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摘要

本研究阐述了选择性脊柱推拿对脑瘫婴儿大鼠生长发育的影响，强调了具体的手术和标准化的方案。进行体重测量、 Rotarod 试验、足部故障评分、其他行为测试和生长激素检测以评估方案。

摘要

脑瘫 （CP） 是一种难治性儿科疾病，患病率高，残疾率高，治疗难度大。目前有多种治疗方法用于治疗 CP。治疗包括药物和非药物治疗。中医外用疗法是非药物治疗中一种非常有特色的治疗方法。推拿作为中医的外治疗法之一，用于治疗脑瘫，疗效好，副作用小，可作性强。选择性脊柱推拿作为中医外疗的一部分，可以有效促进脑瘫幼鼠的生长发育。手术主要分为四个步骤：首先，将揉搓法应用于脊柱和脊柱两侧，持续 1 min。按压揉捏法对脊柱进行 5 min，对脊柱两侧肌肉进行 5 min。其次，按压揉捏脊柱敏感的局部穴位 2 min。第三，采用扭转法治疗患肢 1 min。第四，将摩擦法应用于从前额到大脑后部的中线 1 min。本研究旨在使用选择性脊柱推拿治疗脑瘫婴儿大鼠。检测脑瘫幼鼠的体重、Rotarod 试验、足部故障评分和生长激素，以了解选择性脊柱推拿对脑瘫幼鼠生长发育的影响。结果表明，能促进体重增加，提高平衡能力和运动功能，促进婴儿脑瘫大鼠生长发育，促进生长激素分泌，提高背部敏感部位温度。

引言

脑瘫 （CP） 是由胎儿或婴儿期大脑的非进行性损伤引起的，是一组以运动和姿势发育异常1、发育障碍（包括体重缓慢增加2、3、4 和运动功能障碍）为特征的疾病。中国脑瘫的发病率为 2.48%，患病率为 2.46‰（1-6 岁）5。外国研究报告的患病率为 2.4%-3.6%6。脑瘫是儿童身体损伤和残疾的主要原因，其中平衡和运动障碍对日常生活活动有重大影响1。脑瘫可由早产、感染、遗传、新生儿缺血缺氧、新生儿黄疸等复杂多样的致病因素引起7。脑瘫的治疗目标是改善身体机能和生活质量 8。目前，脑瘫的治疗方法包括脑深部刺激9、机器人辅助步态训练10、腕踝针11 和经络针联合按摩12。

中医 （TCM） 已越来越多地被用作 CP的有效治疗方法 13,14。按摩作为其中的一部分，也起着一定的作用。例如，选择性脊柱作可以调节 DNA 羟甲基化状态，以调节神经发育并改善学习和记忆功能15。在脑瘫幼鼠的治疗中，选择性脊柱推拿可能通过调节炎性细胞因子 TNF-α 和 IL-10 基因启动子区16 的甲基化水平来改善皮层和海马的炎性稳态，对脑瘫幼鼠的平衡能力起到积极的治疗作用16。选择性脊柱推拿可以改善脑瘫幼鼠的认知功能17。选择性脊柱推拿用于治疗患有脑瘫的婴儿大鼠，并观察到它对它们的生长发育也有治疗作用18。

本研究旨在通过测量体重、Rotarod 试验19、足部故障评分20、21 等行为学检查和生长激素检测，阐明选择性脊柱推拿对脑瘫幼鼠生长发育的影响，为相关人员提供研究思路。

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研究方案

本研究获得云南中医药大学实验动物伦理委员会批准。所有动物实验作均遵循实验动物还原、优化和替代的 3R 原则（编号 R-06202018）。本实验使用无特异性病原体 （SPF） 级的健康 Sprague Dawley （SD） 大鼠 （14 只雄性和 7 只雌性），平均体重为 250-300 g。大鼠在云南中医药大学SPF级动物房饲养，证书编号：SYXK（Yunnan）K2022-0004。所有大鼠均在 22-26 °C 的室温和 40%-50% 的相对湿度下，在自然光控制环境中进行 12 小时的光照/黑暗循环。适应性饲喂 1 周后，雄/雌比维持在 1：2。1 周后，将怀孕大鼠饲养在一个笼子里，正常喂养，自由进食和饮水。自然分娩后，选择妊娠大鼠所生的健康幼鼠。将幼鼠分为 Sham、Control 和 Treatment 组，观察选择性脊柱推拿对脑瘫幼鼠生长发育的影响。从每组中选择 6 只雄性幼崽进行实验。治疗组从出生后第5 天开始 进行选择性脊柱推拿治疗，治疗 6 d，休息 1 d。

1. 建立脑瘫模型

  1. 对手术所需的显微镜、眼科剪刀、镊子、缝合线、手术板、剪刀、棉签和手套进行消毒，并放置在手术室中。
  2. 在出生后的第三天将幼崽与母亲暂时分开，将其放在一个框架中，然后将其运送到无菌手术室。
  3. 测量体重。在研究中包括体重在 7-9 g 之间的幼鼠，并排除那些不符合体重的幼鼠。将婴儿大鼠随机分为假组、对照组和治疗组。
  4. 用 2% 浓度的异氟醚诱导麻醉，并使用小动物吸入气体麻醉机将麻醉维持在 1%。
    注：本实验主要是为了观察选择性脊柱推拿对脑瘫幼鼠生长发育的影响。造模过程中已按照一般要求进行麻醉，额外镇痛会影响观察结果。
    1. 将小动物气体麻醉剂接通电源，打开连接到感应箱的阀门。
    2. 将幼鼠放入诱导箱中，转动浓度调节旋钮，将异氟醚浓度调节至 2% 以诱导麻醉。
    3. 当幼鼠失去知觉时，将其从感应箱中取出。将其放在手术板上并关闭麻醉机的通道 1。
    4. 将婴儿大鼠仰卧。固定麻醉吸入面罩以维持麻醉。
    5. 打开连接到麻醉吸入面罩的通道。通过转动浓度调节旋钮并将异氟醚的浓度调节至 1% 来维持麻醉。
      注意：麻醉后，通过强行抬起和捏住婴儿大鼠的脚趾和尾巴来评估麻醉深度。当脚趾和尾巴被抬起和捏住时没有反应，确认麻醉深度已达到。
  5. 用 75% 酒精对幼鼠颈部皮肤消毒 3 次，并在颈部皮肤上纵向切开 1 cm 切口，露出皮下组织。
    注意：颈部皮肤的纵向切口不会导致皮肤缺陷。
  6. 在解剖显微镜下切开左颈部的皮肤，用眼镊钝将胸骨舌骨肌和左胸骨突肌钝分开。
    1. 找到左颈总动脉和迷走神经，将左颈总动脉和迷走神经分开。
    2. 在 Model 组中，用电凝血笔切断左颈总动脉。清洁并缝合颈部切口。
    3. 在 Sham 组中，将左颈总动脉与迷走神经分开。
  7. 手术后，将幼鼠置于俯卧位的恒温水浴中复苏 1 h。
    注意：自然恢复后，四肢和全身的肤色都红润了。幼鼠可以自主移动四肢并独立爬行。
  8. 将对照组和治疗组的复苏大鼠置于37°C的密闭培养箱中，俯卧位。引入 5% 氧气和 95% 氮气的混合物以诱导缺氧，并在 2 小时后取出大鼠。
  9. 从缺氧箱中取出完成缺氧过程的幼鼠，将其置于大气氧含量正常的箱中，以俯卧位放置。将它们置于 37 °C 恒温水浴中 1 小时。完全恢复后，将幼鼠转移回母体的笼子里。
    注意：自然恢复后，四肢和全身的肤色都是红色的。幼鼠可以自主移动四肢，并且可以独立爬行。
  10. 将 Sham 组的幼鼠置于一个大气氧含量正常的盒子中，并将盒子置于 37 °C 恒温水浴中 1 h。完全恢复后，将幼鼠放回母笼内喂养。
    注意：自然恢复后，四肢和全身的肤色都是红色的。幼鼠可以自主移动四肢，并且可以独立爬行。整个作过程在云南中医药大学SPF动物房的专项手术室完成。在复苏和缺氧过程中，作者时刻观察幼鼠，防止因姿势不当造成死亡。哺乳期雌性大鼠用无特定病原体 （SPF） 育种饲料喂养，当幼崽能够自行喂养时，幼崽断奶（出生后第 21 天）并喂食 SPF 维持饲料。

2. 扶正反射实验

  1. 在出生后的第 4 天（建模后的第2 天）， 进行扶正反射实验以验证模型是否成功（图 1 和 表 1）。
    1. 抬起幼鼠的尾巴，将其背部靠在水平板上，用拇指和食指固定其腹部和颈部。检查大鼠是否能恢复到正常位置。由于扶正反射的丧失，大鼠无法从异常位置返回正常位置被记录为成功的模型16,22。
    2. 记录每组幼崽从仰卧位翻身到俯卧位所需的时间。开始记录仰卧位时拇指和食指同时松开的时间，让幼鼠转为俯卧位，当前后爪放在地板上时停止记录。如果幼鼠超过 20 s 无法恢复到正常位置，则记录扶正时间为 20 s。

3. 手术前的准备

  1. 造模后，将脑瘫幼鼠与母亲分开，带入室温恒定为 22-26 °C 的手术室 2 min，以适应周围环境。
  2. 戴上一次性手套，以保持手掌温和柔软，并保持温度在 36-37 °C 之间。
  3. 将大鼠轻轻放在左手掌心。弯曲左手拇指遮住大鼠的眼睛 2 min，形成黑暗的视野，使大鼠适应作者手掌的环境。使用右手食指和中指进行作。
    注意：遮住幼鼠的眼睛会形成一个黑暗的环境。这将防止幼鼠因为不安全和不确定的环境影响实验结果而变得烦躁。

4. 将大鼠分为对照组和治疗组

  1. 造模后第二天 （P5），通过扶正反射试验验证模型，并将幼鼠随机分为对照组和治疗组。对治疗组的幼鼠进行选择性脊柱作。
  2. 将幼鼠置于俯卧位。确保脊柱始终保持笔直（图 2A）。
  3. 用揉搓法按摩脊柱和脊柱两侧 1 分钟，然后用按压揉捏法对脊柱和脊柱两侧的肌肉按摩 5 分钟。
    1. 用揉搓法按摩两侧的脊椎和皮肤，使幼鼠放松，充分缓解其紧张。确保揉搓频率为 100-120 次/分钟，持续 1 min，待幼鼠安静无激动后。
      1. 以右手食指、中指、无名指为接触面，在颈椎、胸椎、腰椎表面皮肤上从头到尾做圆周摩擦运动，不打扰皮下组织。
      2. 以右手食指、中指、无名指为接触面，按动物解剖学标准23 从头到尾依次在斜方肌、臀浅肌、颈斜肌、胸菱形肌、背阔肌、外斜肌的皮肤表面做圆周运动。
    2. 先按压揉捏脊柱 5 min，然后按压揉捏脊柱两侧肌肉 5 min。
      1. 以 120 次/分钟的频率将揉捏方法应用于脊柱，持续 5 分钟。使用右手食指或中指作为接触面。从头到尾，对颈椎、胸椎和腰椎的表面皮肤进行圆周揉捏，结合向下按压 （1.77 ± 0.54 N）。确保力到达颈椎、胸椎、腰椎和棘上韧带。
      2. 以 120 次/分钟的频率将按压和揉捏方法应用于脊柱两侧的肌肉，持续 5 分钟。使用右手食指或中指作为接触面。根据动物解剖学标准23，以 1.77 ± 0.54 N 的力，以 1.77 0.54 N 的力，以圆揉运动向下压斜方肌、臀浅肌、菱形颈、菱形颈、菱形胸大肌、斜腹肌的皮肤表面、 背阔肌和腹外斜肌（图 2B）23。
  4. 以 100-120 次/分钟的频率按压揉捏敏感的脊髓穴位（如甘书、心书、辟书、神书、飞书24 次），持续 2 分钟。以右手食指或中指为接触面，对脑瘫幼大鼠局部穴位（如甘舒、心舒、皮舒、申舒、飞舒）的表面皮肤进行圆周揉捏和向下按压（1.77 ± 0.54 N）。
    注：根据中国针灸学会实验针灸研究分会制定的《动物穴位图》选择穴位（图 3）25。
  5. 通过扭转法以 25 次/分钟的频率局部刺激患肢，持续 1 分钟。
    1. 用右手拇指和食指捏住脑瘫幼鼠的患肢，对称地对两根手指施加力。确保力度轻柔，动作轻柔。来回摩擦婴儿大鼠右桡侧腕伸肌、趾总伸肌、尺侧腕伸肌、指骨、指间关节、腓肠肌、半腱肌、跖骨、跖骨间关节。
  6. 以 100-120 次/分钟的频率将摩擦方法涂抹在大脑后部的前额中线，持续 1 分钟。用右手食指作为接触面，在从幼鼠前额到后脑中部的一条假想线上（即百惠、风福、大嘴的一条线）上用揉搓法（图 3）。
    注意：按摩主要应用于皮肤。它是脑瘫幼鼠头部皮肤表面的圆周运动。它不需要驱动脑瘫幼鼠的皮下肌肉运动。
  7. 在程序结束时，将幼鼠单独放置 30 分钟，然后将其放回母鼠笼中。
    注意：随着年龄的增长，幼鼠的毛发会变粗，因此在按摩作过程中必须去除所有幼鼠组的背毛，以免影响实验效果。

5. 检测局部穴位的温度

  1. 使用红外热像仪检测手术前后局部穴位区域的温度。
    1. 选择性脊柱按摩前，用数据线将手机的Type-C接口与红外成像仪的USB接口连接，打开 电源键。
    2. 点击 分析 进入软件的手机终端，选择 照片 进入拍照模式，点击 画 中画 模式 右下角。
    3. 将相机对准幼鼠背部的大醉、心舒和神舒穴穴位（图 3）的穴位区域，拍摄温度照片。点击 图片 完成图像捕获并 保存 为 JPG 格式。
    4. 使用数据线连接计算机，并将保存的图像上传到安装了 Fotric 软件的计算机进行分析。
      1. 在 PC 上打开 Fotric 软件，打开 本地文件，找到图像的位置。
      2. 选择 Thermogram 工作区，选择要分析的图像，然后进入分析界面。
      3. 在 Analysis （分析） 屏幕上，选择右侧 Thermal image （热图像） 框中的图片，然后打开 Lock （锁）。
      4. 选择 缩放功能，调整 热图像 和左侧框的大小 背景图像 重合，然后关闭 锁 在右侧。
      5. 在顶部的工具栏中找到 Set measurement 矩形 ，并在图中标记需要检测的穴位。
      6. 单击右侧的 Report 以记录温度值。

6. 检测脑瘫幼鼠的运动平衡功能

  1. 使用行为旋转测试19 检测假手术组、对照组和治疗组大鼠在出生后第 61 天的运动功能。
    1. 参数设置：启动电源开关，选择 做实验 进入下一步，选择 阳性、大鼠、定时 5 分钟 进入下一步，选择 Acc 时间：10s，速度：10rpm。
    2. 然后，将老鼠放在跑道上，并在它们站稳后单击 Run 开始测试。将每次运行的运行状态调整为 ON。训练每只大鼠一次 5 分钟，然后开始执行 3 次测试。
    3. 训练结束后，将幼鼠放在旋转跑道上。稳定后，单击 Run，将 Running 状态调整为 ON。5 分钟结束时，选择 Date（日期 ），记录每只大鼠第一次从旋转跑道上坠落的时间和速度，即 Run time （运行时间） 数据。
  2. 使用足部故障测试20,21 评估假手术组、对照组和治疗组在出生后第 61 天右前肢的平衡运动功能。
    1. 将幼鼠放在水平梯子的起点，并录制它们穿过梯子到另一端的视频（100 厘米长，每个梯子之间的距离为 2 厘米）。一次训练后，每只大鼠以 5 分钟的间隔进行三次正式测试。
    2. 当动物越过梯子时，使用低速回放观察右前肢进行评分，如评分标准所示（表 2）。

7. 蛋白质印迹

  1. 如前所述对组织样品进行蛋白质印迹分析26。
    注：裂解物的量根据组织块的大小确定。使用的抗体如下：一抗生长激素抗体（0.5 μg [0.5 ng/泳道]）;抗生长激素受体抗体 （1/1000）;用于一抗的内部参比抗 β 肌动蛋白抗体 （1/2000）;山羊抗兔 IgG H&L （HRP） （1/10000） 用于二抗。

8. 检测手的力度

  1. 佩戴用于检测按摩手上作力的装置。将用于按摩幼鼠的手指与设备的传感器芯片贴合，然后打开 电源 按钮。
  2. 将存放手动测试仪软件的硬盘接口连接到电脑，在 URL 输入框中输入手动测试仪的专用 IP 地址。
  3. 在电脑上安装 SpringVR 客户端，点击进入采集界面，选择右下角的 Finger Pattern 来测试作力度。
  4. 选择 压力 选项，然后单击 开始 开始记录作员在作过程中的手动力。该软件将自动记录作的强度，并在本地磁盘上生成一个数据表，其中将找到文件名为 PressureSensor 的数据。

9. 数据统计

注：SPSS26.0 软件用于统计分析，Graphpad Prism9.0.0 用于条形图制作，Image J 用于蛋白质条带的灰度值分析。

  1. 分析所有数据并将其显示为平均值±标准差 （Mean ± SD）。
    注：检验标准为 α = 0.05，P ≤ 0.05 被认为具有统计学意义。 之所以采用 Fisher 检验，是因为数据是通过方差和正态性分析进行分析的，并且符合正态分布特征和方差同质性。

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结果

选择性脊柱推拿可促进脑瘫婴儿大鼠的体重增加。
在治疗期间，在出生后第 3 、 14 、 28 、 42 和 61 天测量体重 （图 4， 表 3）。出生后第3天，假手术组体重为5.53 ± 0.035 g，对照组体重为3.15 ± 0.43 g。治疗组体重为 4.42 ± 0.13 g，与造模前假法组和对照组无显著差异。

出生后第14天，假手术组体重为35.97...

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讨论

由于缺血和缺氧是脑瘫的重要致病因素，因此将国际公认的建立脑瘫模型的方法与缺氧相结合，制备脑瘫模型 16,28,29,30。当脑瘫发展时，它会导致整体发育迟缓，包括体重和运动功能，这可能与生长激素分泌水平有关31。选择性脊柱推拿用于治疗患有脑瘫的?...

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披露声明

作者在这项工作中没有竞争性的财务或其他利益冲突。

致谢

这项工作得到了国家自然科学基金面上项目（82374614）、云南省科技厅生物医学重大项目（202102AA100016）、云南省科学技术厅应用基础研究联合重大项目——云南中医药大学（201901AI070004）的支持。 云南省高等院校针灸推拿防治脑病重点实验室（2019YGZ04），云南省科学技术厅-云南省基础研究计划青年项目（202101AU070002），云南省教育厅科学研究基金研究生项目（2023Y0433）;云南省教育厅科研基金， （2023Y0462）.

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well platesBeijing Lanjieke Biotechnology Co., LTD11510Determination of protein concentration
Anti-beta Actin antibodyAbacmAb8227Dilution: 1/2000
Anti-Growth Hormone antibodyAbacmAb1268820.5 µg (0.5 ng/lane)
Anti-Growth Hormone receptor antibodyAbacmAb202964Dilution: 1/1000
Basic operating microscopeShanghai YuYAN Scientific Instrument Co. LTDSM-101The common carotid artery was isolated under microscope during modeling
BCA developerBiyuntian Biological Engineering Co., LTDP0010Determination of protein concentration
Chemiluminescence imaging systemShanghai Qinxiang Scientific Instrument Co., LTD100240073Protein banding imaging
Direct-load Color Prestained MarkerBeijing Kangrunchengye Biotechnology Co., LTD (GenStar)M221Western Blot
DK-30Automatic snow ice makerHenan Brothers instrument equipment Co., LTDSHDX0023Ice-making
ECL luminescent substrate kitBeijing Lanjieke Biotechnology Co., LTDBL520BConvert latent images in exposed film into visible images
Electric-heated thermostatic water bathTAISITE INSTRUMENTDK-98-IIThe young rats were resuscitated after modeling
Electronic scalesKunshan YoukeWEI ELECTRONIC Technology Co. LTDCN-LQC10002The body weight of the young rats was measured
German small white electric coagulation pen hemostatHaohangL55×W125×H37It was used to coagulate the left common carotid artery
GloveJiangsu YANGzi LiDE Medical Device Co. LTDQ/320684 YZYL001-2017For massage operation
GlycineBeijing Soleibao Technology Co., Ltd.Cat#G8200Electrophoretic solution, Configure the transfer fluid
Goat Anti-RabbitIgG H&L (HRP) AbacmAb6721Dilution: 1/10000
Intelligent laboratory ultra-pure water machineChongqing huachuag water treatment engineering co.,LTDN/AFiltration (15 L)
IsofluraneShandong Ante Animal Husbandry Technology Co. LTD15198Anesthesia was maintained by induction in young rats
LinkIRFOTIRCV1.3.2.134Infrared image analysis software
Low temperature high speed tissue grinderWuhan Servicebio technology CO.,LTDSKZ3F20200191Tissue grinding
MethanolGuangdong Guanghua Sci-Tech Co., Ltd20220519Configure the transfer fluid
Mini-PROTEAN TetraBole Life Medical Products (Shanghai) Co., Ltd552BR 233193Electrophoresis
Multiskan Spectrum Microplate SpectrophotometerTECANSparkThe absorbance and concentration of tissue protein were detected
Pressure-sensing smart glovesJinan Super Sense Intelligent Technology Co. LTDMiigloveIt is used to measure the manipulative strength of the operator
PVDF membraneMerckMillipore Corporation IPVH00010 Western Blot
Refrigerated centrifugeHettich Precision Technology (Zhuhai) Co., LTDMIKRO 220RCentrifuge
Research three-in-one thermal imagerFOTIRC226S (384 x 288)Temperature measurement
RIPA lysateBeijing Solaibao Technology Co., LTD (Solarbio)R0010Lytic tissue
SHA-CA digital display water bath thermostatic oscillatorChangzhou Aohua Instrument Co. LTDSHA-CAYoung rats were used in hypoxia
Six-rat fatigue rotarod apparatusShanghai Duoyi Industry Co., LTDDO01104RT703CP motor function was detected
Skim milk powderGuangzhou Saiguo Biotechnology Co., LTD (BIOFROXX)1172GR500Confining liquid
SPF breeding feedSPF(Beijing)biotechnology co.,Ltd.A1EC30005A1S4285266Lactating female rats were fed
SPF maintenance feedSPF(Beijing)biotechnology co.,Ltd.A1EC30005A1S4285267The pups were fed after weaning
Surgical plateShanghai YuYAN Scientific Instrument Co. LTD51002The model operating table was established in young rats
TS-200 Orbital shakerHaimen Qilin Bell Manufacturing Co., Ltd.TS-8SGel fixation
Tween 80MedChemExpressHY-Y1819Configure TBST 
ZS-MV Portable anesthesia machineZHONGSHI SCIENCE &TECHNOLOGYZS-MV-IAnesthesia was induced and maintained in experimental animals

参考文献

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