缝合扩张小鼠模型中骨重塑的 3D 可视化技术

摘要

该协议提出了一个标准化的缝合扩张小鼠模型和3-D可视化方法，以研究拉伸力载荷下缝合线和骨重塑的机械生物学变化。

摘要

颅面缝合线除了是连接颅面骨的纤维关节外，还起着至关重要的作用;它们也是颅骨和面部骨骼生长的主要生态位，容纳间充质干细胞和骨祖细胞。由于大多数颅面骨是通过膜内骨化发育的，因此缝合线的边缘区域充当起始点。由于这一重要性，这些缝合线已成为骨科治疗中有趣的靶标，如弹簧辅助颅穹窿扩张、上颌骨快速扩张和上颌骨牵伸。在骨科示踪力的作用下，缝合干细胞被迅速激活，成为扩增过程中骨重塑的动态来源。尽管它们很重要，但骨重塑期间的生理变化仍然知之甚少。传统的切片方法，主要是矢状方向，无法捕捉到整个缝合线中发生的全面变化。本研究建立了矢状缝扩张的标准小鼠模型。为了充分可视化缝合扩张后的骨重塑变化，PEGASOS组织清除方法与全安装EdU染色和钙螯合双标记相结合。这使得在扩张后在整个颅骨上看到高度增殖的细胞和新的骨形成。该协议提供了标准化的缝合扩张小鼠模型和3D可视化方法，揭示了拉伸力载荷下缝合和骨重塑的机械生物学变化。

引言

颅面缝合线是连接颅面骨的纤维组织，在颅面骨的生长和重塑中起着至关重要的作用。缝合线的结构类似于河流，提供细胞资源流来滋养和构建“河岸”，称为成骨前沿，通过膜内成骨促进颅面骨的形成¹。

对颅面缝合线的兴趣是由临床需求驱动的，即了解颅缝过早闭合和面部缝合功能障碍，这可能导致颅面畸形，甚至危及儿童生命的疾病。开放缝合切除术是临床治疗的常规应用，但长期随访显示一些患者再骨化复发不完全².微创开颅手术由扩张弹簧或内窥镜条纹颅骨切除术辅助，可能提供一种更安全的方法来保留潜在的缝合线，而不是丢弃组织³.同样，面罩和扩张器具等骨科疗法已被广泛用于治疗矢状或水平上颌骨发育不全，一些研究将年龄限制扩大到通过微型螺钉辅助腭扩张器治疗成年患者 ^4,5,6。此外，间充质干细胞 （MSCs） 结合可生物降解材料的颅缝再生是未来的潜在疗法，为相关疾病的治疗提供了新的方向⁷.然而，缝合线的功能过程或调节机制仍然难以捉摸。

研究方案

本文描述的所有实验程序均已获得上海交通大学医学院附属上海市第九人民医院动物护理委员会批准（SH9H-2023-A616-SB）。本研究使用4周龄的C57BL / 6雄性小鼠。所有使用的器械在手术前都经过消毒。

1. 缝合扩张模型的准备

1. 准备两个固定架。
   1. 使用 0.014 英寸澳焊丝或不锈钢丝（见 材料表）用轻线钳制作螺旋环。环的直径为2 mm，两侧保留1 mm的尾巴（图1A）。
   2. 在高压灭菌器、等离子灭菌器或合适的冷灭菌剂（例如戊二醛）中对手术用的电线和支架进行消毒。
2. 准备弹簧。
   1. 准备定制的不锈钢弹簧。
      注意：本研究使用线径为 0.2 mm、外径为 1.5 mm、间隔空间为 1 mm 且长度为 7 mm 的压力弹簧（图 1B）。每个 1 毫米的弹簧压缩获得约 30 g 的推力。
   2. 在设置之前将弹簧切成可用的长度。在实验前确认专用弹簧的力。
      注意：只要平行实验中的力大小相同，弹簧的大小就会变化。如果条件有限，则通过台式单轴测试仪器或小型电子测功机（见材料表）测量力。根据力的大小评估长度变化（

讨论

我们应用了标准的缝合扩张小鼠模型来观察在整个为期一个月的重塑周期¹⁰ 中每周发生的规律形态变化。该模型可用于通过扩大颅骨缝合线来研究颅骨重塑和再生，以及研究体内各种缝合细胞。为了充分展示此类研究的结果，需要对染色组织进行三维可视化。因此，PEGASOS技术以其清除硬组织的效率而闻名^19,20，与双重标记和EdU?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
37% Acid etching	Xihubiom	E10-02/1807011
Alizarin red	Sigma-Aldrich	A3882
AUSTRALIAN WIRE	A.J.WILCOCK	0.014''
Benzyl benzoate	Sigma-Aldrich	B6630
Calcein green	Sigma-Aldrich	C0875
Copper(II) sulfate, anhydrous	Sangon Biotech	A603008
Dynamometer	Sanliang	SF-10N
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
EdU	Invitrogen	E104152
Laser Confocal Microscope	Leica	SP8
PBS	Sangon Biotech	E607008
PEG-MMA 500	Sigma-Aldrich	447943
PFA	Sigma-Aldrich	P6148
pH Meters	Mettler Toledo	S220
Quadrol	Sigma-Aldrich	122262
Sodium Ascorbate	Sigma-Aldrich	A4034
Sodium bicarbonate	Sangon Biotech	A500873
Sodium chloride	Sangon Biotech	A610476
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Spring	TAOBAO	0.2*1.5*1*7
Sulfo-Cyanine3 azide	Lumiprobe	A1330
tert-Butanol	Sigma-Aldrich	360538	Protect from light. Do not freeze.
Transbond MIP Moisture Insensitive Primer	3M Unitek	712-025
Transbond XT Light Cure Adhesive Paste	3M Unitek	712-035
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	V900257
Tris-buffered saline	Sangon Biotech	A500027