טכניקת הדמיה תלת-ממדית לעיצוב מחדש של עצם במודל עכבר הרחבת תפר

Summary

פרוטוקול זה מציג מודל עכבר סטנדרטי להרחבת תפרים ושיטת הדמיה תלת-ממדית לחקר השינויים המכנוביולוגיים של התפר ועיצוב מחדש של העצם תחת העמסת כוח מתיחה.

Abstract

תפרים קרניופלציאליים ממלאים תפקיד מכריע מעבר להיותם מפרקים סיביים המחברים עצמות גולגולתיות; הם משמשים גם כנישה העיקרית לצמיחת עצם קלווארית ופנים, המאחסנים תאי גזע מזנכימליים ואבות ניווניים. מכיוון שרוב עצמות הגולגולת מתפתחות באמצעות אוסיפיקציה תוך ממברנית, אזורי השוליים של התפרים משמשים כנקודות התחלה. בשל חשיבות זו, תפרים אלה הפכו למטרות מסקרנות בטיפולים אורתופדיים כמו הרחבת קמרון גולגולת בסיוע קפיץ, הרחבה מקסילרית מהירה ומשיכה מקסילרית. תחת כוח מעקב אורתופדי, תאי גזע התפרים מופעלים במהירות, והופכים למקור דינמי לעיצוב מחדש של העצם במהלך הרחבה. למרות חשיבותם, השינויים הפיזיולוגיים במהלך תקופות שיפוץ העצם עדיין אינם מובנים. שיטות החתך המסורתיות, בעיקר בכיוון הסגיטלי, אינן לוכדות את השינויים המקיפים המתרחשים לאורך התפר כולו. מחקר זה ביסס מודל עכבר סטנדרטי להרחבת תפר קשת. כדי להמחיש באופן מלא שינויים בעיצוב מחדש של העצם לאחר הרחבת התפרים, שיטת ניקוי הרקמה של פגסוס שולבה עם צביעת EdU בהרכבה מלאה ותיוג כפול של כלאט סידן. זה איפשר הדמיה של תאים מתרבים מאוד והיווצרות עצם חדשה על פני כל העצמות הקלוואריאליות לאחר ההתרחבות. פרוטוקול זה מציע מודל סטנדרטי של עכבר הרחבת תפרים ושיטת הדמיה תלת-ממדית, השופכת אור על השינויים המכנוביולוגיים בתפרים ובעיצוב מחדש של העצם תחת עומס כוח מתיחה.

Introduction

תפרים קרניופלציאליים הם רקמות סיביות המחברות בין עצמות גולגולת וממלאות תפקידים חיוניים בצמיחה ושיפוץ של עצמות גולגולתיות. מבנה התפר דומה לנהר, ומספק זרימה של משאבי תאים כדי להזין ולבנות את "גדת הנהר", המכונה חזיתות אוסטאוגניות, התורמות להיווצרות עצמות גולגולת באמצעות אוסטאוגנזה תוך ממברנית¹.

העניין בתפרים קרניופלציאליים מונע על ידי צרכים קליניים להבין סגירה מוקדמת של תפרים גולגולתיים ותפקוד לקוי של תפרי הפנים, מה שעלול להוביל לעיוותים גולגולתיים ואף למצבים מסכני חיים אצל ילדים. כריתת סוטורקטומיה פתוחה משמשת באופן שגרתי בטיפול קליני, אך מעקב ארוך טווח הראה הישנות לא מלאה של אוסיפיקציה חוזרת בחלק מהחולים². קרניוטומיה זעיר פולשנית בסיוע קפיצי הרחבה או כריתת גולגולת פס אנדוסקופית עשויה לספק גישה בטוחה יותר לשימור התפר הפוטנציאלי במקום להשליך את הרקמות³. באופן דומה, טיפולים אורתופדיים כגון מסכות פנים ומכשירי הרחבה נמצאים בשימוש נרחב לטיפול בהיפופלזיה מקסילרית קשת או אופקית, כאשר מחקרים מסוימים מרחיבים את מגבלת הגיל לטיפול בחולים מבוגרים באמצעות מרחיבי חיך בסיוע בורג קטן ^4,5,6. בנוסף, התחדשות תפר גולגולתי עם תאי גזע מזנכימליים (MSC) בשילוב עם חומרים מתכלים היא טיפול פוטנציאלי בעתיד, המציע כיוון חדשני לטיפול במחלות קשורות⁷. עם זאת, תהליך התפקוד או מנגנון הבקרה של התפרים נותר חמקמק.

עיצוב מחדש של העצם מורכב בעיקר מאיזון בין היווצרות עצם המבוצעת על ידי אוסטאובלסטים לבין ספיגת עצם המבוצעת על ידי אוסטאוקלסטים, כאשר התמיינות אוסטאוגנית של תאי גזע המעוררים על ידי אותות מכניים ממלאת תפקיד חשוב. לאחר עשרות שנים של מחקר, נמצא כי תפרים גולגולתיים הם נישות תאי גזע מזנכימליות פלסטיות מאוד⁸. תאי גזע תופרים (SuSCs) הם קבוצה הטרוגנית של תאי גזע, השייכים לתאי גזע מזנכימליים (MSCs) או תאי גזע עצם (SSC). SuSCs מסומנים in vivo על ידי ארבעה סמנים, כולל Gli1, Axin2, Prrx1 ו- Ctsk. Gli1⁺ SuSCs, בפרט, אימתו בקפידה את המאפיינים הביולוגיים של תאי גזע, לא רק מציגים ביטוי גבוה של סמני MSC טיפוסיים, אלא גם מפגינים פוטנציאל אוסטאוגני וכונדרוגני מעולה⁹. מחקרים קודמים הראו כי Gli1⁺ SuSCs תורמים באופן פעיל להיווצרות עצם חדשה תחת כוח מתיחה, וזיהו אותם כמקור תאי גזע התפרים התומך באוסטאוגנזה¹⁰ של הסחת דעת.

בעבר, מאפיינים מכניים נרחבים של תאי גזע נחקרו במבחנה באמצעות Flexcell, כיפוף ארבע נקודות, מערכת העמסה מיקרו-מגנטית ועוד. למרות שתאי מזנכימליים שמקורם בתפר גולגולתי של עכבר זוהו במבחנה¹¹, ותאי גזע מזנכימליים של תפרים אנושיים בודדו גם הם לאחרונה¹², התגובה הביומכנית של תאי התפרים נותרה לא ברורה במערכת במבחנה. כדי להמשיך ולחקור את תהליך עיצוב מחדש של העצם, הוקם מודל הרחבת תפר המבוסס על תרבית איברי קלבריה מבודדים, וסלל את הדרך לביסוס מודל הרחבת תפר in vivo שימושי ^1,13. ארנבים¹⁴ וחולדות¹⁵ היו בעלי החיים הנפוצים ביותר במחקר בסיסי להרחבת תפרים. עם זאת, עכברים הם מודלים מועדפים של בעלי חיים לחקר מחלות אנושיות בשל הגנום ההומולוגי מאוד שלהם עם בני אדם, קווי שינוי גנים רבים ויכולת הכלאה חזקה של רבייה. מודלים עכבריים קיימים של הרחבת תפר גולגולתי מסתמכים בדרך כלל על חוטי קפיץ אורתודונטיים מנירוסטה כדי להפעיל כוח מתיחה על תפר הקשת ^16,17. בדגמים אלה, שני חורים נעשים בכל צד של עצמות הקודקוד כדי לתקן את מכשיר ההתרחבות, והחוטים מוטמעים מתחת לעור, מה שעשוי להשפיע על מצב הפעלת התא.

באשר לשיטת ההדמיה, התצפית הדו-ממדית של פרוסות בכיוון הקשת אומצה בדרך כלל במשך עשרות שנים. עם זאת, בהתחשב בכך שיפוץ עצם הוא תהליך דינמי תלת מימדי מורכב, קבלת מידע תלת מימדי מלא הפך צורך דחוף. טכניקת שקיפות הרקמה של פגסוס התפתחה כדי לענות על דרישה זו ^18,19. הוא מציע יתרונות ייחודיים לשקיפות של רקמות קשות ורכות, ומאפשר לשחזר את תהליך עיצוב העצם המלא בחלל תלת ממדי.

כדי לקבל הבנה מעמיקה ומקיפה יותר של השינויים הפיזיולוגיים בתקופות עיצוב מחדש של העצם, הוקם מודל עכבר סטנדרטי להרחבת תפר סגיטלי עם הגדרת קפיץ בין המחזיקים בעבודת יד¹⁰. עם הליך תחריט והדבקה סטנדרטי של חומצה, מכשיר ההרחבה יכול להיות מחובר היטב לעצם הגולגולת, וליצור כוח מתיחה בניצב לתפר הסגיטלי. יתר על כן, שיטת ניקוי רקמות פגסוס יושמה לאחר תיוג כפול של העצם המינרלית לאחר ההתרחבות כדי להמחיש באופן מלא את השינויים במידול העצם לאחר הרחבת התפרים.

Protocol

כל ההליכים הניסיוניים המתוארים כאן אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים של בית החולים העממי התשיעי בשנחאי, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'יאו טונג בשנגחאי (SH9H-2023-A616-SB). במחקר זה נעשה שימוש בעכברים זכרים C57BL/6 בני 4 שבועות. כל המכשירים בהם נעשה שימוש עוקרו לפני ההליך.

1. הכנת מודל הרחבת התפרים

1. הכנת שני בעלי שמירה.
   1. השתמש בחוט אוסטרלי בגודל 0.014 אינץ' או חוט נירוסטה (ראה טבלת חומרים) ליצירת לולאה סלילית עם צבת חוט קלה. קוטר הלולאה הוא 2 מ"מ, והזנב בקוטר 1 מ"מ שמור משני הצדדים (איור 1A).
   2. יש לעקר את החוטים והמחזיקים לצורך הניתוח באוטוקלאב, מעקר פלזמה או חומר מעקר מתאים (למשל, גלוטראלדהיד).
2. הכנת המעיינות.
   1. הכינו קפיצי נירוסטה בהתאמה אישית.
      הערה: קפיץ הלחץ בקוטר חוט 0.2 מ"מ, קוטר חיצוני של 1.5 מ"מ, מרווח של 1 מ"מ ואורך של 7 מ"מ משמש במחקר זה (איור 1B). כל דחיסת קפיץ של 1 מ"מ קיבלה דחף של כ -30 גרם.
   2. חותכים את הקפיץ לאורך זמין לפני ההגדרה. אשר את הכוח עבור קפיץ מיוחד לפני הניסוי.
      הערה: גדלי הקפיצים משתנים כל עוד עוצמת הכוח זהה בניסויים מקבילים. הכוח נמדד על ידי מכשיר בדיקה חד-צירי שולחני או דינמומטר אלקטרוני קטן (ראה טבלת חומרים) אם המצב מוגבל. שינוי האורך מוערך לגודל הכוח (איור 1C-E). יש לציין כי יש צורך לשנות את ערך העמסת כוח הקפיץ בהתבסס על גיל, מצב העצם של העכבר וחפצי המחקר.
   3. הכינו חוט אוסטרלי ישר אחד או חוט פלדה ישר באורך 7 מ"מ, והכינו שתי פיסות נייר בקוטר 2 מ"מ לשימוש כמחסומים (איור 1F).

2. ניתוח הרחבת תפר קשת

1. הרדמה: מרדימים את העכברים בטילטמין (25 מ"ג/ק"ג), זולאזפאם (25 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג). במקביל, להחיל משחה אופתלמית סטרילית על העיניים כדי למנוע ייבוש של הקרניות. שפטו את עומק ההרדמה של העכברים באמצעות צביטת בוהן.
   הערה: המאפיינים הבאים מצביעים על כך שהעכבר מורדם כראוי: נשימה איטית ויציבה, חולשת גפיים, הרפיית שרירים, היעלמות רפלקס דיקור העור ורפלקס העפעפיים, כמו גם רפלקס קרנית חלש יותר.
2. הסרת פרווה וחיטוי: בזהירות להסיר את הפרווה על החלק העליון של הראש עם קרם הסרת שיער; הימנעו מלגעת בעיניים. זמן קצר לאחר מכן, השתמש בסבבים לסירוגין של יודופור ו 75% אלכוהול כדי לחטא את אתר הניתוח. מתן meloxicam (1 מ"ג / ק"ג) כמו משכך כאבים לעכברים על ידי הזרקה תת עורית.
3. קיבוע תנוחת הגוף: הניחו את העכבר שוכב על החלק הקדמי והשתמשו בסרטי ניתוח כדי לקבע את הגפיים על שולחן הניתוחים.
4. דש קרקפת פתוח: השתמשו במספריים כירורגיים כדי לבצע דש ארקואט לאורך הקרקפת ליד צוואר העכבר, תוך חשיפה מלאה של תפר הקשת והגולגולת שמסביב. לאחר מכן, לתקן את דש הקרקפת עם תפר 6-0 על שולחן הניתוחים.
5. קשרו את מחזיקי השימור לאחר תחריט חומצה.
   1. יבשו את הגולגולת וחרטו אותה עם 37% חומצה זרחתית למשך 20 שניות, והשתמשו במי מלח רגילים כדי לנקות את תחריט החומצה (איור 2A). שאריות גיר יתגלו לאחר ייבוש הגולגולת עם נורת פיפטת הגומי.
   2. מלטים את שני המחזיקים (מוכנים בשלב 1.1) משני צידי עצמות הקודקוד במרחק 3 מ"מ מהתפרים הסגיטליים בעזרת דבק קל (איור 2B).
6. אפסו את דש הקרקפת.
   1. החזירו ידנית את דש הקרקפת (איור 2C). תייגו את מיקום המחזיקים, חתכו שני חורים קטנים בקרקפת במיקום המתאים של מחזיקי השימור הדו-צדדיים, ולאחר מכן אפסו את הקרקפת המנופפת.
   2. במקביל, להעביר את הלולאות הקטנות דרך החורים כדי לחשוף את פני העור. תפרו את החתך המעוגל בתפר 6-0 (איור 2D). יום עד שלושה ימים מותרים להתאוששות העור. מתן meloxicam (1 מ"ג / ק"ג) לעכברים על ידי הזרקה תת עורית כל 24 שעות במשך 1 עד 3 ימים.
      הערה: לאחר הניתוח, יש לבדוק מדי יום את פעילות קרקפת העכבר והאם המחזיקים נופלים. ישנם סוגים שונים של עור בעניין צבע ועובי; הקרקפת הבריאה של העור תשמור על הצבע המקורי, וקצוות העור יתמזגו בהדרגה לאחר התפירה. אם נמצא זיהום בקרקפת, או אם מכשיר הניתוח נפל, הסר את העכבר מהמחקר והרדים אותו.
7. התקן את הקפיץ ואת חוט המנחה.
   1. חותכים את הקפיץ 1 מ"מ יותר מהמרחק בין שני המחזיקים.
   2. דחסו את קפיץ הלחץ שנבחר והניחו אותו בין הסלילים הקטנים משני הצדדים.
   3. מעבירים את חוט הנירוסטה דרך הסלילים הקטנים והקפיץ, ומשחררים את הקפיץ לקבלת דחף התחלתי של כ-30 גרם.
   4. בדוק שהקרקפת מתחת לאזור הקפיץ של העכבר היא ללא דחיסה.
   5. לאחר שווידאתם שההדבקה יציבה ללא כל רפיון, קשרו שתי פיסות נייר בין הקפיץ לבין המחזיקים בדבק קל כדי ליצור מחסומים בשני קצות הקפיץ (איור 2E,F).

3. תיוג כפול של עצמות מינרליות

1. הכנת פתרון המלאי.
   1. הכינו תמיסת דילול עם מים מזוקקים המכילה 0.9% NaCl ו-2% NaHCO₃.
   2. השתמש בתמיסה המדללת להכנת 20 מ"ג / מ"ל של קומפלקס אליזרין דיהידרט ו -10 מ"ג / מ"ל של קלצין (ראה טבלת חומרים).
   3. כוונן את ה- pH ל- 7.4 באמצעות מכשיר מדידת pH. שטפו את בדיקת ה-pH בין המדידות כדי להבטיח קריאות מדויקות.
   4. שים את הצבע לתוך מיכל סטרילי ולאחסן אותו במקרר ב 4 ° C; רדיד אלומיניום משמש כדי להרחיק אור.
2. הכן את פתרון העבודה. לפני ההזרקה, יש לדלל את תמיסת הציר ל-1 מ"ג/מ"ל עבור סידן ו-2 מ"ג/מ"ל עבור קומפלקס אליזרין דיהידרט באמצעות תמיסת המסה.
3. הזריקו תוך צפקית 5 מ"ג/ק"ג של קלצאין ירוק ו-20 מ"ג/ק"ג אדום אליזרין בשתי נקודות זמן כדי לסמן את העצמות שעברו מינרליזציה ולנתח את השינויים בין שתי פעמים. בדרך כלל, לאסוף את הדגימות 12-14 שעות לאחר ההזרקה.
   הערה: חממו את הצבעים לפני ההזרקה, וודאו שזמן ההזרקה אינו פחות מ-3 דקות. מרווח ההזרקה תלוי בזמן ההתרחבות. במחקר זה, אדום אליזרין וירוק קלצין הוזרקו במשך הלילה (O/N) לפני הרחבה ו- O/N לפני האיסוף, בהתאמה.
4. לאסוף עצמות קלוריות שלמות שהוכנו להליך ניקוי רקמות יום לאחר הזריקה השנייה.

4. צביעת EdU

1. הזרקה תוך צפקית: הזרקה תוך צפקית EdU שעתיים לפני המתת העכברים (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי מוסדות). המינון הוא 1 מ"ג / 10 גרם משקל גוף.
2. הכנת קוקטייל תיוג: ערבבו מי מלח חוצצים טריס (100 mmol / L סופי, pH 7.6), CuSO₄ (4 mmol / L סופי), Sulfo-ציאנין 3 Azide (2-5 μmol / L סופי) ונתרן אסקורבט (100 mmol / L סופי, עשוי טרי בכל שימוש) (ראה טבלה של חומרים).
3. צביעה בהרכבה מלאה של EdU: לאחר שלב הסרת צבע הרקמה בשיטת ניקוי הרקמה של PEGASOS (שלב 7), הכניסו דגימות לקוקטייל התיוג למשך יום אחד בטמפרטורת החדר (RT).

5. הדמיית טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת

1. קיבוע רקמות ואחסון: קבע את עצמות הקלוואריה ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-4°C O/N ואחסן אותן ב-0.5% PFA לפני הסריקה.
2. סריקה וניתוח: סרוק את הדגימות באמצעות מערכת הדמיה של טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (μCT) ברזולוציה גבוהה ובגודל ווקסל של 7 מיקרומטר.

6. הכנת פתרון עבודה לניקוי רקמות פגסוס

1. 4% פוליפורמלדהיד (PFA): יש להמיס 4 גרם אבקת PFA ב-1× PBS עד 100 מ"ל.
2. פתרון זילוח לב: 0.02% הפרין, כלומר, 20 מ"ג אבקת הפרין מומס ב 1× PBS עד 100 מ"ל; לחלופין, השתמש 0.05 mol/L EDTA, כלומר, 0.05 mol של אתילן דיאמין חומצה טטראצטית (EDTA) (ראה טבלה של חומרים), מומס בתמיסה מימית deionized לנפח כולל של 1 L.
3. תמיסת הסתיידות: 0.5 mol/L EDTA, כלומר, 0.5 mol של אתילן דיאמין חומצה טטראצטית (EDTA), מומס בתמיסה מימית deionized לנפח כולל של 1 L.
4. תמיסת דה-קולוריזציה: 25% Quadrol, שהם 250 מ"ל של Quadrol (N, N, N', N' - Tetrakis (2-Hydroxypropyl) ethylenediamine) (ראה טבלת חומרים) מומס במים deionized לנפח כולל של 1 L.
   הערה: בשל צמיגות Quadrol, ניתן לחמם אותו ל 60 ° C כדי להגדיל את הנזילות שלו לפני התצורה.
5. תמיסת הסרת שומנים: 30%, 50%, 70% טרט-בוטנול (tB) (ראה טבלת חומרים), מוכן עם מים לפי חלק נפח.
   הערה: בהתחשב בכך ששחפת טהורה היא גבישית בטמפרטורת החדר, יש לחמם אותה ל-60°C עד שהיא מתמוססת לפני שניתן יהיה להשתמש בה. לאחר מכן, 3% עד 5% (v/v) triethanolamine (TEA) מתווסף כדי לווסת את ה- pH של התמיסה >9.5.
6. תמיסת התייבשות: תמיסת TB-PEG, 70% tB + 27% PEG-MMA + 3% Quadrol (v/v), כאשר PEG-MMA הוא פולי (אתילן גליקול) מתיל אתר מתקרילט עם משקל מולקולרי ממוצע של 500 (פולי (אתילן גליקול) מתקרילט 500, PEG-MMA 500) (ראה טבלת חומרים).
7. פתרון שקוף: תמיסת BB-PEG, 75% BB + 22% PEG-MMA + 3% Quadrol (v/v), כאשר BB הוא בנזיל בנזואט (BB).

7. שקיפות עצמות קלווריאלי בשיטת פגסוס

1. מרדימים את העכבר על ידי הזרקה תוך צפקית של חומרי הרדמה (שלב 2.1), ושופטים את עומק ההרדמה של העכבר באמצעות תגובת הצביטה כדי להבטיח שאין תגובת התנגדות לפני זילוח הלב.
2. בצע זילוח לב וקיבוע.
   1. החזיקו את בטן העכבר כלפי מעלה, תקנו את הגפיים בסרט הדבקה וחתכו בזהירות לאורך היקף בית החזה כדי לחשוף אותו במלואו.
   2. מיד לאחר ביצוע חתך קטן באטריום הימני עם מספריים אופתלמיים, להכניס זילוח 22 G מחט בקודקוד החדר השמאלי.
      הערה: רק קצה המחט מוכנס כדי למנוע פגיעה במסתם הלב באמצעות החדרת יתר. אחרת, נוזל זילוח הלב ייכנס למחזור הדם הריאתי, וישפיע על אפקט הזילוח של מחזור הדם המערכתי.
   3. לדחוף את נוזל זילוח הלב 30-50 מ"ל (שלב 6.2) במזרק. ניתן לראות כי הכבד הופך בהדרגה חיוור מאדום בוהק.
   4. לאחר שנוזל הזרימה מהאטריום הימני הופך ברור לחלוטין, להחדיר תמיסת 4% PFA בנפח שווה. הפעלת זילוח PFA מתבצעת במכסה מנוע מאוורר.
   5. נתחו והפרידו את הרקמות והאיברים, וקבעו אותם למשך הלילה עם 4% PFA ב-4°C.
3. הסתיידות רקמות: עבור דגימות המעובדות על ידי צביעת EdU, הניחו את הרקמה הקשיחה הקבועה בתמיסת 0.5mol/L EDTA (pH 7.0) (10 מ"ל) בשולחן ניעור בטמפרטורה של 37°C למשך כיומיים, והחליפו את הנוזל מדי יום.
   הערה: דלג על תהליך ההסתיידות בשיטת פגסוס המנורמלת עבור חומר כלאט סידן המסומן בעצמות כדי לשמר את האיתות במלואו. Decalcification נדרש לטיפול בעצמות כדי לדמיין את פלואורסצנטיות אנדוגנית או אותות immunostained הר שלם.
4. שינוי צבע רקמות: הניחו את העצמות הקלוואריאליות הקבועות בתמיסת קוואדרול 25% (20 מ"ל) בשולחן ניעור בטמפרטורה של 37°C למשך יום אחד, והחליפו את הנוזל פעם אחת.
   הערה: זמן הסרת הצבע קשור לתוכן הם ברקמה. שימו לב לצבע נוזל הטיפול, שכן עומק הצבע מייצג את הצורך להמשיך את הטיפול בתחליפי נוזלים.
5. צביעת EdU: שטפו את הדגימות ב-1× PBS במשך 5 דקות (שלוש פעמים), ולאחר מכן טבלו אותן בקוקטייל התיוג למשך יום אחד. לאחר מכן, לשטוף את הדגימות ב 1× PBS במשך 1 שעה (שלוש פעמים).
6. הסרת שומנים ברקמות והתייבשות
   1. הניחו את הרקמות בתמיסות 30% tB, 50% tB ו-70% tB ברצף כדי לבצע ירידה הדרגתית על שולחן רעד ב-37°C. מניחים בכל ריכוז כשעתיים.
   2. לאחר מכן, יש לייבש את הדגימות בתמיסת TB-PEG למשך 6 שעות על שולחן רועד בטמפרטורה של 37°C.
      הערה: ניתן להגדיל או להקטין את זמן העיבוד לעיל בהתאם למספר הרקמות.
7. שקיפות רקמות: הניחו את הרקמה המיובשת לחלוטין בתמיסת BB-PEG על שולחן ניעור בטמפרטורה של 37°C (2-4 שעות) עד לשקיפות. נכון לעכשיו, דגימות ניתן לאחסן עד 1-2 שנים.
   הערה: לאחר ניקוי כמעט מלא, פתח את מכסה הצינור כדי לחשוף את הדגימות ומדיום לאוויר עם רעידות ישפר עוד יותר את השקיפות. שיטה זו מתאימה לשיפור השקיפות של רקמות ואיברים בודדים, כמו גם את כל הראש והגוף של עכברים צעירים. עם זאת, עבור שקיפות של כל הגוף של עכברים בוגרים, השלבים לעיל צריך להתבצע באמצעות שיטת זילוח מחזור מלא.

8. הדמיה

הערה: מיקרוסקופ קונפוקלי שימש להדמיה תלת-ממדית של רקמות שקופות במחקר זה. מיקרוסקופ גיליון אור מתאים גם לפרוטוקול זה. מספר מערכות הפעלה אומתו כזמינות בעבר. כאן נלקחת כדוגמה מערכת הפעלה של מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי (ראו טבלת חומרים).

1. בהתאם למדריך למשתמש, בצע את השלבים הנכונים כדי לפתוח את ממשק הפעולה של לייזר קונפוקל ו- LAS AF. הפעל את הלייזר הנדרש בערוצי צילום שונים והתאם את הכוח. הגדר את הנתיב האופטי ואת אורך הגל המתאים, 561 ננומטר עבור אדום אליזרין ו 488 ננומטר עבור ירוק Calcein, שכל אחד מהם משמש עבור אות EdU על פי קוקטייל התיוג.
2. הניחו את הדגימות השקופות בצלחת פטרי מזכוכית קעורה שיכולה לשאת דגימות עבות, קופסאות הטבעה או מכשירי מיקום מתוצרת עצמית כגון דבק עמיד למים כדי לטבול את הדגימות השקופות בנוזל שקוף.
3. בחרו עדשה אובייקטיבית בעוצמה נמוכה כדי לאתר במהירות את הדגימה. ערוך סקירה כללית של כל הרקמה הקלוואריאלית עם פונקציית הסריקה המהירה, ומצא את אזור העניין להדמיה.
4. הגדר את עוצמת הפלט, בחר את מצב הסריקה והתאם תחילה את מקדמי הצילום (רזולוציה, מהירות סריקה, גורם זום, איכות תמונה, רעשי רקע ממוצעים וכו ').
   הערה: באופן כללי, Smart Gain נע בין 500 ל-800 (הן שינוי אות והן שינוי רעש); הסטה חכמה קרובה ככל האפשר ל-0 תוך הבטחת איכות התמונה (להפחתת רעשי רקע). כאשר רווח PMT גבוה מ- 800, או רווח HyD גדול מ- 100%, והבהירות עדיין אינה מספקת, ניתן להגדיל את עוצמת הלייזר כראוי, אך באופן עקרוני, ככל שנמוך יותר, כן ייטב.
5. הגדר את טווח המרחק הצירי Z ואת צעד Z, אשר מסתעף מהצד הרדוד ביותר של הארגון השקוף; כלומר, להגדיר את הצדדים העמוקים והרדודים ביותר.
   הערה: אשר את הסיווג ואת מרחק העבודה עבור כל עדשה. הגדר בזהירות את טווח Z, ואל תפעיל את מרחק העבודה החורג ממגבלת העדשה שנבחרה. ניתן לבחור את "z-Galvo" כאשר יש צורך ברגולציה עדינה.
6. הגדר שוב את פרמטרי הצילום והתחל לירות. לאחר השלמת, מזג ועבד את התמונות באמצעות המודול הרב-תכליתי. לבסוף, אחסן וכבה את המכשיר בסדר שצוין.

תוצאות

באמצעות פרוטוקול זה נקבע מודל עכברי להרחבת תפר סגיטלי (איור 1-2). לצורך הדמיה תלת-ממדית של שינויים במידול העצם לאחר הרחבת התפרים, יושמה שיטת ניקוי רקמות פגסוס על כל עצמות הקלוואריה לאחר הרחבה. לאחר הזילוח הופרדו עצמות קלווריאלי (איור 3A), והמ?...

Discussion

יישמנו מודל סטנדרטי של עכבר הרחבת תפר כדי לבחון את השינויים המורפולוגיים הקבועים המתרחשים מדי שבוע במהלך כל מחזור השיפוץ בן החודש¹⁰. מודל זה שימושי לחקר עיצוב מחדש והתחדשות עצם קלווריאלית על ידי הרחבת תפרים קלווריאליים, כמו גם לחקר תאי תפר שונים in vivo. כדי להציג באופן מלא א...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
37% Acid etching	Xihubiom	E10-02/1807011
Alizarin red	Sigma-Aldrich	A3882
AUSTRALIAN WIRE	A.J.WILCOCK	0.014''
Benzyl benzoate	Sigma-Aldrich	B6630
Calcein green	Sigma-Aldrich	C0875
Copper(II) sulfate, anhydrous	Sangon Biotech	A603008
Dynamometer	Sanliang	SF-10N
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
EdU	Invitrogen	E104152
Laser Confocal Microscope	Leica	SP8
PBS	Sangon Biotech	E607008
PEG-MMA 500	Sigma-Aldrich	447943
PFA	Sigma-Aldrich	P6148
pH Meters	Mettler Toledo	S220
Quadrol	Sigma-Aldrich	122262
Sodium Ascorbate	Sigma-Aldrich	A4034
Sodium bicarbonate	Sangon Biotech	A500873
Sodium chloride	Sangon Biotech	A610476
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Spring	TAOBAO	0.2*1.5*1*7
Sulfo-Cyanine3 azide	Lumiprobe	A1330
tert-Butanol	Sigma-Aldrich	360538	Protect from light. Do not freeze.
Transbond MIP Moisture Insensitive Primer	3M Unitek	712-025
Transbond XT Light Cure Adhesive Paste	3M Unitek	712-035
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	V900257
Tris-buffered saline	Sangon Biotech	A500027