縫合糸拡張マウスモデルにおける骨リモデリングのための3次元可視化技術

要約

このプロトコルは、標準化された縫合糸拡張マウスモデルと3D視覚化方法を示し、引張力負荷下での縫合糸の機械生物学的変化と骨のリモデリングを研究します。

要約

頭蓋顔面縫合糸は、頭蓋顔面骨をつなぐ線維性関節であるだけでなく、重要な役割を果たします。また、頭蓋骨や顔面骨の成長のための主要なニッチとして機能し、間葉系幹細胞や骨前駆細胞を収容しています。ほとんどの頭蓋顔面骨は膜内骨化によって発達するため、縫合糸の辺縁領域が開始点として機能します。この重要性から、これらの縫合糸は、バネによる頭蓋骨丸天井の拡張、急速な上顎の拡張、上顎の伸展などの整形外科治療において興味深い標的となっています。整形外科のトレース力の下で、縫合糸幹細胞は急速に活性化され、拡張中の骨リモデリングの動的なソースになります。その重要性にもかかわらず、骨リモデリング期間中の生理学的変化は十分に理解されていないままです。従来の切片作成法は、主に矢状方向では、縫合糸全体で発生する包括的な変化を捉えることができません。この研究は、矢状縫合糸拡張の標準的なマウスモデルを確立しました。縫合糸拡張後の骨リモデリングの変化を完全に可視化するために、PEGASOS組織透明化法をホールマウントEdU染色およびカルシウムキレート二重標識と組み合わせました。これにより、高度に増殖する細胞と、拡張後の頭蓋骨全体にわたる新しい骨形成を可視化することができました。このプロトコルは、標準化された縫合糸拡張マウスモデルと3D可視化法を提供し、引張力負荷下での縫合糸と骨リモデリングの機械生物学的変化に光を当てます。

概要

頭蓋顔面縫合糸は、頭蓋顔面骨をつなぐ線維組織であり、頭蓋顔面骨の成長とリモデリングに重要な役割を果たします。縫合糸の構造は川に似ており、膜内骨形成を介して頭蓋顔面骨の形成に寄与する骨形成前線として知られる「川岸」に栄養を与えて構築するための細胞資源の流れ^{を提供します1。}

頭蓋顔面縫合糸への関心は、頭蓋縫合糸の早期閉鎖と顔面縫合機能障害を理解したいという臨床的ニーズによって推進されてきました。開腹縫合糸切除術は臨床治療で日常的に使用されていますが、長期追跡により、一部の患者で不完全な再骨化の再発が示されています²。拡張スプリングまたは内視鏡的ストライプ頭蓋切除術による低侵襲開頭術は、組織を廃棄するよりも、潜在的な縫合糸を保存するためのより安全なアプローチを提供する^{可能性があります3。}同様に、フェイスマスクや拡張器具などの整形外科的治療は、矢状または水平上顎形成不全の治療に広く使用されており、いくつかの研究では、年齢制限を延長して、ミニスクリュー支援口蓋エキスパンダーを介して成人患者を治療しています^4,5,6

プロトコル

ここで説明するすべての実験手順は、上海交通大学医学部上海第九人民病院の動物管理委員会によって承認されました(SH9H-2023-A616-SB)。この研究では、4週齢のC57BL/6雄マウスを使用しました。使用した器具はすべて、手順の前に滅菌されました。

1. 縫合糸拡張モデルの準備

1. 2つの保持ホルダーの準備。
   1. 0.014インチのオーストラリア線またはステンレス鋼線( 材料表を参照)を使用して、ライトワイヤープライヤーでらせん状のループを作成します。ループの直径は2mmで、1mmのテールが両側に確保されています(図1A)。
   2. 手術用のワイヤーとホルダーをオートクレーブ、プラズマ滅菌器、または適切な低温滅菌剤(グルタルアルデヒドなど)で滅菌します。
2. スプリングの準備。
   1. カスタマイズされたステンレス鋼のばねを準備します。
      注:この研究では、線径0.2 mm、外径1.5 mm、間隔1 mm、長さ7 mmの圧力スプリングを使用します(図1B)。1mmのスプリング圧縮ごとに、約30gの推力が得られました。
   2. セットする前に、スプリングを利用可能な長さにカットします。....

ディスカッション

標準的な縫合糸拡張マウスモデルを適用して、1ヶ月のリモデリングサイクル全体を通して毎週起こる規則的な形態学的変化を観察した¹⁰。このモデルは、頭蓋骨縫合糸の拡張による頭蓋骨のリモデリングや再生の研究や、生体内の様々な縫合細胞の研究に有用です。このような研究成果を十分に提示するためには、染色された組織の3次元可視化が必要です。したがっ.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
37% Acid etching	Xihubiom	E10-02/1807011
Alizarin red	Sigma-Aldrich	A3882
AUSTRALIAN WIRE	A.J.WILCOCK	0.014''
Benzyl benzoate	Sigma-Aldrich	B6630
Calcein green	Sigma-Aldrich	C0875
Copper(II) sulfate, anhydrous	Sangon Biotech	A603008
Dynamometer	Sanliang	SF-10N
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
EdU	Invitrogen	E104152
Laser Confocal Microscope	Leica	SP8
PBS	Sangon Biotech	E607008
PEG-MMA 500	Sigma-Aldrich	447943
PFA	Sigma-Aldrich	P6148
pH Meters	Mettler Toledo	S220
Quadrol	Sigma-Aldrich	122262
Sodium Ascorbate	Sigma-Aldrich	A4034
Sodium bicarbonate	Sangon Biotech	A500873
Sodium chloride	Sangon Biotech	A610476
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Spring	TAOBAO	0.2*1.5*1*7
Sulfo-Cyanine3 azide	Lumiprobe	A1330
tert-Butanol	Sigma-Aldrich	360538	Protect from light. Do not freeze.
Transbond MIP Moisture Insensitive Primer	3M Unitek	712-025
Transbond XT Light Cure Adhesive Paste	3M Unitek	712-035
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	V900257
Tris-buffered saline	Sangon Biotech	A500027