Eine 3D-Visualisierungstechnik für den Knochenumbau in einem Nahtexpansions-Mausmodell

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt ein standardisiertes Nahtexpansions-Mausmodell und eine 3D-Visualisierungsmethode vor, um die mechanobiologischen Veränderungen der Naht und des Knochenumbaus unter Zugkraftbelastung zu untersuchen.

Zusammenfassung

kraniofaziale Nähte spielen eine entscheidende Rolle, die nicht nur fibröse Gelenke sind, die kraniofaziale Knochen verbinden. Sie dienen auch als primäre Nische für das Wachstum von Schädel- und Gesichtsknochen und beherbergen mesenchymale Stammzellen und Osteoprogenitoren. Da sich die meisten kraniofazialen Knochen durch intramembranöse Ossifikation entwickeln, fungieren die Randregionen der Nähte als Initiationspunkte. Aufgrund dieser Bedeutung sind diese Nähte zu faszinierenden Zielen in orthopädischen Therapien wie der federunterstützten Schädelgewölbeerweiterung, der schnellen Oberkiefererweiterung und der Oberkieferprotraktion geworden. Unter orthopädischer Rückverfolgungskraft werden die Stammzellen der Naht schnell aktiviert und werden zu einer dynamischen Quelle für den Knochenumbau während der Expansion. Trotz ihrer Bedeutung sind die physiologischen Veränderungen während des Knochenumbaus nach wie vor unzureichend verstanden. Herkömmliche Schnittmethoden, vor allem in sagittaler Richtung, erfassen nicht die umfassenden Veränderungen, die über die gesamte Naht auftreten. In dieser Studie wurde ein Standard-Mausmodell für die sagittale Nahtexpansion etabliert. Um die Veränderungen des Knochenumbaus nach der Nahtexpansion vollständig sichtbar zu machen, wurde die PEGASOS-Methode zur Gewebereinigung mit einer Whole-Mount-EdU-Färbung und einer Calcium-Chelat-Doppelmarkierung kombiniert. Dies ermöglichte die Visualisierung von stark proliferierenden Zellen und die Neubildung von Knochen über den gesamten Schädelknochen nach der Expansion. Dieses Protokoll bietet ein standardisiertes Nahtexpansionsmodell und eine 3D-Visualisierungsmethode, die Aufschluss über die mechanobiologischen Veränderungen in Nähten und den Knochenumbau unter Zugkraftbelastung gibt.

Einleitung

kraniofaziale Nähte sind fibröse Gewebe, die kraniofaziale Knochen verbinden und eine wesentliche Rolle beim Wachstum und Umbau kraniofazialer Knochen spielen. Die Struktur der Naht ähnelt einem Fluss und sorgt für einen Fluss von Zellressourcen, um das "Flussufer" zu nähren und aufzubauen, die als osteogene Fronten bekannt sind und über intramembranöse Osteogenese zur Bildung kraniofazialer Knochen beitragen¹.

Das Interesse an kraniofazialen Nähten wurde durch die klinische Notwendigkeit vorangetrieben, den vorzeitigen Verschluss von Schädelnähten und die Dysfunktion der Gesichtsnähte zu verstehen, die zu kraniofazialen Deformitäten und sogar lebensbedrohlichen Zuständen bei Kindern führen können. Die offene Nahtektomie wird routinemäßig in der klinischen Behandlung eingesetzt, aber die Langzeitnachsorge hat bei einigen Patienten ein unvollständiges Rezidiv der Reossifikation gezeigt². Die minimalinvasive Kraniotomie mit Hilfe von Dehnungsfedern oder die endoskopische Streifenkraniektomie kann einen sichereren Ansatz zur Erhaltung der potenziellen Naht bieten, anstatt das Gewebe zu verwerfen³. In ähnlicher Weise wurden orthopädische Therapien wie Gesichtsmasken und Expansionsapparaturen häufig zur Behandlung von sagittaler oder horizontaler Oberkieferhypoplasie eingesetzt, wobei einige Studien die Altersbeschränkung auf die Behandlung erwachsener Patienten mit Minischrauben-assistierten Gaumenexpandern ausweiteten ^4,5,6. Darüber hinaus ist die Regeneration von Schädelnähten mit mesenchymalen Stammzellen (MSCs) in Kombination mit biologisch abbaubaren Materialien eine potenzielle Therapie in der Zukunft, die eine neue Richtung für die Behandlung verwandter Krankheiten bietet⁷. Der Funktionsprozess oder der Regulationsmechanismus von Nähten bleibt jedoch schwer fassbar.

Der Knochenumbau besteht hauptsächlich aus einem Gleichgewicht zwischen der Knochenbildung durch Osteoblasten und der Knochenresorption durch Osteoklasten, wobei die osteogene Differenzierung von Stammzellen, die durch mechanische Signale stimuliert wird, eine wichtige Rolle spielt. Nach jahrzehntelanger Forschung wurde festgestellt, dass kraniofaziale Nähte hochplastische mesenchymale Stammzellnischen sind⁸. Nahtstammzellen (SuSCs) sind eine heterogene Gruppe von Stammzellen, die zu mesenchymalen Stammzellen (MSCs) oder Knochenstammzellen (SSCs) gehören. SuSCs werden in vivo durch vier Marker markiert, darunter Gli1, Axin2, Prrx1 und Ctsk. Insbesondere Gli1⁺ SuSCs haben die biologischen Eigenschaften von Stammzellen streng verifiziert und zeigen nicht nur eine hohe Expression typischer MSC-Marker, sondern auch ein hervorragendes osteogenes und chondrogenes Potenzial⁹. Frühere Forschungen haben gezeigt, dass Gli1⁺ SuSCs aktiv zur Knochenneubildung unter Zugkraft beitragen und sie als Nahtstammzellquelle identifizieren, die die Distraktionsosteogenese unterstützt¹⁰.

In der Vergangenheit wurden umfangreiche mechanische Eigenschaften von Stammzellen in vitro mit Flexcell, Vier-Punkt-Biegung, Mikromagnet-Belastungssystem und anderen untersucht. Obwohl in vitro mesenchymale Zellen aus der Schädelnaht von Mäusen identifiziert wurden ¹¹ und auch mesenchymale Stammzellen aus menschlichem Naht kürzlich isoliert wurden¹², bleibt die biomechanische Reaktion von Nahtzellen im In-vitro-System unklar. Um den Knochenumbauprozess weiter zu untersuchen, wurde ein Nahtexpansionsmodell auf der Grundlage isolierter Calvaria-Organkulturen etabliert, das den Weg für die Etablierung eines nützlichen in vivo Nahtexpansionsmodells ebnet ^1,13. Kaninchen¹⁴ und Ratten¹⁵ sind die am häufigsten verwendeten Tiere in der Grundlagenforschung für die Nahterweiterung. Mäuse sind jedoch aufgrund ihres hochgradig homologen Genoms mit dem Menschen, zahlreicher Genmodifikationslinien und ihrer starken reproduktiven Hybridisierungsfähigkeit bevorzugte Tiermodelle für die Erforschung menschlicher Krankheiten. Bestehende Mausmodelle der kranialen Nahterweiterung stützen sich typischerweise auf kieferorthopädische Federdrähte aus Edelstahl, um Zugkraft auf die sagittale Naht auszuüben^16,17. Bei diesen Modellen werden zwei Löcher in jede Seite der Scheitelknochen gebohrt, um das Expansionsgerät zu fixieren, und die Drähte sind unter der Haut eingebettet, was den Zellaktivierungsmodus beeinträchtigen kann.

Was die Visualisierungsmethode betrifft, so hat sich die zweidimensionale Betrachtung von Schichten in sagittaler Richtung seit Jahrzehnten durchgesetzt. In Anbetracht der Tatsache, dass der Knochenumbau ein komplexer dreidimensionaler dynamischer Prozess ist, ist es jedoch dringend erforderlich, vollständige dreidimensionale Informationen zu erhalten. Um diese Anforderung zu erfüllen, wurde die PEGASOS-Technik der Gewebetransparenz entwickelt^18,19. Es bietet einzigartige Vorteile für die Transparenz von Hart- und Weichgewebe und ermöglicht es, den gesamten Knochenumbauprozess im dreidimensionalen Raum zu reproduzieren.

Um ein tieferes und umfassenderes Verständnis der physiologischen Veränderungen in den Knochenumbauperioden zu erlangen, wurde ein Standard-Sagittal-Nahtexpansions-Mausmodell mit einer Federeinstellung zwischen den handgefertigten Haltern etabliert¹⁰. Mit einem standardisierten Säureätz- und Klebeverfahren konnte die Expansionsvorrichtung fest mit dem Schädelknochen verbunden werden, wodurch eine Zugkraft senkrecht zur sagittalen Naht erzeugt wurde. Darüber hinaus wurde die PEGASOS-Methode zur Gewebereinigung nach doppelter Markierung des mineralisierten Knochens nach der Expansion angewendet, um die Veränderungen der Knochenmodellierung nach der Nahtexpansion vollständig sichtbar zu machen.

Protokoll

Alle hier beschriebenen experimentellen Verfahren wurden vom Animal Care Committee des Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (SH9H-2023-A616-SB) genehmigt. In dieser Studie wurden 4 Wochen alte männliche C57BL/6-Mäuse verwendet. Alle verwendeten Instrumente wurden vor dem Eingriff sterilisiert.

1. Erstellung des Nahtaufweitungsmodells

1. Vorbereitung von zwei Retentionshaltern.
   1. Verwenden Sie 0,014'' australischen Draht oder Edelstahldraht (siehe Materialtabelle), um mit einer leichten Drahtzange eine spiralförmige Schlaufe herzustellen. Der Durchmesser der Schlaufe beträgt 2 mm, und 1 mm Schwanz ist auf zwei Seiten reserviert (Abbildung 1A).
   2. Sterilisieren Sie die Drähte und Halterungen für die Operation in einem Autoklaven, Plasmasterilisator oder einem geeigneten Kaltsterilisationsmittel (z. B. Glutaraldehyd).
2. Vorbereitung der Federn.
   1. Bereiten Sie kundenspezifische Federn aus Edelstahl vor.
      HINWEIS: In dieser Studie wird die Druckfeder mit 0,2 mm Drahtdurchmesser, 1,5 mm Außendurchmesser, 1 mm Zwischenraum und 7 mm Länge verwendet (Abbildung 1B). Jede 1 mm Federkompression erhielt einen Schub von ca. 30 g.
   2. Schneiden Sie die Feder vor dem Einsetzen auf eine verfügbare Länge. Bestätigen Sie die Kraft für die spezielle Feder vor dem Experiment.
      ANMERKUNG: Die Größen der Federn werden variiert, solange die Kraftgröße in parallelen Experimenten gleich ist. Die Kraft wird mit einem uniaxialen Tischprüfgerät oder einem kleinen elektronischen Leistungsprüfstand (siehe Werkstofftabelle) gemessen, wenn der Zustand begrenzt ist. Die Längenänderung wird auf die Kraftgröße ausgewertet (Abbildung 1C-E). Insbesondere ist es notwendig, den Wert der Federkraftbelastung basierend auf dem Alter, dem Knochenzustand der Maus und den Forschungsobjekten zu ändern.
   3. Bereiten Sie einen geraden australischen Draht oder geraden Stahldraht von 7 mm Länge vor und stellen Sie zwei Blätter Papier mit einem Durchmesser von 2 mm her, die als Barrieren verwendet werden (Abbildung 1F).

2. Sagittale Nahterweiterungsoperation

1. Anästhesie: Betäuben Sie die Mäuse mit Tiletamin (25 mg/kg), Zolazepam (25 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg). Tragen Sie gleichzeitig eine sterile Augensalbe auf die Augen auf, um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern. Beurteilen Sie die Narkosetiefe der Mäuse durch eine Zehenkneife.
   HINWEIS: Die folgenden Merkmale deuten darauf hin, dass die Maus richtig betäubt ist: langsame und gleichmäßige Atmung, Schwäche der Gliedmaßen, Muskelentspannung, Verschwinden des Hautakupunkturreflexes und des Augenlidreflexes sowie schwächerer Hornhautreflex.
2. Fellentfernung und Desinfektion: Entfernen Sie das Fell am Oberkopf vorsichtig mit Haarentfernungscreme; Vermeiden Sie es, die Augen zu berühren. Kurz darauf abwechselnd Jodophor und 75%igen Alkohol verwenden, um die Operationsstelle zu desinfizieren. Verabreichen Sie den Mäusen Meloxicam (1 mg/kg) als Analgesie durch subkutane Injektion.
3. Fixierung der Körperposition: Legen Sie die Maus auf die Vorderseite und fixieren Sie die Gliedmaßen mit chirurgischen Bändern auf dem Operationstisch.
4. Offenen Kopfhautlappen: Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um einen bogenförmigen Lappen entlang der Kopfhaut in der Nähe des Halses der Maus durchzuführen, der die sagittale Naht und den umgebenden Schädel vollständig freilegt. Danach fixieren Sie den Kopfhautlappen mit einer 6-0-Naht auf dem Operationstisch.
5. Verkleben Sie die Retentionshalter nach dem Säureätzen.
   1. Trocknen Sie den Schädel und ätzen Sie ihn 20 Sekunden lang mit 37%iger Phosphorsäure und verwenden Sie normale Kochsalzlösung, um die Säureätzung zu reinigen (Abbildung 2A). Nach dem Trocknen des Schädels mit dem Gummipipettenkolben sind kalkhaltige Rückstände sichtbar.
   2. Zementieren Sie die beiden Halter (vorbereitet in Schritt 1.1) auf beiden Seiten der Scheitelknochen 3 mm von den sagittalen Nähten entfernt mit einem lichthärtenden Klebstoff (Abbildung 2B).
6. Setzen Sie die Kopfhautklappe zurück.
   1. Setzen Sie den Kopfhautlappen manuell wieder ein (Abbildung 2C). Beschriften Sie die Position der Halter, schneiden Sie zwei kleine Löcher in die Kopfhaut an der entsprechenden Position der beidseitigen Retentionshalter und setzen Sie dann die flatternde Kopfhaut zurück.
   2. Führen Sie gleichzeitig die kleinen Schlaufen durch die Löcher, um die Hautoberfläche freizulegen. Vernähen Sie den gekrümmten Schnitt mit einer 6-0-Naht (Abbildung 2D). Für die Regeneration der Haut sind ein bis drei Tage vorgesehen. Meloxicam (1 mg/kg) wird den Mäusen 1 bis 3 Tage lang alle 24 h subkutan injiziert.
      HINWEIS: Überprüfen Sie nach der Operation täglich die Aktivität der Mäusekopfhaut und ob die Halter abfallen. Es gibt verschiedene Hauttypen in Bezug auf Farbe und Dicke; Die gesunde Kopfhaut behält die ursprüngliche Farbe bei, und die Hautränder verschmelzen nach dem Nähen allmählich miteinander. Wenn eine Infektion der Kopfhaut festgestellt wird oder wenn das chirurgische Gerät abgefallen ist, entfernen Sie die Maus aus der Studie und euthanasieren Sie sie.
7. Bringen Sie die Feder und den Führungsdraht an.
   1. Schneiden Sie die Feder 1 mm länger als den Abstand zwischen den beiden Haltern.
   2. Drücken Sie die gewählte Druckfeder zusammen und platzieren Sie sie zwischen den kleinen Windungen auf beiden Seiten.
   3. Führen Sie den Edelstahldraht durch die kleinen Windungen und die Feder und lassen Sie die Feder los, um einen Anfangsschub von etwa 30 g zu erhalten.
   4. Vergewissern Sie sich, dass die Kopfhaut unter dem Federbereich der Maus nicht komprimiert ist.
   5. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass die Verklebung fest und locker ist, kleben Sie zwei Papierschnipsel zwischen der Feder und den Haltern mit einem lichthärtenden Klebstoff, um an beiden Enden der Feder Barrieren zu errichten (Abbildung 2E,F).

3. Doppelte Markierung von mineralisierten Knochen

1. Herstellung der Stammlösung.
   1. Bereiten Sie eine Verdünnungslösung mit destilliertem Wasser vor, die 0,9 % NaCl und 2 % NaHCO₃ enthält.
   2. Verwenden Sie die Verdünnungslösung, um 20 mg/ml Alizarin-Komplex-Dihydrat und 10 mg/ml Calcein herzustellen (siehe Materialtabelle).
   3. Stellen Sie den pH-Wert mit einem pH-Messgerät auf 7,4 ein. Spülen Sie die pH-Sonde zwischen den Messungen, um genaue Messwerte zu gewährleisten.
   4. Geben Sie den Farbstoff in einen sterilen Behälter und lagern Sie ihn im Kühlschrank bei 4 °C. Folie wird verwendet, um Licht abzuhalten.
2. Bereiten Sie die Arbeitslösung vor. Vor der Injektion wird die Stammlösung mit einer Auflösungslösung auf 1 mg/ml für Calcium und 2 mg/ml für Alizarin-Komplex-Dihydrat verdünnt.
3. Intraperitoneal injizieren Sie 5 mg/kg Calceingrün und 20 mg/kg Alizarinrot zu zwei Zeitpunkten, um die mineralisierten Knochen zu markieren und die Veränderungen zwischen zwei Zeitpunkten zu analysieren. Im Allgemeinen werden die Proben 12-14 Stunden nach der Injektion entnommen.
   HINWEIS: Erwärmen Sie die Farbstoffe vor der Injektion und stellen Sie sicher, dass die Injektionszeit nicht weniger als 3 Minuten beträgt. Das Injektionsintervall hängt vom Zeitpunkt der Ausdehnung ab. In dieser Studie wurden Alizarinrot und Calceingrün über Nacht (O/N) vor der Expansion bzw. O/N vor der Entnahme injiziert.
4. Entnahme ganzer Schädelknochen, die für die Gewebereinigung vorbereitet sind, einen Tag nach der zweiten Injektion.

4. EdU-Färbung

1. Intraperitoneale Injektion: Intraperitoneale Injektion von EdU 2 h vor der Euthanasie der Mäuse (gemäß institutionell anerkannten Protokollen). Die Dosis beträgt 1 mg/10 g Körpergewicht.
2. Zubereitung des Etikettiercocktails: Mischung von Tris-gepufferter Kochsalzlösung (100 mmol/L final, pH 7,6), CuSO₄ (4 mmol/L final), Sulfo-Cyanin-3-Azid (2-5 μmol/L final) und Natriumascorbat (100 mmol/L final, bei jedem Gebrauch frisch gemacht) (siehe Materialtabelle).
3. EdU-Whole-Mount-Färbung: Nach dem Schritt der Gewebeentfärbung bei der PEGASOS-Gewebereinigungsmethode (Schritt 7) werden die Proben für 1 Tag bei Raumtemperatur (RT) in den Markierungscocktail gegeben.

5. Mikro-Computertomographie-Bildgebung

1. Gewebefixierung und -lagerung: Fixieren Sie die Schädelknochen in 4 % Paraformaldehyd (PFA) bei 4 °C O/N und lagern Sie sie vor dem Scannen in 0,5 % PFA.
2. Scannen und Analysieren: Scannen Sie die Proben mit einem Mikro-Computertomographen (μCT)-Bildgebungssystem mit hoher Auflösung und einer Voxelgröße von 7 μm.

6. Herstellung der Arbeitslösung für die PEGASOS-Gewebereinigung

1. 4% Polyformaldehyd (PFA): 4 g PFA-Pulver in 1× PBS auf 100 ml auflösen.
2. Kardiale Perfusionslösung: 0,02% Heparin, dh 20 mg Heparinpulver, gelöst in 1× PBS bis 100 ml; alternativ können 0,05 mol/l EDTA, d. h. 0,05 mol Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (siehe Materialtabelle), gelöst in einer entionisierten wässrigen Lösung zu einem Gesamtvolumen von 1 l, verwendet werden.
3. Entkalkungslösung: 0,5 mol/L EDTA, d. h. 0,5 mol Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), gelöst in einer deionisierten wässrigen Lösung zu einem Gesamtvolumen von 1 L.
4. Entfärbungslösung: 25% Quadrol, das sind 250 ml Quadrol (N, N, N', N' - Tetrakis (2-Hydroxypropyl)ethylendiamin) (siehe Materialtabelle), gelöst in entionisiertem Wasser zu einem Gesamtvolumen von 1 l.
   HINWEIS: Aufgrund der Viskosität von Quadrol kann es vor der Konfiguration auf 60 °C erhitzt werden, um seine Fließfähigkeit zu erhöhen.
5. Entfettungslösung: 30 %, 50 %, 70 % tert-Butanol (tB) (siehe Materialtabelle), hergestellt mit Wasser nach Volumenanteil.
   HINWEIS: In Anbetracht der Tatsache, dass reines TB bei Raumtemperatur kristallin ist, muss es auf 60 °C erhitzt werden, bis es sich aufgelöst hat, bevor es verwendet werden kann. Anschließend werden 3 % bis 5 % (v/v) Triethanolamin (TEA) zugegeben, um den pH-Wert der Lösung >9,5 zu regulieren.
6. Dehydratisierungslösung: TB-PEG-Lösung, 70 % tB + 27 % PEG-MMA + 3 % Quadrol (v/v), wobei PEG-MMA Poly(ethylenglykol)methylethermethacrylat mit einem mittleren Molekulargewicht von 500 (Poly(ethylenglykol)methacrylat 500, PEG-MMA 500) ist (siehe Materialtabelle).
7. Transparente Lösung: BB-PEG-Lösung, 75 % BB + 22 % PEG-MMA + 3 % Quadrol (v/v), wobei BB Benzylbenzoat (BB) ist.

7. Transparenz von Schädelknochen mit der PEGASOS-Methode

1. Anästhesie der Maus durch intraperitoneale Injektion von Anästhetika (Schritt 2.1) und Beurteilung der Anästhesietiefe der Maus durch die Kneifreaktion, um sicherzustellen, dass es vor der kardialen Perfusion keine Resistenzreaktion gibt.
2. Führen Sie eine kardiale Perfusion und Fixierung durch.
   1. Halten Sie den Bauch der Maus nach oben, fixieren Sie die Gliedmaßen mit Klebeband und schneiden Sie vorsichtig entlang des Umfangs des Brustkorbs, um ihn vollständig freizulegen.
   2. Unmittelbar nach einem kleinen Schnitt im rechten Vorhof mit einer Augenschere eine Perfusionsnadel 22 G an der Spitze des linken Ventrikels einführen.
      HINWEIS: Es wird nur die Nadelspitze eingeführt, um eine Beschädigung der Herzklappe durch übermäßiges Einführen zu vermeiden. Andernfalls gelangt kardiale Perfusionsflüssigkeit in den Lungenkreislauf und beeinträchtigt die Perfusionswirkung des systemischen Kreislaufs.
   3. Schieben Sie die 30-50 ml kardiale Perfusionsflüssigkeit (Schritt 6.2) in die Spritze. Es ist zu sehen, dass die Leber allmählich von einem hellen Rot blass wird.
   4. Nachdem die ausströmende Flüssigkeit aus dem rechten Vorhof vollständig klar geworden ist, infundieren Sie 4%ige PFA-Lösung in gleichem Volumen. Der Betrieb der PFA-Perfusion erfolgt in einer belüfteten Haube.
   5. Sezieren und trennen Sie die Gewebe und Organe und fixieren Sie sie über Nacht mit 4% PFA bei 4 °C.
3. Gewebeentkalkung: Bei Proben, die durch EdU-Färbung verarbeitet wurden, wird das fixierte Hartgewebe etwa 2 Tage lang in eine 0,5 mol/l EDTA-Lösung (pH 7,0) (10 ml) auf einem Rütteltisch bei 37 °C gelegt und die Flüssigkeit täglich gewechselt.
   HINWEIS: Überspringen Sie den Entkalkungsprozess bei der normalisierten PEGASOS-Methode für Kalzium-Chelatbildner-markierte Knochen, um die Signalübertragung vollständig zu erhalten. Eine Entkalkung ist erforderlich, um die Knochen zu behandeln, um die endogene Fluoreszenz oder die immungefärbten Signale des gesamten Mounts sichtbar zu machen.
4. Gewebeentfärbung: Legen Sie die fixierten Schädelknochen 1 Tag lang in 25%ige Quadrollösung (20 ml) auf einen Rütteltisch bei 37 °C und wechseln Sie die Flüssigkeit einmal.
   HINWEIS: Die Entfärbungszeit hängt mit dem Hämgehalt im Gewebe zusammen. Beobachten Sie die Farbe der Behandlungsflüssigkeit, da die Farbtiefe die Notwendigkeit darstellt, die Flüssigkeitsersatzbehandlung fortzusetzen.
5. EdU-Färbung: Spülen Sie die Proben 5 Minuten lang (dreimal) in 1× PBS und tauchen Sie sie dann 1 Tag lang in den Markierungscocktail ein. Danach spülen Sie die Proben in 1× PBS für 1 h (dreimal).
6. Entfettung und Dehydrierung des Gewebes
   1. Die Gewebe werden nacheinander in Lösungen mit 30 % tB, 50 % tB und 70 % tB eingelegt, um die Gradientenabnahme auf einem Rütteltisch bei 37 °C durchzuführen. In jeder Konzentration für ca. 2 h geben.
   2. Anschließend werden die Proben in TB-PEG-Lösung für 6 h auf einem Rütteltisch bei 37 °C dehydriert.
      HINWEIS: Die oben genannte Verarbeitungszeit kann je nach Anzahl des Gewebes verlängert oder verkürzt werden.
7. Gewebetransparenz: Legen Sie das vollständig dehydrierte Gewebe in BB-PEG-Lösung auf einen Schütteltisch bei 37 °C (2-4 h), bis es transparent ist. Derzeit können Proben bis zu 1-2 Jahre gelagert werden.
   HINWEIS: Öffnen Sie nach fast vollständiger Reinigung den Röhrchendeckel, um die Proben und das Medium der Luft auszusetzen, indem Sie sie schütteln, um die Transparenz weiter zu verbessern. Diese Methode eignet sich, um die Transparenz einzelner Gewebe und Organe sowie des gesamten Kopfes und Körpers junger Mäuse zu verbessern. Für die Transparenz des gesamten Körpers erwachsener Mäuse sollten die oben genannten Schritte jedoch mit einer Perfusionsmethode über den gesamten Zyklus durchgeführt werden.

8. Bildgebung

HINWEIS: In dieser Studie wurde die konfokale Mikroskopie für die 3D-Visualisierung von transparentem Gewebe verwendet. Auch die Lichtblattmikroskopie ist für dieses Protokoll geeignet. Mehrere Betriebssysteme wurden bereits als verfügbar verifiziert. Hier wird ein konfokales Lasermikroskop-Betriebssystem als Beispiel genommen (siehe Materialtabelle).

1. Befolgen Sie gemäß dem Benutzerhandbuch die richtigen Schritte, um die konfokale Laser- und LAS-AF-Bedienoberfläche zu öffnen. Schalten Sie den gewünschten Laser in verschiedenen Aufnahmekanälen ein und passen Sie die Leistung an. Stellen Sie den Strahlengang und die entsprechende Wellenlänge ein, 561 nm für Alizarinrot und 488 nm für Calceingrün, die je nach Markierungscocktail für das EdU-Signal verwendet werden.
2. Legen Sie die transparenten Proben in die konkave Petrischale aus Glas, die dicke Proben, Einbettboxen oder selbstgebaute Platzierungsvorrichtungen wie wasserfesten Kleber aufnehmen kann, um die transparenten Proben in eine transparente Flüssigkeit zu tauchen.
3. Wählen Sie ein Objektiv mit geringem Stromverbrauch, um die Probe schnell zu lokalisieren. Verschaffen Sie sich mit der Schnellscanfunktion einen Überblick über das gesamte Schädeldachgewebe und finden Sie den gewünschten Bereich für die Bildgebung.
4. Stellen Sie die Ausgangsleistung ein, wählen Sie den Scanmodus und passen Sie zunächst die Aufnahmekoeffizienten (Auflösung, Scangeschwindigkeit, Zoomfaktor, Bildqualität, durchschnittliches Hintergrundrauschen usw.) an.
   HINWEIS: Im Allgemeinen reicht Smart Gain von 500 bis 800 (sowohl Signal- als auch Rauschänderung); Smart Offset ist so nah wie möglich an 0 und stellt gleichzeitig die Bildqualität sicher (um Hintergrundrauschen zu reduzieren). Wenn die PMT-Verstärkung höher als 800 oder die HyD-Verstärkung größer als 100 % ist und die Helligkeit immer noch unzureichend ist, kann die Laserintensität entsprechend erhöht werden, aber im Prinzip gilt: Je niedriger, desto besser.
5. Legen Sie den axialen Abstand Z-Bereich und den Z-Schritt fest, der von der flachsten Seite der transparenten Organisation aus aufgerissen wird. Das heißt, setze die tiefsten und flachsten Seiten.
   HINWEIS: Bestätigen Sie die Klassifizierung und den Arbeitsabstand für jedes Objektiv. Stellen Sie den Z-Bereich sorgfältig ein und überschreiten Sie nicht den Arbeitsabstand des ausgewählten Objektivs. Der "z-Galvo" kann gewählt werden, wenn eine Feinregulierung erforderlich ist.
6. Stellen Sie die Aufnahmeparameter erneut ein und beginnen Sie mit der Aufnahme. Nach Fertigstellung werden die Bilder über das Multifunktionsmodul zusammengeführt und verarbeitet. Zum Schluss lagern und schalten Sie das Gerät in der angegebenen Reihenfolge aus.

Ergebnisse

Mit Hilfe dieses Protokolls wurde ein Mausmodell für die sagittale Nahtexpansion etabliert (Abbildung 1-2). Für die 3-D-Visualisierung von Knochenmodellierungsveränderungen nach Nahtexpansion wurde die PEGASOS-Tissue-Clearing-Methode auf den gesamten Schädelknochen nach der Expansion angewendet. Nach der Perfusion wurden die Schädelknochen separiert (Abbildung 3A) und der entsprechende PEGASOS-Prozess fortgesetzt (T...

Diskussion

Wir wandten ein Standard-Nahtexpansions-Mausmodell an, um die regelmäßigen morphologischen Veränderungen zu beobachten, die jede Woche während des gesamten einmonatigen Remodellierungszyklus auftreten¹⁰. Dieses Modell ist nützlich für die Erforschung des Umbaus und der Regeneration des Schädelknochens durch die Erweiterung von Schädelknochennähten sowie für die Untersuchung verschiedener Nahtzellen in vivo. Um die Ergebnisse dieser Forschung vollständig darstellen zu können, i...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
37% Acid etching	Xihubiom	E10-02/1807011
Alizarin red	Sigma-Aldrich	A3882
AUSTRALIAN WIRE	A.J.WILCOCK	0.014''
Benzyl benzoate	Sigma-Aldrich	B6630
Calcein green	Sigma-Aldrich	C0875
Copper(II) sulfate, anhydrous	Sangon Biotech	A603008
Dynamometer	Sanliang	SF-10N
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
EdU	Invitrogen	E104152
Laser Confocal Microscope	Leica	SP8
PBS	Sangon Biotech	E607008
PEG-MMA 500	Sigma-Aldrich	447943
PFA	Sigma-Aldrich	P6148
pH Meters	Mettler Toledo	S220
Quadrol	Sigma-Aldrich	122262
Sodium Ascorbate	Sigma-Aldrich	A4034
Sodium bicarbonate	Sangon Biotech	A500873
Sodium chloride	Sangon Biotech	A610476
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Spring	TAOBAO	0.2*1.5*1*7
Sulfo-Cyanine3 azide	Lumiprobe	A1330
tert-Butanol	Sigma-Aldrich	360538	Protect from light. Do not freeze.
Transbond MIP Moisture Insensitive Primer	3M Unitek	712-025
Transbond XT Light Cure Adhesive Paste	3M Unitek	712-035
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	V900257
Tris-buffered saline	Sangon Biotech	A500027