Sütür Genişletme Fare Modelinde Kemiğin Yeniden Modellenmesi için 3 Boyutlu Görselleştirme Tekniği

Özet

Bu protokol, gerilme kuvveti yükü altında sütürün mekanobiyolojik değişikliklerini ve kemiğin yeniden şekillenmesini incelemek için standartlaştırılmış bir sütür genişletme fare modeli ve 3 boyutlu bir görselleştirme yöntemi sunar.

Özet

Kraniyofasiyal sütürler, kraniyofasiyal kemikleri birbirine bağlayan fibröz eklemler olmanın ötesinde çok önemli bir rol oynar; Ayrıca, mezenkimal kök hücreleri ve osteoprogenitörleri barındıran kalvarial ve fasiyal kemik büyümesi için birincil niş görevi görürler. Kraniyofasiyal kemiklerin çoğu intramembranöz kemikleşme yoluyla geliştiğinden, sütürlerin marjinal bölgeleri başlangıç noktaları olarak işlev görür. Bu önemi nedeniyle, bu sütürler yay destekli kraniyal tonoz genişletme, hızlı üst çene genişletme ve üst çene protraksiyonu gibi ortopedik tedavilerde ilgi çekici hedefler haline gelmiştir. Ortopedik izleme kuvveti altında, sütür kök hücreleri hızla aktive edilir ve genişleme sırasında kemiğin yeniden şekillenmesi için dinamik bir kaynak haline gelir. Önemlerine rağmen, kemiğin yeniden şekillenme dönemlerindeki fizyolojik değişiklikler tam olarak anlaşılamamıştır. Başta sagital yönde olmak üzere geleneksel kesit alma yöntemleri, tüm sütür boyunca meydana gelen kapsamlı değişiklikleri yakalamaz. Bu çalışmada sagital sütür genişletme için standart bir fare modeli oluşturulmuştur. Sütür genişletme sonrası kemik yeniden şekillenme değişikliklerini tam olarak görselleştirmek için, PEGASOS doku temizleme yöntemi, tam montajlı EdU boyama ve kalsiyum şelatlama çift etiketleme ile birleştirildi. Bu, genişlemeyi takiben tüm kalvarial kemikler boyunca yüksek oranda çoğalan hücrelerin ve yeni kemik oluşumunun görselleştirilmesine izin verdi. Bu protokol, standartlaştırılmış bir sütür genişletme fare modeli ve 3 boyutlu bir görselleştirme yöntemi sunarak, sütürlerdeki mekanobiyolojik değişikliklere ve gerilme kuvveti yükü altında kemiğin yeniden şekillenmesine ışık tutar.

Giriş

Kraniyofasiyal sütürler, kraniyofasiyal kemikleri birbirine bağlayan ve kraniyofasiyal kemiklerin büyümesinde ve yeniden şekillenmesinde önemli rol oynayan fibröz dokulardır. Sütürün yapısı bir nehri andırır ve intramembranöz osteogenez yoluyla kraniyofasiyal kemiklerin oluşumuna katkıda bulunan osteojenik cepheler olarak bilinen "nehir kıyısını" beslemek ve inşa etmek için bir hücre kaynağı akışı sağlar¹.

Kraniyofasiyal sütürlere olan ilgi, çocuklarda kraniyofasiyal deformitelere ve hatta hayatı tehdit eden durumlara yol açabilen kraniyal sütürlerin ve fasiyal sütür disfonksiyonunun erken kapanmasını anlamaya yönelik klinik ihtiyaçlardan kaynaklanmaktadır. Açık süturektomi klinik tedavide rutin olarak kullanılmaktadır, ancak uzun süreli takiplerde bazı hastalarda eksik re-ossifikasyon nüksü gösterilmiştir². Genleşme yayları veya endoskopik şerit kraniektomi ile desteklenen minimal invaziv kraniotomi, dokuları atmak yerine potansiyel sütürü korumak için daha güvenli bir yaklaşım sağlayabilir³. Benzer şekilde, yüz maskeleri ve genişletme cihazları gibi ortopedik tedaviler, sagital veya yatay maksiller hipoplaziyi tedavi etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır ve bazı çalışmalar, minivida destekli damak genişleticiler aracılığıyla yetişkin hastaları tedavi etmek için yaş sınırlamasını genişletmektedir ^4,5,6. Ek olarak, biyolojik olarak parçalanabilen materyallerle birleştirilmiş mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) ile kraniyal sütür rejenerasyonu, ilgili hastalıkların tedavisi için yeni bir yön sunan, gelecekte potansiyel bir tedavidir⁷. Bununla birlikte, sütürlerin işlev süreci veya düzenleyici mekanizması belirsizliğini korumaktadır.

Kemiğin yeniden şekillenmesi esas olarak, osteoblastlar tarafından yürütülen kemik oluşumu ile mekanik sinyallerle uyarılan kök hücrelerin osteojenik farklılaşmasının önemli bir rol oynadığı osteoklastlar tarafından yürütülen kemik rezorpsiyonu arasındaki dengeden oluşur. Onlarca yıl süren araştırmalardan sonra, kraniyofasiyal sütürlerin oldukça plastik mezenkimal kök hücre nişleri olduğu bulunmuştur⁸. Sütür kök hücreleri (SuSC'ler), mezenkimal kök hücrelere (MSC'ler) veya kemik kök hücrelerine (SSC'ler) ait heterojen bir kök hücre grubudur. SuSC'ler, Gli1, Axin2, Prrx1 ve Ctsk dahil olmak üzere dört belirteç ile in vivo olarak etiketlenir. Özellikle Gli1⁺ SuSC'ler, kök hücrelerin biyolojik özelliklerini kesin olarak doğrulamıştır, sadece tipik MSC belirteçlerinin yüksek ekspresyonunu sergilemekle kalmaz, aynı zamanda mükemmel osteojenik ve kondrojenik potansiyel^{gösterir 9}. Önceki araştırmalar, Gli1⁺ SuSC'lerin gerilme kuvveti altında yeni kemik oluşumuna aktif olarak katkıda bulunduğunu ve bunları distraksiyon osteogenezini destekleyen sütür kök hücre kaynağı olarak tanımladığını göstermiştir¹⁰.

Geçmişte, kök hücrelerin kapsamlı mekanik özellikleri Flexcell, dört noktalı bükme, mikro mıknatıs yükleme sistemi ve diğerleri aracılığıyla in vitro olarak incelenmiştir. Fare kraniyal sütür kaynaklı mezenkimal hücreler in vitro¹¹ olarak tanımlanmış ve insan sütür mezenkimal kök hücreleri de yakın zamanda izole edilmiş^{olsa da 12}, in vitro sistemde sütür hücrelerinin biyomekanik yanıtı belirsizliğini korumaktadır. Kemiğin yeniden şekillenme sürecini daha fazla araştırmak için, izole kalvaria organ kültürüne dayalı bir sütür genişletme modeli oluşturulmuştur ve bu da yararlı bir in vivo sütür genişletme modeli oluşturmanın yolunu açmıştır ^1,13. Tavşan¹⁴ ve sıçan¹⁵, sütür genişletme için temel araştırmalarda en yaygın kullanılan hayvanlar olmuştur. Bununla birlikte, fareler, insanlarla oldukça homolog genomları, çok sayıda gen modifikasyon hattı ve güçlü üreme hibridizasyon yetenekleri nedeniyle insan hastalıklarını araştırmak için tercih edilen hayvan modelleridir. Kraniyal sütür genişlemesinin mevcut fare modelleri, sagital sütüre gerilme kuvveti uygulamak için tipik olarak paslanmaz çelik ortodontik yay tellerine dayanır^16,17. Bu modellerde, genişleme cihazını sabitlemek için parietal kemiklerin her iki tarafında iki delik açılır ve teller cildin altına gömülür, bu da hücre aktivasyon modunu etkileyebilir.

Görselleştirme yöntemi ile ilgili olarak, dilimlerin sagital yönde iki boyutlu gözlemi genellikle onlarca yıldır benimsenmiştir. Bununla birlikte, kemiğin yeniden şekillenmesinin karmaşık üç boyutlu dinamik bir süreç olduğu göz önüne alındığında, eksiksiz üç boyutlu bilgi elde etmek acil bir ihtiyaç haline gelmiştir. Bu gereksinimi karşılamak için PEGASOS doku saydamlık tekniği ortaya çıkmıştır^18,19. Sert ve yumuşak dokuların şeffaflığı için benzersiz avantajlar sunarak, tüm kemik yeniden şekillenme sürecinin üç boyutlu uzayda yeniden üretilmesini sağlar.

Kemiğin yeniden şekillenme dönemlerindeki fizyolojik değişiklikler hakkında daha derin ve daha kapsamlı bir anlayış elde etmek için, el yapımı tutucular arasında yay ayarlı standart bir sagital sütür genişletme faresi modeli oluşturulmuştur¹⁰. Standartlaştırılmış bir asitle aşındırma ve yapıştırma prosedürü ile, genişletme cihazı kraniyal kemiğe sıkıca bağlanabilir ve sagital sütüre dik bir gerilme kuvveti oluşturabilir. Ayrıca, sütür genişletme sonrası kemik modelleme değişikliklerini tam olarak görselleştirmek için ekspansiyon sonrası mineralize kemiğin çift etiketlenmesinden sonra PEGASOS doku temizleme yöntemi uygulandı.

Protokol

Burada açıklanan tüm deneysel prosedürler, Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi, Şanghay Dokuzuncu Halk Hastanesi Hayvan Bakım Komitesi (SH9H-2023-A616-SB) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada 4 haftalık C57BL/6 erkek fareler kullanıldı. Kullanılan tüm aletler işlem öncesi sterilize edilmiştir.

1. Sütür genişletme modelinin hazırlanması

1. İki tutma tutucunun hazırlanması.
   1. Hafif tel pense ile sarmal bir halka yapmak için 0.014'' Avustralya teli veya paslanmaz çelik tel ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanın. Halkanın çapı 2 mm'dir ve iki tarafta 1 mm kuyruk ayrılmıştır (Şekil 1A).
   2. Ameliyat için telleri ve tutucuları bir otoklav, plazma sterilizatörü veya uygun soğuk sterilantta (örn. glutaraldehit) sterilize edin.
2. Yayların hazırlanması.
   1. Özelleştirilmiş paslanmaz çelik yaylar hazırlayın.
      NOT: Bu çalışmada 0,2 mm tel çapı, 1,5 mm dış çap, 1 mm aralık aralığı ve 7 mm uzunluğu olan baskı yayı kullanılmıştır (Şekil 1B). Her 1 mm'lik yay sıkıştırması, yaklaşık 30 g'lık bir itme kuvveti elde etti.
   2. Ayarlamadan önce yayı uygun bir uzunlukta kesin. Deneyden önce özel yay için kuvveti onaylayın.
      NOT: Paralel deneylerde kuvvet büyüklüğü aynı olduğu sürece yayların boyutları değişir. Kuvvet, bir masa üstü tek eksenli test cihazı veya durum sınırlıysa küçük bir elektronik dinamometre (Malzeme Tablosuna bakınız) ile ölçülür. Uzunluk değişimi kuvvet büyüklüğüne göre değerlendirilir (Şekil 1C-E). Özellikle, yay kuvveti yükleme değerini yaşa, farenin kemik durumuna ve araştırma nesnelerine göre değiştirmek gerekir.
   3. 7 mm uzunluğunda bir düz Avustralya teli veya düz çelik tel hazırlayın ve bariyer olarak kullanmak için 2 mm çapında iki parça kağıt yapın (Şekil 1F).

2. Sagital sütür genişletme ameliyatı

1. Anestezi: Fareleri tiletamin (25 mg/kg), zolazepam (25 mg/kg) ve Ksilazin (10 mg/kg) ile uyuşturun. Aynı zamanda, korneaların kurumasını önlemek için gözlere steril oftalmik merhem sürün. Farelerin anestezi derinliğini bir ayak parmağı tutamıyla değerlendirin.
   NOT: Aşağıdaki özellikler farenin uygun şekilde uyuşturulduğunu gösterir: yavaş ve sabit nefes alma, uzuvların zayıflığı, kas gevşemesi, cilt akupunktur refleksinin ve göz kapağı refleksinin kaybolması ve ayrıca daha zayıf kornea refleksi.
2. Kürk çıkarma ve dezenfeksiyon: Başın üstündeki kürkü tüy dökücü kremle dikkatlice çıkarın; Gözlere dokunmaktan kaçının. Kısa bir süre sonra, ameliyat bölgesini dezenfekte etmek için dönüşümlü iyodofor ve% 75 alkol kullanın. Deri altı enjeksiyonu ile farelere analjezi olarak meloksikam (1 mg / kg) uygulayın.
3. Vücut pozisyonu sabitleme: Fareyi öne yatırın ve uzuvları ameliyat masasına sabitlemek için cerrahi bantlar kullanın.
4. Açık kafa derisi flebi: Farenin boynuna yakın kafa derisi boyunca kavisli bir flep gerçekleştirmek için cerrahi makas kullanın, sagital sütürü ve çevresindeki kafatasını tamamen açığa çıkarın. Bundan sonra, kafa derisi flebini ameliyat masasına 6-0 dikişle sabitleyin.
5. Asitle aşındırmadan sonra tutma tutucuları yapıştırın.
   1. Kafatasını kurutun ve 20 saniye boyunca %37 fosforik asitle aşındırın ve asit aşındırmasını temizlemek için normal salin kullanın (Şekil 2A). Kafatasını kauçuk pipet ampulü ile kuruttuktan sonra kireçli bir kalıntı ortaya çıkacaktır.
   2. Parietal kemiklerin her iki tarafındaki iki tutucuyu (adım 1.1'de hazırlanan) sagital sütürlerden 3 mm uzakta ışıkla sertleşen bir yapıştırıcı ile yapıştırın (Şekil 2B).
6. Kafa derisi kapağını sıfırlayın.
   1. Kafa derisi flebini manuel olarak geri yerleştirin (Şekil 2C). Tutucuların pozisyonunu etiketleyin, kafa derisinde iki taraflı tutma tutucuların karşılık gelen pozisyonunda iki küçük delik açın ve ardından çırpılmış kafa derisini sıfırlayın.
   2. Aynı zamanda, cildin yüzeyini ortaya çıkarmak için küçük halkaları deliklerden geçirin. Kavisli insizyonu 6-0 sütür ile dikin (Şekil 2D). Cildin iyileşmesi için bir ila üç gün izin verilir. 1 ila 3 gün boyunca her 24 saatte bir deri altı enjeksiyonla farelere meloksikam (1 mg / kg) uygulayın.
      NOT: Ameliyattan sonra, fare kafa derisinin aktivitesini ve tutucuların düşüp düşmediğini günlük olarak kontrol edin. Renk ve kalınlık konusunda çeşitli cilt tipleri vardır; Sağlıklı cilt derisi orijinal rengini koruyacak ve cilt kenarları dikildikten sonra yavaş yavaş birbirine kaynaşacaktır. Kafa derisinde bir enfeksiyon bulunursa veya cerrahi cihaz düşmüşse, fareyi çalışmadan çıkarın ve ötenazi yapın.
7. Yayı ve kılavuz teli takın.
   1. Yayı iki tutucu arasındaki mesafeden 1 mm daha uzun kesin.
   2. Seçilen baskı yayını sıkıştırın ve her iki taraftaki küçük bobinlerin arasına yerleştirin.
   3. Paslanmaz çelik teli küçük bobinlerden ve yaydan geçirin ve yaklaşık 30 g'lık bir başlangıç itme kuvveti elde etmek için yayı serbest bırakın.
   4. Farenin yay alanının altındaki kafa derisinin herhangi bir sıkıştırma olmadığını kontrol edin.
   5. Yapıştırmanın herhangi bir gevşeklik olmadan sağlam olduğunu onayladıktan sonra, yayın her iki ucunda bariyerler oluşturmak için yay ile tutucular arasına iki kağıt parçasını ışıkla sertleşen bir yapıştırıcı ile yapıştırın (Şekil 2E,F).

3. Mineralize kemiklerin çift etiketlenmesi

1. Stok çözeltisinin hazırlanması.
   1. % 0.9 NaCl ve% 2 NaHCO₃ içeren damıtılmış su ile bir seyreltme çözeltisi hazırlayın.
   2. 20 mg / mL Alizarin kompleks dihidrat ve 10 mg / mL Calcein hazırlamak için seyreltici çözeltiyi kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız).
   3. Bir pH ölçüm cihazı kullanarak pH'ı 7.4'e ayarlayın. Doğru okumalar sağlamak için ölçümler arasında pH probunu yıkayın.
   4. Boyayı steril bir kaba koyun ve buzdolabında 4 °C'de saklayın; Işığı dışarıda tutmak için folyo kullanılır.
2. Çalışma çözümünü hazırlayın. Enjeksiyondan önce, stok çözeltisini bir çözünme çözeltisi kullanarak kalsiyum için 1 mg / mL ve Alizarin kompleks dihidrat için 2 mg / mL'ye seyreltin.
3. İntraperitoral olarak 5 mg / kg Calcein yeşili ve 20 mg / kg Alizarin kırmızısını mineralize kemikleri etiketlemek ve iki zaman arasındaki değişiklikleri analiz etmek için iki zaman noktasına enjekte edin. Genel olarak, numuneleri enjeksiyondan 12-14 saat sonra toplayın.
   NOT: Enjeksiyondan önce boyaları ısıtın ve enjeksiyon süresinin 3 dakikadan az olmamasına dikkat edin. Enjeksiyon aralığı genişleme zamanına bağlıdır. Bu çalışmada, Alizarin kırmızısı ve Calcein yeşili, sırasıyla genişletmeden önce gece boyunca (O/N) ve toplamadan önce O/N enjekte edildi.
4. İkinci enjeksiyondan bir gün sonra doku temizleme işlemi için hazırlanan tüm kalvarial kemikleri toplayın.

4. EdU boyama

1. İntraperitoneal enjeksiyon: Farelere ötenazi yapmadan 2 saat önce intraperitoneal olarak EdU enjekte edin (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek). Doz 1 mg / 10 g vücut ağırlığıdır.
2. Etiketleme kokteyli hazırlama: Tris-tamponlu salin (100 mmol/L final, pH 7.6),_CuS04 (4 mmol/L final), Sülfo-Siyanin 3 Azid (2-5 μmol/L final) ve Sodyum Askorbat (100 mmol/L final, her kullanımda taze yapılır) karıştırın (bkz.
3. EdU tam montajlı boyama: PEGASOS doku temizleme yönteminde doku renk giderme adımından sonra (7. adım), numuneleri oda sıcaklığında (RT) 1 gün boyunca etiketleme kokteyline koyun.

5. Mikro bilgisayarlı tomografi görüntüleme

1. Doku fiksasyonu ve saklanması: Kalvarial kemikleri 4 °C O/N'de %4 paraformaldehit (PFA) içinde sabitleyin ve taramadan önce %0,5 PFA'da saklayın.
2. Tarama ve analiz: Numuneleri yüksek çözünürlüklü ve 7 μm voksel boyutuna sahip bir mikro bilgisayarlı tomografi (μCT) görüntüleme sistemi ile tarayın.

6. PEGASOS doku temizliği için çalışma solüsyonunun hazırlanması

1. %4 poliformaldehit (PFA): 4 g PFA tozunu 1× PBS ila 100 mL'de çözün.
2. Kardiyak perfüzyon çözeltisi:% 0.02 Heparin, yani 1× PBS ila 100 mL içinde çözülmüş 20 mg heparin tozu; alternatif olarak, 0,05 mol/L EDTA, yani 0,05 mol etilen diamin tetraasetik asit (EDTA) kullanın (bkz. Malzeme Tablosu), deiyonize sulu bir çözelti içinde toplam hacmi 1 L'ye kadar çözülür.
3. Dekalsifikasyon çözeltisi: 0,5 mol/L EDTA, yani 0,5 mol etilen diamin tetraasetik asit (EDTA), deiyonize sulu bir çözelti içinde toplam 1 L hacme kadar çözülür.
4. Renk giderme çözeltisi: Deiyonize suda toplam hacmi 1 L'ye kadar çözülmüş 250 mL Quadrol (N, N, N', N' - Tetrakis (2-Hidroksipropil) etilendiamin) olan %25 Quadrol.
   NOT: Quadrol'ün viskozitesi nedeniyle, konfigürasyondan önce akışkanlığını artırmak için 60 °C'ye kadar ısıtılabilir.
5. Yağ alma çözeltisi: %30, %50, %70 tert-Bütanol (tB) (bkz. Malzeme Tablosu), hacimce su fraksiyonu ile hazırlanır.
   NOT: Saf tB'nin oda sıcaklığında kristal olduğu göz önüne alındığında, kullanılmadan önce çözünene kadar 60 °C'ye ısıtılmalıdır. Daha sonra, çözeltinin pH'ını düzenlemek için %3 ila %5 (h/h) trietanolamin (TEA) eklenir >9.5.
6. Dehidrasyon çözeltisi: TB-PEG çözeltisi, %70 tB + %27 PEG-MMA + %3 Quadrol (h/h), burada PEG-MMA, ortalama moleküler ağırlığı 500 olan poli (etilen glikol) metil eter metakrilattır (Poli (etilen glikol) Metakrilat 500, PEG-MMA 500) (bkz.
7. Şeffaf çözelti: BB-PEG çözeltisi, %75 BB + %22 PEG-MMA + %3 Quadrol (h/h), burada BB benzil benzoattır (BB).

7. PEGASOS yöntemi ile kalvarial kemiklerin şeffaflaştırılması

1. Fareyi intraperitoneal anestezik enjeksiyonu ile uyuşturun (adım 2.1) ve kardiyak perfüzyondan önce direnç reaksiyonu olmadığından emin olmak için farenin anestezi derinliğini çimdikleme reaksiyonu boyunca değerlendirin.
2. Kardiyak perfüzyon ve fiksasyon gerçekleştirin.
   1. Farenin karnını yukarı doğru tutun, uzuvları yapışkan bantla sabitleyin ve tamamen ortaya çıkarmak için göğüs kafesinin çevresi boyunca dikkatlice kesin.
   2. Oftalmik makasla sağ atriyumda küçük bir kesi yaptıktan hemen sonra, sol ventrikülün tepesine bir perfüzyon 22 G iğnesi yerleştirin.
      NOT: Aşırı yerleştirme yoluyla kalp kapakçığına zarar vermemek için sadece iğne ucu sokulur. Aksi takdirde, kardiyak perfüzyon sıvısı pulmoner dolaşıma girecek ve sistemik dolaşımın perfüzyon etkisini etkileyecektir.
   3. 30-50 mL kardiyak perfüzyon sıvısını (adım 6.2) şırıngaya itin. Karaciğerin yavaş yavaş parlak kırmızıdan soluklaştığı görülebilir.
   4. Sağ atriyumdan çıkış sıvısı tamamen berraklaştıktan sonra, eşit hacimde% 4 PFA çözeltisi infüze edin. PFA perfüzyonunun çalışması havalandırmalı bir davlumbazda gerçekleştirilir.
   5. Dokuları ve organları parçalara ayırın ve ayırın ve gece boyunca 4 °C'de% 4 PFA ile sabitleyin.
3. Doku dekalsifikasyonu: EdU boyama ile işlenen numuneler için, sabit sert dokuyu yaklaşık 2 gün boyunca 37 °C'de bir çalkalama masasına 0,5 mol/L EDTA (pH 7.0) çözeltisine (10 mL) koyun ve sıvıyı günlük olarak değiştirin.
   NOT: Sinyali tam olarak korumak için kalsiyum şelatlama maddesi etiketli kemikler için normalleştirilmiş PEGASOS yönteminde dekalsifikasyon işlemini atlayın. Endojen floresan veya tam montajlı immün boyalı sinyalleri görselleştirmek için kemikleri tedavi etmek için dekalsifikasyon gereklidir.
4. Doku renk giderme: Sabit calvarial kemikleri 1 gün boyunca 37 ° C'de bir çalkalama masasına %25 Quadrol solüsyonuna (20 mL) yerleştirin ve sıvıyı bir kez değiştirin.
   NOT: Renk açma süresi, dokudaki hem içeriği ile ilgilidir. Tedavi sıvısının rengini gözlemleyin, çünkü rengin derinliği sıvı replasman tedavisine devam etme ihtiyacını temsil eder.
5. EdU boyama: Numuneleri 1× PBS'de 5 dakika (üç kez) durulayın ve ardından 1 gün boyunca etiketleme kokteyline daldırın. Bundan sonra, numuneleri 1 saat (üç kez) boyunca 1× PBS'de durulayın.
6. Doku yağdan arındırma ve dehidrasyon
   1. Dokuları sırayla %30 tB, %50 tB ve %70 tB solüsyonlarına yerleştirerek 37 °C'de bir çalkalama masasında gradyan azaltma işlemi gerçekleştirin. Her konsantrasyonda yaklaşık 2 saat bekletin.
   2. Daha sonra, numuneleri 37 ° C'de bir çalkalama masasında 6 saat boyunca TB-PEG çözeltisi içinde kurutun.
      NOT: Yukarıdaki işlem süresi, doku sayısına bağlı olarak artırılabilir veya azaltılabilir.
7. Doku şeffaflığı: Tamamen susuz kalmış dokuyu BB-PEG solüsyonunda şeffaf olana kadar 37 ° C'de (2-4 saat) bir çalkalama masasına yerleştirin. Şu anda, numuneler 1-2 yıla kadar saklanabilir.
   NOT: Neredeyse tamamen temizlendikten sonra, numuneleri ve ortamı çalkalama ile havaya maruz bırakmak için tüp kapağını açın, şeffaflığı daha da artıracaktır. Bu yöntem, tek tek doku ve organların yanı sıra genç farelerin tüm baş ve vücudunun şeffaflığını artırmak için uygundur. Bununla birlikte, yetişkin farelerin tüm vücudunun şeffaflığı için, yukarıdaki adımlar tam döngülü bir perfüzyon yöntemi kullanılarak gerçekleştirilmelidir.

8. Görüntüleme

NOT: Bu çalışmada saydam dokuların 3 boyutlu görüntülenmesi için konfokal mikroskopi kullanılmıştır. Işık tabakası mikroskobu da bu protokol için uygundur. Daha önce birkaç işletim sisteminin kullanılabilir olduğu doğrulanmıştır. Burada, bir lazer konfokal mikroskop işletim sistemi örnek olarak alınmıştır (bkz.

1. Kullanım kılavuzuna göre, lazer konfokal ve LAS AF çalışma arayüzünü açmak için doğru adımları izleyin. Gerekli lazeri farklı çekim kanallarında açın ve gücü ayarlayın. Optik yolu ve karşılık gelen dalga boyunu, Alizarin kırmızısı için 561 nm ve Calcein yeşili için 488 nm'yi ayarlayın, bunlardan herhangi biri etiketleme kokteyline göre EdU sinyali için kullanılır.
2. Şeffaf numuneleri, şeffaf numuneleri şeffaf bir sıvıya daldırmak için kalın numuneleri, gömme kutularını veya su geçirmez yapıştırıcı gibi kendi kendine yapılan yerleştirme cihazlarını taşıyabilen içbükey cam Petri kabına yerleştirin.
3. Numuneyi hızlı bir şekilde bulmak için düşük güçlü bir objektif lensi seçin. Hızlı tarama fonksiyonu ile tüm kalvarial dokuya genel bir bakış yapın ve görüntüleme için ilgi alanını bulun.
4. Çıkış gücünü ayarlayın, tarama modunu seçin ve önce çekim katsayılarını ayarlayın (çözünürlük, tarama hızı, yakınlaştırma faktörü, görüntü kalitesi, ortalama arka plan gürültüsü vb.).
   NOT: Genel olarak, Akıllı Kazanç 500 ila 800 arasında değişir (hem sinyal hem de gürültü değişimi); Akıllı Ofset, görüntü kalitesini sağlarken (arka plan gürültüsünü azaltmak için) mümkün olduğunca 0'a yakındır. PMT kazancı 800'den yüksek olduğunda veya HyD kazancı %100'den büyük olduğunda ve parlaklık hala yetersiz olduğunda, lazer yoğunluğu uygun şekilde artırılabilir, ancak prensip olarak ne kadar düşükse o kadar iyidir.
5. Şeffaf organizasyonun en sığ tarafından delinen eksenel mesafe Z aralığını ve Z adımını ayarlayın; yani, en derin ve en sığ tarafları ayarlayın.
   NOT: Her lens için sınıflandırmayı ve çalışma mesafesini onaylayın. Z aralığını dikkatlice ayarlayın ve çalışma mesafesini seçilen lensin sınırını aşacak şekilde çalıştırmayın. İnce düzenleme gerektiğinde "z-Galvo" seçilebilir.
6. Çekim parametrelerini tekrar ayarlayın ve çekime başlayın. Tamamlandıktan sonra, görüntüleri çok işlevli modül aracılığıyla birleştirin ve işleyin. Son olarak, cihazı belirtilen sırayla saklayın ve kapatın.

Sonuçlar

Bu protokol kullanılarak sagital sütür genişletme için bir fare modeli oluşturulmuştur (Şekil 1-2). Sütür genişletme sonrası kemik modelleme değişikliklerinin 3 boyutlu görüntülenmesi için, genişletmeyi takiben tüm kalvarial kemiklere PEGASOS doku temizleme yöntemi uygulandı. Perfüzyon sonrası kalvarial kemikler ayrıldı (Şekil 3A) ve uygun PEGASOS işlemine devam edildi (Tablo 1 ve

Tartışmalar

Bir ay süren yeniden modelleme döngüsü¹⁰ boyunca her hafta meydana gelen düzenli morfolojik değişiklikleri gözlemlemek için standart bir sütür genişletme faresi modeli uyguladık. Bu model, kalvarial sütürleri genişleterek kalvarial kemik yeniden şekillenmesi ve rejenerasyonunu araştırmak ve ayrıca çeşitli sütür hücrelerini in vivo incelemek için kullanışlıdır. Bu tür araştırmaların sonuçlarını tam olarak sunmak için, boyanmış dokuların üç boyutlu...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
37% Acid etching	Xihubiom	E10-02/1807011
Alizarin red	Sigma-Aldrich	A3882
AUSTRALIAN WIRE	A.J.WILCOCK	0.014''
Benzyl benzoate	Sigma-Aldrich	B6630
Calcein green	Sigma-Aldrich	C0875
Copper(II) sulfate, anhydrous	Sangon Biotech	A603008
Dynamometer	Sanliang	SF-10N
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
EdU	Invitrogen	E104152
Laser Confocal Microscope	Leica	SP8
PBS	Sangon Biotech	E607008
PEG-MMA 500	Sigma-Aldrich	447943
PFA	Sigma-Aldrich	P6148
pH Meters	Mettler Toledo	S220
Quadrol	Sigma-Aldrich	122262
Sodium Ascorbate	Sigma-Aldrich	A4034
Sodium bicarbonate	Sangon Biotech	A500873
Sodium chloride	Sangon Biotech	A610476
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Spring	TAOBAO	0.2*1.5*1*7
Sulfo-Cyanine3 azide	Lumiprobe	A1330
tert-Butanol	Sigma-Aldrich	360538	Protect from light. Do not freeze.
Transbond MIP Moisture Insensitive Primer	3M Unitek	712-025
Transbond XT Light Cure Adhesive Paste	3M Unitek	712-035
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	V900257
Tris-buffered saline	Sangon Biotech	A500027