contro gli afidi della senape10,11,12.

Per valutare l'efficacia dell'EPF contro gli afidi in condizioni di laboratorio, i saggi biologici possono essere suddivisi in due parti principali: la camera di inoculazione e l'inoculazione fungina. L'attuale protocollo descrive la costruzione di una camera di inoculazione, in cui gli afidi possono essere mantenuti utilizzando vari metodi, come una foglia asportata con un picciolo avvolto in cotone umido, un disco fogliare asportato con una capsula di Petri rivestita con carta da filtro inumidita, la manutenzione diretta sulle piante in vaso o un disco fogliare asportato incorporato in agar acquoso all'interno di una capsula di Petri o di un contenitore10, 11,13. I metodi comuni per l'inoculazione fungina includono l'irrorazione dei conidi, l'immersione degli afidi in una sospensione dei conidi, l'immersione delle foglie in una sospensione dei conidi e l'inoculazione degli endofitidelle piante 11,14,15,16. Sebbene esistano vari metodi di inoculazione, i saggi biologici dovrebbero simulare le condizioni di applicazione sul campo. Ad esempio, nel caso del metodo12,17 a immersione fogliare, è possibile valutare l'efficienza dell'EPF, ma poiché gli afidi infestano le foglie cariche di funghi, il lato dorsale dell'afide, che è un sito di penetrazione preferenziale, di solito non viene esposto al fungo.

Per valutare l'effetto afididida dell'EPF in condizioni di laboratorio, questo protocollo suggerisce di utilizzare il metodo della foglia staccata descritto da Yokomi e Gottwald18 con alcune modifiche, seguito dall'inoculazione dei conidi utilizzando un micro-spruzzatore. Questo metodo mantiene circa il 100% di umidità nella camera del biosaggio per almeno sette giorni senza richiedere un ulteriore reintegro di acqua18,19. Inoltre, confinare gli afidi su una superficie garantisce la loro esposizione all'irrorazione dei conidi e facilita le osservazioni20. Tuttavia, gli afidi possono rimanere bloccati nella superficie esposta dell'agar mentre si muovono all'interno della camera di inoculazione. Inoltre, la registrazione dei dati nell'esperimento della piastra di Petri con gli afidi della senape, che sono insetti partenogenetici, può essere difficile a causa del loro rapido sviluppo e riproduzione. È difficile distinguere tra gli adulti inoculati e la loro progenie senza rimozione. I dettagli su come procedere con questo passaggio sono raramente menzionati e alcuni fattori incoerenti, come l'area di consumo delle foglie, devono essere ottimizzati.

Questo protocollo dimostra un sistema stabile per lo screening della virulenza degli isolati di EPF contro gli afidi della senape, consentendo la selezione di potenziali isolati contro varie specie di afidi da un'ampia libreria di EPF. È possibile identificare gli afidi raccolti sul campo e stabilire una popolazione di laboratorio sufficiente di afidi della senape per valutare l'effetto afididida di vari isolati fungini utilizzando una metodologia semplice e fattibile con risultati coerenti. Gli afidi hanno sviluppato molteplici meccanismi evolutivi in risposta alle intense e ripetute pressioni antropogeniche negli agroecosistemi, ponendo sfide alla sicurezza alimentare9. Pertanto, questo metodo descritto potrebbe essere esteso per valutare potenziali isolati di EPF contro varie specie di afidi.

Protocollo

NOTA: Il diagramma di flusso completo è mostrato nella Figura 1.

1. Raccolta e manutenzione dell'afide della senape

  1. Collezione di afidi della senape
    1. Capovolgi le foglie e controlla visivamente l'infestazione di afidi della senape sulle colture crocifere nel campo.
    2. Registrare le informazioni sul sito di campionamento (ad es. GPS) e sulle piante ospiti e confermare la cronologia delle applicazioni di insetticidi con gli agricoltori.
    3. Utilizzare un aspiratore per insetti o un pennello da pittura fine (vedere Tabella dei materiali) per raccogliere circa 50 afidi di senape in una provetta da centrifuga da 50 ml da colture crocifere in campo e portare il campione in laboratorio entro 3 ore.
    4. Preparare una capsula di Petri di manutenzione temporanea con foglie crocifere asportate e carta da filtro infiltrata d'acqua sul fondo.
    5. Posizionare i cinque afidi sulla capsula di Petri di mantenimento temporanea a temperatura ambiente (25 ± 2 °C) con un'umidità relativa del 70% e un fotoperiodo di 12:12 h (chiaro:scuro) per 14 giorni per confermare che gli afidi risparmiano il nemico naturale prima di un ulteriore allevamento.
      NOTA: Per garantire che gli afidi raccolti in campo siano esenti da nemici naturali come vespe parassitoidi o funghi entomopatogeni, è fondamentale confermare l'assenza di questi organismi prima di procedere con ulteriori allevamenti.
  2. Mantenimento degli afidi della senape
    NOTA: Per mantenere gli afidi della senape, utilizzare foglie crocifere prive di pesticidi (compresi i biopesticidi).
    1. Fornire un apporto stabile e sufficiente di foglie crocifere (circa 25 cm2).
      NOTA: Procurarsi le foglie di crucifere dal mercato o coltivare le piante. Prima dell'allevamento massiccio e a lungo termine di afidi della senape, è stato possibile testare diversi tipi di crucifere per trovare una crucifera adatta. Una volta fissata la specie della foglia crocifera, non cambiarla. In questo studio è stata utilizzata la Komatsuna (Brassica rapa var. perviridis) allo stadio di 6-7 foglie (vedi Tabella dei materiali). Inoltre, smaltisci le 2-3 foglie più vecchie.
    2. Aggiungere acqua prima che la carta da filtro sul fondo sia completamente asciutta.
    3. Osserva quotidianamente la densità di popolazione degli afidi della senape. La popolazione dovrebbe crescere fino a 2-3 volte dopo 7 giorni.
    4. Quando il numero di afidi aumenta, tagliare le foglie originariamente asportate con gli afidi della senape in 4-6 pezzi più piccoli e mettere ogni piccolo pezzo di foglia con gli afidi della senape in una capsula di Petri con foglie fresche asportate e carta da filtro infiltrata d'acqua.
    5. Porre la capsula di Petri in un'incubatrice a 25 °C con un fotoperiodo di 12:12 h (chiaro:scuro) e osservare quotidianamente la densità di popolazione degli afidi della senape.
    6. Rimuovere le foglie asportate originali dopo che la maggior parte degli afidi è migrata verso le foglie fresche asportate prima che le foglie originali marciscano.

2. Identificazione molecolare dell'afide della senape

NOTA: Per confermare la specie di afide della senape raccolto sul campo, l'identificazione molecolare è stata eseguita utilizzando due marcatori molecolari: la sequenza caratterizzata dalla regione amplificata (SCAR) basata su A05Le progettata da Lu et al.21 e la regione della subunità 1 della citocromo ossidasi dell'afide della senape (COI) dell'afide della senape.

  1. Estrazione del DNA genomico dell'afide della senape
    1. Raccogliere circa 50 afidi in una provetta da centrifuga da 1,5 mL.
      NOTA: Gli afidi utilizzati per l'identificazione molecolare dovrebbero essere discendenti di un singolo afide e vari stadi potrebbero anche essere raggruppati nella stessa provetta per l'estrazione del DNA.
    2. Omogeneizzare gli afidi con un pestello a pellet ed estrarre il DNA utilizzando il kit di isolamento del DNA genomico Gene-Spin seguendo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).
    3. Eluire il DNA genomico con 50 μL di acqua preriscaldata priva di nucleasi.
  2. Amplificazione PCR e sequenziamento del DNA
    1. Amplificare le sequenze di DNA bersaglio dal DNA genomico degli afidi utilizzando PCR Master Mix (2x) con le coppie di primer A05LeF/A05LeR e LeCO1F/LeCO1R (Tabella 1) con diversi programmi di PCR21.
      NOTA: La reazione PCR con un volume totale di 20 μL è composta da 2 μL di stampo di DNA genomico di afidi, 1 μL di primer diretti e 1 μL invertito, 10 μL di PCR Master Mix (vedere la tabella dei materiali) e 6 μL di ddH2O.
    2. Eseguire la PCR in un termociclatore (vedi Tabella dei materiali) con il seguente programma: 94 °C per 5 min, 25 cicli di 94 °C per 45 s, 61 °C (per A05LeF/A05LeR) e 58 °C (per LeCO1F/LeCO1R) per 45 s, 72 °C per 1 min, seguiti da un'estensione finale di 72 °C per 5 min.
    3. Analizzare il prodotto PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio all'1% per confermare l'identità dell'afide della senape (Figura 2).
      NOTA: Se la coppia di primer A05LeF/A05LeR amplifica con successo la dimensione corretta del frammento di DNA, ha identificato in modo convincente l'afide raccolto sul campo come afide della senape21. Le coppie di primer sono elencate nella Tabella 2.
    4. Purificare il prodotto PCR dall'amplicone COI dell'afide della senape utilizzando un kit gel/PCR disponibile in commercio seguendo le istruzioni del produttore (vedere la Tabella dei materiali) e sequenziare il prodotto PCR utilizzando un servizio di sequenziamento commerciale.
  3. Analisi della sequenza
    NOTA: Secondo Lu et al.21, la piegatura del DNA di A05Le è un frammento di DNA specifico dell'afide della senape; pertanto, il prodotto A05Le PCR non deve essere ulteriormente sequenziato.
    1. Controllare la qualità di lettura con il software Chromas (vedere la tabella dei materiali) dopo aver ottenuto la sequenza LeCO1.
    2. Taglia le letture di bassa qualità a monte e a valle aprendo un file fasta (o txt) e rimuovendo direttamente le letture di bassa qualità.
    3. Inviare la sequenza tagliata a NCBI web BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) utilizzando i parametri predefiniti.
      NOTA: Se le dimensioni dell'amplicone dei set di primer A05Le e LeCO1 sono corrette, in teoria, la ricerca di esplosioni in sequenza rispetto ai database standard NCBI deve corrispondere all'afide della senape.

3. Preparazione di funghi entomopatogeni

NOTA: L'EPF utilizzato in questo studio è elencato nella Tabella 1.

  1. Recupero di EPF da libreria fungina
    1. Scongelare i funghi conservati (conidi sospesi in glicerina al 30%) dal congelatore a -80 °C.
    2. Trasferire una piccola quantità (circa 10 μL) della sospensione di conidi in una piastra di agar destrosio Sabouraud da 6 cm 1/4 (0,75 g di brodo di destrosio Sabouraud con 1,5 g di agar per 100 mL ddH2O) e distribuirla uniformemente utilizzando uno spandiconcime cellulare in una cappa a flusso laminare.
    3. Sigillare la capsula di Petri con pellicola di paraffina e incubarla al buio a 25 °C per 10-14 giorni.
    4. Ricoltura degli isolati fungini striando la massa fungina su una piastra da 1/4 di SDA e incubando i funghi al buio a 25 °C per 10-14 giorni prima di raccogliere i conidi22.
      NOTA: La coltura fungina deve essere utilizzata circa 10 giorni prima di inoculare gli afidi. La coltura EPF che ha più di 14 giorni non è raccomandata per l'uso nel test di virulenza.
  2. Preparazione della sospensione di conidi
    1. Raschiare i conidi dalla coltura fungina di 10-14 giorni su piastra SDA da 1/4 inoculando un'ansa dopo aver aggiunto 2-3 ml di Tween 80 allo 0,03% (vedere la tabella dei materiali).
    2. Raccogliere la sospensione fungina in una provetta da centrifuga.
    3. Vorticare la soluzione alla massima velocità, contare il numero di conidi utilizzando un emocitometro al microscopio ottico e regolare la concentrazione della sospensione dei conidi a 108 conidi/mL.
    4. Trasferire la sospensione dei conidi in un microspruzzatore sterilizzato ai raggi UV.
      NOTA: Vorticare nuovamente la sospensione dei conidi prima di trasferirla, poiché i conidi sono inclini a precipitare. Il microspruzzatore deve essere esposto alle radiazioni ultraviolette in una cappa a flusso laminare per 30 minuti prima dell'uso.

4. Screening della virulenza contro l'afide della senape

  1. Preparazione degli adulti appena emersi
    1. Spostare gli adulti atteri (senza ala) e alati (alati) dalla capsula di Petri che si sta rialzando alle foglie appena asportate per riprodurre nuove progenie della stessa età. Rimuovere gli adulti dopo 24 ore per evitare il sovraffollamento e ridurre al minimo la produzione di progenie alata23,24. Solo gli adulti atteri saranno utilizzati in ulteriori esperimenti.
    2. Allevare le progenie allo stadio adulto e rimuovere le progenie che non si sviluppano nello stadio adulto dopo 48 ore (Figura 3) per prevenire la variazione di età tra gli afidi per l'esperimento. Inoltre, rimuovere gli adulti alati.
  2. Preparazione della camera di inoculo
    NOTA: Si consiglia di preparare prima le foglie di crucifere di 9 cm di diametro, in modo che il disco fogliare possa essere incorporato nell'agar acquoso prima della solidificazione.
    1. Pulisci le foglie crocifere con acqua di rubinetto, rimuovi sporco e residui e qualsiasi altro artropode se presente.
    2. Asciugare l'acqua in eccesso con un tovagliolo di carta e verificare la presenza di altri artropodi sulla superficie delle foglie crocifere utilizzando uno stereomicroscopio. Rimuovere eventuali artropodi, se presenti.
    3. Tagliare un disco di foglie di 9 cm di diametro premendo direttamente la capsula di Petri inferiore sulla foglia come stampo o usando le forbici.
      NOTA: Se le foglie hanno un diametro inferiore a 9 cm, unire un paio di foglie asportate.
    4. Preparare l'agar acquoso all'1,5% per ogni capsula di Petri riscaldando e sciogliendo 450 mg di agar (vedere Tabella dei materiali) in 30 mL ddH2O utilizzando il microonde.
      NOTA: La quantità di agar acquoso all'1,5% può essere regolata a seconda della scala dell'esperimento.
    5. Versare 30 mL di agar acquoso all'1,5% nella capsula di Petri da 9 cm prima della solidificazione nella cappa a flusso laminare, quindi attendere che l'agar si raffreddi a ~40 °C fino a quando la superficie dell'agar non è semisolidificata.
      NOTA: Controllare se la superficie è semisolidificata scuotendo delicatamente orizzontalmente la capsula di Petri.
    6. Posizionare il disco fogliare, con la superficie abassiale rivolta verso l'alto, sopra l'agar acquoso, incorporando il disco fogliare nell'agar.
      NOTA: Ridurre al minimo l'esposizione della superficie dell'agar.
    7. Dopo che l'agar acquoso si è solidificato completamente, chiudere il coperchio della capsula di Petri.
      NOTA: Aprire il coperchio per la vaporizzazione dell'acqua se molte goccioline si condensano immediatamente sul coperchio.
    8. Posiziona 20 adulti atteri sul disco fogliare.
      NOTA: Si consiglia di operare sotto uno stereomicroscopio per evitare danni all'apparato boccale.
  3. Inoculazione e osservazione dell'EPF
    1. Aprire il coperchio della camera di inoculo e spruzzare 0,3 mL di sospensione di conidi (dal punto 3.2) direttamente sugli afidi e sul disco fogliare da circa 15 cm sopra il disco fogliare.
      NOTA: Vorticare nuovamente la sospensione dei conidi prima di spruzzare. Le aree di spruzzatura devono essere testate prima dell'esperimento, in quanto possono variare tra i diversi spruzzatori. In questo caso, si consiglia 0,3 mL con una distanza di 15 cm. L'area di spruzzatura dovrebbe coprire l'intero disco fogliare e un sottile strato di sospensione di conidi dovrebbe coprire il disco fogliare. Se le goccioline convergono nell'acqua stagnante sulla foglia, il volume di inoculazione deve essere ridotto. Pulire il tavolo con etanolo al 70% prima dell'inoculazione e tra l'uso di diversi isolati.
    2. Attendere che la sospensione dei conidi si asciughi, quindi chiudere il coperchio per evitare che gli afidi della senape anneghino.
      NOTA: Gli afidi vagano raramente durante l'esperimento; Tuttavia, è comunque necessario assicurarsi che gli afidi non fuoriescano.
    3. Sigillare la camera di inoculo con una pellicola di paraffina per mantenere un'elevata umidità relativa e posizionare la camera di inoculo in un incubatore a 25 °C con fotoperiodo 12:12 h (chiaro:scuro).
    4. Aprire il coperchio della camera di inoculazione per contare la mortalità al microscopio stereoscopico ogni 12 ore per 5 giorni.
    5. Pulisci la melata aderente al coperchio con un tovagliolo di carta e rimuovi gli afidi appena emersi con un pennello da pittura fine. Pulire il coperchio con acqua di rubinetto ogni 24 ore.
      NOTA: Il periodo di osservazione può variare per le diverse specie di afidi in base alla longevità dell'adulto.
    6. Tenere il cadavere sul disco fogliare per la micosi per confermare l'avvenuta inoculazione.
  4. Conferma del tasso di germinazione dei conidi
    NOTA: questo passaggio è facoltativo. Per confermare il tasso di germinazione dei conidi a coppie durante l'esecuzione dello screening della virulenza per garantire l'attività dei conidi.
    1. Far cadere una gocciolina di sospensione di conidi da 5 μL su 1/4 di SDA per tre repliche.
    2. Dopo 18 ore, calcolare il tasso di germinazione con il microscopio ottico. Conta almeno 100 spore in modo casuale in una singola gocciolina per confermare il tasso di germinazione del fungo.
      NOTA: Normalmente, il tasso di germinazione degli isolati utilizzati nell'esperimento dovrebbe essere superiore al 90%.

5. Biodosaggio di isolati EPF selezionati

NOTA: Gli isolati di EPF che hanno mostrato un'elevata virulenza, che è stata selezionata dalla fase 4, sono stati sottoposti a un test biologico contro gli afidi della senape utilizzando quattro concentrazioni di sospensioni di conidi (comprese tra 104 e 107 conidi/mL).

  1. Preparazione della sospensione di conidi
    1. Ripetere il passaggio 3.1 per recuperare gli isolati EPF selezionati.
    2. Ripetere il passaggio 3.2 per preparare quattro concentrazioni di sospensione di conidi, di cui 104, 105,10 6 e 107 conidi/mL.
  2. Preparazione degli adulti appena emersi
    1. Ripetere il passaggio 4.1 per preparare gli adulti appena emersi.
  3. Preparazione della camera di inoculo
    1. Ripetere il passaggio 4.1. per preparare la camera di inoculazione.
  4. Inoculazione e osservazione dell'EPF
    1. Ripetere il passaggio 4.3. per eseguire l'inoculazione e l'osservazione dell'EPF con le quattro concentrazioni di sospensione dei conidi, rispettivamente.

6. Analisi statistica

  1. Calcolo della mortalità corretta
    1. Calcolare la mortalità corretta utilizzando la formula25 di Abbott, come mostrato di seguito:
      Mortalità corretta (%) = [(MT− M C) × 100%] / (100− MC)
      MT rappresenta la mortalità del gruppo di trattamento e MC rappresenta la mortalità del gruppo di controllo.
      NOTA: La mortalità del gruppo di controllo non deve essere superiore al 20%.
    2. Aprire la piattaforma software SPSS (vedere la tabella dei materiali), creare variabili tra cui "trattamento" e "cor_mor" (che rappresentano la mortalità corretta) e inserire i risultati calcolati per l'inoculazione di diversi isolati nello stesso punto temporale con la stessa concentrazione inoculata.
    3. Selezionare Analizza, Confronta medie e proporzioni, Test T a campioni indipendenti in SPSS per l'analisi del test t indipendente.
    4. In SPSS, immettere il trattamento nella casella "Variabile di raggruppamento" e cor_mor in "Variabile/i di prova". Definisci i gruppi in base a diversi isolati fungini. Premere OK per analizzare.
  2. Calcolo del tempo letale mediano (LT 50) e della concentrazione letale mediana (LC50)
    1. Aprire l'SPSS, creare le variabili "totale", "risposta" e "durata"/"concentrazione" e inserire il risultato registrato nel foglio di calcolo.
    2. Selezionare Analizza, Regressione, Probit in SPSS per calcolare LT 50 e/o LC50.
      NOTA: Se la mortalità cumulativa non supera il 50% alla fine, LT 50 e/o LC50 non possono essere stimati.
    3. Inserire il totale nella casella "Totale osservato", la risposta nella casella "Frequenza di risposta ", la durata/concentrazione nella casella "Covariate". Premere OK per analizzare.
      NOTA: In genere, premere Opzioni e impostare il "Livello di significatività per l'uso del fattore di eterogeneità" su 0,05.

Risultati

Il diagramma di flusso presentato illustra le condizioni stabili degli afidi della senape dalla raccolta sul campo allo screening della virulenza. Il mantenimento degli afidi provenienti dalla raccolta in campo ha garantito un aumento stabile delle colonie di afidi con un adeguato approvvigionamento alimentare. Gli afidi raccolti sul campo sono stati confermati come afidi della senape attraverso l'uso di marcatori molecolari, tra cui la dimensione dell'amplicone della PCR e il sequenziamento di LeCO1. Lo screening della ...

Discussione

Le crucifere, un gruppo di ortaggi, sono spesso infestate da diverse specie di afidi, tra cui l'afide della senape (L. erysimi) e l'afide del cavolo (Brevicoryne brassicae)26. Entrambe le specie sono state segnalate a Taiwan27 ed è possibile che coesistano nel sito di raccolta. Per distinguere le specie di afidi strettamente correlate, questo studio ha impiegato una tecnica di identificazione molecolare utilizzando un set di primer multiplex

Divulgazioni

Gli autori dichiarano che non c'è alcun conflitto di interessi coinvolto in questo lavoro.

Riconoscimenti

Questa ricerca è stata supportata dal numero 109-2313-B-005 -048 -MY3 del Ministero della Scienza e della Tecnologia (MOST).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
10 μL Inoculating LoopNEST Scientific718201
100 bp DNA Ladder IIIGeneaidDL007
2x SuperRed PCR Master MixBiotoolsTE-SR01
50 mL centrifuge tubeBioman ScientificET5050-12
6 cm Petri dishAlpha Plus Scientific16021
6 mm insect aspiratorMegaView ScienceBA6001
70 mm filter paper NO.1Toyo Roshi Kaisha
70% ethanol
9 cm Petri dishAlpha Plus Scientific16001
AgarBioman ScientificAGR001.1Microbiology grade
AgaroseBioman ScientificPB1200
BioGreen Safe DNA Gel BufferBioman ScientificSDB001T
ChromasTechnelysium
GeneDoc
GenepHlow Gel/PCR KitGeneaidDFH300https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf
Gene-Spin Genomic DNA Isolation KitProtech TechnologyPT-GD112-V3http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf
HemocytometerPaul Marienfeld640030
Komatsuna leaves (Brassica rapa var. perviridis)Tai Cheng Farm1-010-300410
Microsprayer
MiniAmp Thermal CyclerThermo Fisher ScientificA37834
Mustard aphid (Lipaphis erysimi)
Painting brushTian Cheng brush company4716608400352
Parafilm MBemisPM-996
Pellet pestleBioman ScientificGT100R
Sabouraud Dextrose BrothHiMediaMH033-500G
SPSS StatisticsIBM
TAE buffer 50xBioman ScientificTAE501000
Tween 80PanReac AppliChem142050.1661

Riferimenti

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