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要約

この研究は、脳性麻痺の乳児ラットの成長と発達に対する選択的脊椎マニピュレーションの影響を示しており、特定の手順と標準化されたプロトコルを強調しています。プロトコルを評価するために、体重測定、ロタロッドテスト、足障害スコア、その他の行動テスト、および成長ホルモンの検出が行われました。

要約

概要

脳性麻痺(CP)は、胎児や乳児期の脳への非進行性の損傷によって引き起こされ、運動や姿勢の発達の異常1、体重増加の鈍化などの発達障害2,3,4、運動機能障害を特徴とする疾患群です。中国における脳性麻痺の発生率は2.48%で、有病率はそれぞれ2.46‰(1〜6歳)5です。外国の研究では、有病率は2.4%〜3.6%と報告されています6。脳性麻痺は、子供の身体的損傷や障害の主な原因であり、その中でもバランス障害や運動障害は日常生活活動に大きな影響を与えます1。脳性麻痺は、早産、感染症、遺伝学、新生児虚血および低酸素症、新生児黄疸、およびその他の複雑で多様な病原性因子によって引き起こされる可能性があります7。脳性麻痺の治療の目標は、身体機能と生活の質を改善することです8。現在、脳性麻痺の治療方法には、脳深部刺激療法9、ロボット支援歩行訓練10、手首・足首鍼治療11、マッサージ12と組み合わせた経絡鍼治療などがあります。

伝統的な中国医学(TCM)は、CP13,14の効果的な治療法としてますます使用されています。その一部として、マッサージも一定の役割を果たしています。例えば、選択的脊椎マニピュレーションは、DNAのヒドロキシメチル化の状態を調節して神経発達を調節し、学習および記憶機能を改善することができる15。脳性麻痺の乳児ラットの治療では、選択的な脊椎操作は、炎症性サイトカインTNF-αおよびIL-10遺伝子プロモーター領域16のメチル化レベルを調節することにより、皮質および海馬の炎症性恒常性を改善する可能性があり、脳性麻痺の乳児ラットのバランス能力において積極的な治療的役割を果たす可能性があります16。選択的脊椎マニピュレーションは、脳性麻痺の乳児ラットの認知機能を改善することができます17。選択的脊椎マニピュレーションは、脳性麻痺の乳児ラットの治療に使用され、その成長と発達にも治療効果があることが観察された18。

本研究の目的は、脳性麻痺児ラットの体重測定、ロタロッド試験19、足障害スコア20,21などの行動試験と成長ホルモンの検出を測定することにより、選択的脊椎マニピュレーションが脳性麻痺の乳児ラットの成長と発達に及ぼす影響を説明し、関係者に研究アイデアを提供することである。

プロトコル

この研究は、雲南省伝統中国医学大学の実験動物倫理委員会によって承認されました。動物に対するすべての実験操作は、実験動物の減少、最適化、および置換の3Rの原則に従っています(No.R-06202018)。この実験では、平均体重が250〜300 gの特定の病原体を含まない(SPF)グレードの健康なSprague Dawley(SD)ラット(雄14匹と雌7匹)を使用しました。ネズミは雲南省中医薬大学のSPF動物室で飼育されました、証明書番号:SYXK(雲南省)K2022-0004。すべてのラットは、室温22〜26°C、相対湿度40%〜50%の自然光制御環境下で、12時間の明暗サイクルの下で飼育されました。適応摂食の1週間後、オス/メスの比率は1:2に維持されました。1週間後、妊娠したラットは単一のケージに収容され、通常どおり給餌され、自由に食べたり飲んだりしました。自然分娩後、妊娠したラットから生まれた健康な仔ラットを選抜した。幼子ラットをSham群、対照群、および治療群に分けて、脳性麻痺の乳児ラットの成長と発達に対する選択的脊椎マニピュレーションの影響を観察しました。各グループから、6匹のオスの子犬が実験のために選ばれました。治療群は生後5日目から 選択的脊椎マニピュレーションによる治療を行い、6日間治療を行った後、1日間安静にしました。

1. 脳性麻痺モデルの確立

  1. 手術に必要な顕微鏡、眼科用ハサミ、鉗子、縫合糸、手術用プレート、ハサミ、綿棒、手袋を滅菌し、手術室に置きます。
  2. 生後3日目に子犬を一時的に母親から引き離し、1つのフレームに入れて、無菌手術室に運びます。
  3. 体重を測定します。この研究では、体重が7〜9 gの範囲の乳児ラットを含め、体重に適合しなかったラットを除外します。.子ラットを偽、対照、および治療グループにランダムに分けます。
  4. イソフルランを2%の濃度で麻酔し、小動物用吸入ガス麻酔器を使用して麻酔を1%に維持します。
    注:この実験は主に、脳性麻痺の乳児ラットの成長と発達に対する選択的脊椎マニピュレーションの影響を観察するためのものです。麻酔は、モデリングプロセス中の一般的な要件に従って実施されており、追加の鎮痛が観察結果に影響を与えます。
    1. 小動物用ガス麻酔薬を電源に接続し、インダクションボックスに接続されたバルブを開きます。
    2. 幼子ラットを誘導ボックスに入れ、濃度調整ノブを回し、イソフルランの濃度を2%に調整して麻酔を誘発します。
    3. 子ネズミが意識を失ったら、誘導ボックスから取り出します。それを操作プレートに置き、麻酔器のチャネル1を閉じます。
    4. 子ネズミを仰臥位に置きます。麻酔を維持するために麻酔吸入マスクを固定します。
    5. 麻酔吸入マスクに接続されているチャネルを開きます。濃度調整つまみを回し、イソフルランの濃度を1%に調整して麻酔を維持します。
      注:麻酔後、乳ラットのつま先と尾を強制的に持ち上げてつまむことにより、麻酔薬の深さを評価します。つま先と尻尾を持ち上げて挟んだときに反応がなかったら、麻酔の深さに達したことが確認されます。
  5. 幼子ラットの首の皮膚を75%アルコールで3回消毒し、首の皮膚を縦に1cm切開して皮下組織を露出させます。
    注:首の皮膚の縦方向の切開は、皮膚の欠陥を引き起こしません。
  6. 解剖顕微鏡で左首の皮膚を切断し、眼科用ピンセットを使用して胸骨舌骨筋と左胸骨乳様突起筋を鈍く分離します。
    1. 左総頸動脈と迷走神経を見つけ、左総頸動脈と迷走神経を分離します。
    2. モデルグループでは、電気凝固ペンで左総頸動脈を切除します。首の切開部をきれいにして縫合します。
    3. 偽のグループでは、左総頸動脈を迷走神経から分離します。
  7. 手術後、子ラットをサーモスタットウォーターバスに腹臥位にして1時間蘇生させます。
    注:自然回復後、手足と全身の肌の色は赤みがかった。子ネズミは、手足を自律的に動かし、独立して這うことができました。
  8. 対照群と治療群の蘇生ラットを、腹臥位で37°Cの密閉インキュベーターに入れます。5%の酸素と95%の窒素ガスの混合物を導入して低酸素症を誘発し、2時間後にラットを取り除きます。
  9. 低酸素プロセスを完了した幼子ラットを低酸素ボックスから取り出し、通常の大気酸素含有量のボックス内の腹臥位に置きます。.それらを37°Cのサーモスタットウォーターバスに1時間置きます。完全に回復した後、子ラットを母親のケージに戻します。.
    注:自然回復後、手足と全身の肌の色が赤くなっていました。子ネズミは、手足を自律的に動かし、独立して這うことができました。
  10. シャムグループの幼子ラットを通常の大気中の酸素含有量の1つの箱に入れ、箱を37°Cのサーモスタット水浴に1時間置きます。完全に回復した後、子ラットを母親のケージに戻して給餌します。
    注:自然回復後、手足と全身の肌の色が赤くなっていました。子ネズミは、手足を自律的に動かし、独立して這うことができました。すべての手術プロセスは、雲南省伝統中国医学大学のSPF動物室の特別手術室で完了しました。蘇生中および低酸素状態の間、オペレーターは常に子ラットを観察し、不適切な姿勢による死亡を防ぎます。授乳中の雌ラットにSPF(Specific Pathogen Free)繁殖飼料を与え、自給自足が可能になったら離乳させ(生後21日目)、SPF維持飼料を給餌した。

2. 直立反射実験

  1. 生後4日目( モデリング後2日目) に、モデルが成功したかどうかを確認するために、直立反射実験を行います(図1 、 表1)。
    1. 子ネズミの尻尾を持ち上げ、背中を水平な板に乗せ、親指と人差し指で腹と首を固定します。ラットが通常の位置に戻ることができるかどうかを確認します。ラットが立ち直反射の喪失により異常な位置から正常な位置に戻ることができなくなったことは、成功したモデルとして記録されています16,22。
    2. 子犬の各グループが仰臥位から腹臥位に寝返りするのにかかる時間を記録します。親指と人差し指が仰臥位で同時に解放された時間を記録し始め、子ラットが腹臥位に向きを変えるのを許し、前足と後足が床に置かれたときに記録を停止します。子ラットが20秒以上正常な位置に戻らなかった場合は、立ち直り時間を20秒として記録します。

3. 手術前の準備

  1. モデリング後、脳性麻痺の子ラットを母親から分離し、室温22〜26°Cの一定の手術室に2分間連れて行き、周囲の環境に適応します。
  2. 手のひらを穏やかで柔らかく、温度を36〜37°Cに保つために、使い捨ての手袋を着用してください。
  3. ラットを左手の手のひらにそっと置きます。左手の親指を曲げてラットの目を2分間覆い、暗い視野を形成して、ラットがオペレーターの手のひらの環境に適応できるようにします。右の人差し指と中指を使用して操作します。
    注意: 赤ちゃんのネズミの目を覆うと、暗い環境を作り出すことができます。これにより、実験結果に影響を与える安全で不確実な環境のために、子ラットが興奮するのを防ぐことができます。

4. ラットを対照群と治療群に分ける

  1. モデリング(P5)後2日目に、直立反射テストでモデルを検証し、子ラットを無作為に対照群と治療群に分けます。治療群の乳児ラットに対して選択的脊椎マニピュレーションを行います。
  2. 子ラットを腹臥位に置きます。背骨が常にまっすぐなレベルに保たれていることを確認してください(図2A)。
  3. 背骨と背骨の両側をこすりながら1分間マッサージし、背骨と背骨の両側の筋肉に押して揉みしだくの方法で5分間マッサージします。
    1. こすりの方法を使用して両側の背骨と皮膚をマッサージし、子ラットをリラックスさせ、その緊張を完全にほぐします。こすりの頻度が、乳子ラットが静かで動揺しないで1分間100〜120回/分であることを確認してください。
      1. 右手の人差し指、中指、薬指を接触面とし、皮下組織を乱さずに、頭から尻尾まで頸椎、胸椎、腰椎の表面皮膚を円を描くようにこすります。
      2. 右手の人差し指、中指、薬指を接触面として、僧帽筋、表在性大臀筋、頸部ロンボイド筋、胸筋、広背筋、外斜筋の皮膚表面を動物解剖学的基準23に従って、皮下組織を乱すことなく、頭から尾まで順に円運動を行います。
    2. 最初に脊柱を5分間押してこねて治療し、次に脊椎の両側の筋肉を5分間押してこねます。
      1. 揉みほうを脊椎に120回/分の頻度で5分間塗布します。右の人差し指または中指を接触面として使用します。頭から尾にかけて、頸椎、胸椎、腰椎の表面皮膚に円状に揉み込み、下向きのプレス(1.77 ± 0.54 N)と組み合わせて行います。力が頸椎、胸椎、腰椎、棘上靭帯に到達することを確認します。
      2. 脊椎の両側の筋肉にプレスとニーディングの方法を120回/分の頻度で5分間適用します。右手の人差し指または中指を接触面として使用します。動物の解剖学的基準23に従って、僧帽筋、表在性臀筋、菱形頸部、菱形胸筋、広背筋、および外斜腹筋の皮膚表面を、頭から尾まで丸く混練運動で、1.77±0.54Nの力で押し下げ、力が僧帽筋、表在性臀筋、菱形頸部、菱形胸筋、 広背筋、および外斜め腹筋(図2B)23。
  4. 敏感な脊椎のツボ(甘洲、新洲、桃朱、神舟、飛楚24など)を100〜120回/分の頻度で2分間押してこねます。右の人差し指または中指を接触面として使用して、脳性麻痺の幼児ラットの局所的なツボ(Ganshu、Xinshu、Pishu、Shenshu、Feishuなど)の表面皮膚に円形の揉み込みと下向きのプレス(1.77 ± 0.54 N)を行います。
    注:ツボは、中国鍼灸学会実験鍼研究支部が策定した「動物鍼灸ポイントマップ」に従って選択されました(図3)25。
  5. 捻転法により患肢を25回/分の頻度で1分間局所的に刺激します。
    1. 右手の親指と人差し指で、脳性麻痺の子ラットの患肢をつまみ、2本の指に対称的な力を加えます。力が穏やかで、アクションが軽くて穏やかであることを確認してください。乳児ラットの右橈骨伸筋、指伸筋共通、尺骨伸筋、指節骨、指節間関節、腓腹筋、半腱様筋、中足骨、中足骨、中足骨を前後にこすります。
  6. 額の正中線から脳の奥まで、100〜120回/分の頻度で1分間、こすり合わせる方法を適用します。右手の人差し指を接触面として使用し、子ラットの額から後脳の中央までの仮想線(つまり、白慧、鳳凰、大熊の1本の線)にこすり合わせる方法を使用します(図3)。
    注:マッサージは主に皮膚に適用されます。これは、脳性麻痺の乳児ラットの頭の皮膚表面上の円運動です。脳性麻痺の乳児ラットの皮下筋運動を駆動する必要はありません。
  7. 手順の最後に、子ラットを30分間放置してから、母ラットケージに戻します。.
    注:年齢とともに、幼子ラットの毛は太くなるため、実験効果に影響を与えないように、マッサージ操作中にすべてのグループの乳児ラットの後ろ毛を取り除く必要があります。

5. 局所的なツボの温度を検出する

  1. 赤外線サーマルイメージャーを使用して、手術前後の局所的なツボ領域の温度を検出します。
    1. 選択的脊椎マッサージの前に、携帯電話のType-Cインターフェースを赤外線イメージングデバイスのUSBインターフェースとデータケーブルで接続し、 電源ボタンをオンにします。
    2. [ 分析] をクリックしてソフトウェアの携帯電話端末に入り、[ 写真 ]を選択して写真モードに入り、[ 画像]をクリックします 画像 モード 右下隅にあります。
    3. 子ラットの背中にあるDazhui、Xinshu、Shenshuのツボ(図3)のツボにカメラの焦点を合わせて、温度を撮影します。[ 写真] をクリックして画像のキャプチャを完了し、JPG形式で 保存 します。
    4. コンピューターをデータケーブルで接続し、保存した画像をFotricソフトウェアがインストールされているコンピューターにアップロードして分析します。
      1. PCでFotricソフトウェアを開き、 ローカルファイルを開いて、画像の場所を見つけます。
      2. サーモグラムワークスペースを選択し、分析する画像を選択して、分析インターフェイスに入ります。
      3. [分析] 画面で、右側の [熱画像] ボックスで画像を選択し、[ロック] を開きます。
      4. ズーム 機能を選択し、 サーマル画像 と左側のボックス の背景画像 のサイズを一致させるように調整し、右側の ロック をオフにします。
      5. 上部のツールバーで 「測定の設定」 長方形を見つけ、図で検出するツボをマークします。
      6. 右側の 「レポート 」をクリックして、温度値を記録します。

6. 脳性麻痺児ラットの運動バランス機能の検出

  1. 行動ロタロッドテスト19 を使用して、生後61日目 にSham、Control、およびTreatmentグループのラットの運動機能を検出します。
    1. パラメータ設定:電源スイッチを始動し、 実験を行う を選択して次のステップに入り、 ポジティブ、ラット、タイミング5分 を選択して次のステップに入り、 Acc時間:10秒、速度:10rpmを選択します。
    2. 次に、ラットをランニングトラックに置き、ラットがしっかりと立ったら [実行 ]をクリックしてテストを開始します。各実行の実行状態を [オン] に調整します。各ラットを5分間1回訓練し、その後、テストを3回開始します。
    3. トレーニング後、子ラットを回転軌道に置きます。安定したら、[ 実行] をクリックし、実行状態を [オン] に調整します。5分が経過したら、[ 日付 ]を選択して、各ラットが回転軌道から初めて落下した時間と速度、つまり実行時間データを記録します。
  2. フットフォールトテスト20,21を使用して、生後61日目のシャム、コントロール、および治療グループの右前肢のバランス運動機能を評価します。
    1. 子ネズミを水平はしごの始点に置き、もう一方の端(長さ100 cm、各はしご間の距離は2 cm)に渡るビデオを記録します。1回のトレーニングセッションの後、5分間隔で各ラットに対して正式なテストを3回実行します。
    2. 採点基準(表2)に示すように、動物が低速再生で梯子を横切るときには、右前肢を観察して得点を採点する。

7. ウェスタンブロッティング

  1. 前述したように組織サンプルのウェスタンブロッティング分析を行う26。
    注:ライセートの量は、組織ブロックのサイズに応じて決定されました。使用した抗体は以下の通りでした:一次抗成長ホルモン抗体(0.5 μg [0.5 ng/lane]);抗成長ホルモン受容体抗体(1/1000);一次抗体用の内部参照抗βアクチン抗体(1/2000);ヤギ抗ウサギIgG H&L (HRP) (1/10000) 二次抗体用。

8. 手の強さの検出

  1. マッサージに使用する手の操作力を検出するためのデバイスを着用してください。乳児ラットのマッサージに使用する指をデバイスのセンサーチップに合わせ、 電源 ボタンをオンにします。
  2. マニュアルテスターソフトウェアを保存するハードディスクインターフェースをコンピューターに接続し、 URL 入力ボックスにマニュアルテスターの専用IPアドレスを入力します。
  3. SpringVRクライアントをコンピューターにインストールし、クリックして収集インターフェイスに入り、右下隅にあるフィンガーパターンを選択して操作力をテストします。
  4. 「圧力」オプションを選択し、「開始」をクリックして、操作中のオペレーターの手動力の記録を開始します。ソフトウェアは、操作の強度を自動的に記録し、ファイル名PressureSensorのデータが検索されるローカルディスク上のデータテーブルを生成します。

9. データ統計

注:統計解析にはSPSS26.0ソフトウェアを、棒グラフの作成にはGraphpad Prism9.0.0を、タンパク質バンドのグレー値解析にはImage Jを使用しました。

  1. すべてのデータを平均±標準偏差(平均±SD)として分析し、表示します。
    注:テスト標準はα = 0.05であり、 P ≤ 0.05は統計的に有意であると考えられました。フィッシャーの検定を使用したのは、データが分散と正規性の分析によって分析され、正規分布特性と分散の均一性に適合していたためです。

結果

選択的脊椎マニピュレーションは、脳性麻痺の乳児ラットの体重増加を促進することができます。
治療中、生後3日目、14日目、28日目、42日目、61日目に体重を測定しました(図4、 表3)。生後3日目の体重は、偽群が5.53g±0.035g、対照群の体重が3.15g±0.43gでした。治療群の体重は4.42g±0.13gで、モデル化前の偽群および対照...

ディスカッション

虚血と低酸素症は脳性麻痺の重要な病原性因子であるため、国際的に認められた脳性麻痺モデルを確立する方法は、低酸素症と組み合わせて脳性麻痺モデル16,28,29,30を準備します。脳性麻痺が発症すると、体重や運動機能を含む全体的な発達遅延を引き起こし、これは成?...

開示事項

著者は、この作品の下で競合する金銭的またはその他の利益相反はありません。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学基金会(82374614)、雲南省科学技術部の主要生物医学プロジェクト(202102AA100016)、雲南省科学技術部応用基礎研究共同プロジェクト-雲南伝統中国医学大学(201901AI070004)、 雲南省の大学における脳症の予防と治療のための鍼治療、灸、マッサージの主要研究室の支援(2019YGZ04)、雲南省科学技術部-雲南省基礎研究プログラムの青年プロジェクト(202101AU070002)、雲南省教育学部科学研究基金大学院プログラム(2023Y0433);雲南省教育局科学研究財団、(2023Y0462)。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well platesBeijing Lanjieke Biotechnology Co., LTD11510Determination of protein concentration
Anti-beta Actin antibodyAbacmAb8227Dilution: 1/2000
Anti-Growth Hormone antibodyAbacmAb1268820.5 µg (0.5 ng/lane)
Anti-Growth Hormone receptor antibodyAbacmAb202964Dilution: 1/1000
Basic operating microscopeShanghai YuYAN Scientific Instrument Co. LTDSM-101The common carotid artery was isolated under microscope during modeling
BCA developerBiyuntian Biological Engineering Co., LTDP0010Determination of protein concentration
Chemiluminescence imaging systemShanghai Qinxiang Scientific Instrument Co., LTD100240073Protein banding imaging
Direct-load Color Prestained MarkerBeijing Kangrunchengye Biotechnology Co., LTD (GenStar)M221Western Blot
DK-30Automatic snow ice makerHenan Brothers instrument equipment Co., LTDSHDX0023Ice-making
ECL luminescent substrate kitBeijing Lanjieke Biotechnology Co., LTDBL520BConvert latent images in exposed film into visible images
Electric-heated thermostatic water bathTAISITE INSTRUMENTDK-98-IIThe young rats were resuscitated after modeling
Electronic scalesKunshan YoukeWEI ELECTRONIC Technology Co. LTDCN-LQC10002The body weight of the young rats was measured
German small white electric coagulation pen hemostatHaohangL55×W125×H37It was used to coagulate the left common carotid artery
GloveJiangsu YANGzi LiDE Medical Device Co. LTDQ/320684 YZYL001-2017For massage operation
GlycineBeijing Soleibao Technology Co., Ltd.Cat#G8200Electrophoretic solution, Configure the transfer fluid
Goat Anti-RabbitIgG H&L (HRP) AbacmAb6721Dilution: 1/10000
Intelligent laboratory ultra-pure water machineChongqing huachuag water treatment engineering co.,LTDN/AFiltration (15 L)
IsofluraneShandong Ante Animal Husbandry Technology Co. LTD15198Anesthesia was maintained by induction in young rats
LinkIRFOTIRCV1.3.2.134Infrared image analysis software
Low temperature high speed tissue grinderWuhan Servicebio technology CO.,LTDSKZ3F20200191Tissue grinding
MethanolGuangdong Guanghua Sci-Tech Co., Ltd20220519Configure the transfer fluid
Mini-PROTEAN TetraBole Life Medical Products (Shanghai) Co., Ltd552BR 233193Electrophoresis
Multiskan Spectrum Microplate SpectrophotometerTECANSparkThe absorbance and concentration of tissue protein were detected
Pressure-sensing smart glovesJinan Super Sense Intelligent Technology Co. LTDMiigloveIt is used to measure the manipulative strength of the operator
PVDF membraneMerckMillipore Corporation IPVH00010 Western Blot
Refrigerated centrifugeHettich Precision Technology (Zhuhai) Co., LTDMIKRO 220RCentrifuge
Research three-in-one thermal imagerFOTIRC226S (384 x 288)Temperature measurement
RIPA lysateBeijing Solaibao Technology Co., LTD (Solarbio)R0010Lytic tissue
SHA-CA digital display water bath thermostatic oscillatorChangzhou Aohua Instrument Co. LTDSHA-CAYoung rats were used in hypoxia
Six-rat fatigue rotarod apparatusShanghai Duoyi Industry Co., LTDDO01104RT703CP motor function was detected
Skim milk powderGuangzhou Saiguo Biotechnology Co., LTD (BIOFROXX)1172GR500Confining liquid
SPF breeding feedSPF(Beijing)biotechnology co.,Ltd.A1EC30005A1S4285266Lactating female rats were fed
SPF maintenance feedSPF(Beijing)biotechnology co.,Ltd.A1EC30005A1S4285267The pups were fed after weaning
Surgical plateShanghai YuYAN Scientific Instrument Co. LTD51002The model operating table was established in young rats
TS-200 Orbital shakerHaimen Qilin Bell Manufacturing Co., Ltd.TS-8SGel fixation
Tween 80MedChemExpressHY-Y1819Configure TBST 
ZS-MV Portable anesthesia machineZHONGSHI SCIENCE &TECHNOLOGYZS-MV-IAnesthesia was induced and maintained in experimental animals

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